Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 z dne 30. maja 2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) (Besedilo velja za EGP)

In forceVersion 2008-05-30from 2008-06-01

Grade B

mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.

Ask Gelex about this law

Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/sl

Contents

Preamble
ANNEX
A.1
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.4
1.5 TABELA: UPORABNOST METOD A. B. C. D.
1.6
1.6.1
1.6.1.1
1.6.1.2 Aparatura:
1.6.2
1.6.4
4.(1)(2)(3)(4)
A.2
1.
1.4
1.5 Tabela 1 Primerjava metod
1.6
1.6.4
Slika l
1.6.6
2. Tabela 2 Temperatura – korekcijski faktorji fT
A.3
1.
1.4
1.4.1
3. Tabela 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.21.4.31.4.4 Uporabnost metod
3. Tabela 1.4.1.11.4.1.2 Uporabnost metod
3. Tabela 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.2 Uporabnost metod
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)
A.4
1.
1.4
1.5 Tabela 1.4.11.4.21.4.31.4.41.4.51.4.61.4.7 Merila kakovosti
1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.2.2
1.6.4
1.6.4.2
1.6.5
1.6.6
1.6.6.1 Inertni plin:
1.6.6.2 Priprava saturacijske kolone:
1.6.7
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)
A.5
1.
1.6
1.6.4
1.6.4.1
1.6.4.1.3 Slika Merilno telo
1.6.4.2
1.6.4.2.2 Postavitev:
2. Tabela Popravljanje izmerjene površinske napetosti Le za vodne raztopine, ρ = 1 g/cm3
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.6
1.
1.4
1.5
1.6
1.6.3
1.6.3.2 Preskusni postopek:
1.6.3.3 Aparatura
1.6.3.4 Aparatura (glej sliki 4 in 3)
1.6.4
2.
3.
A.8
1.
1.3 Metoda stresanja bučke
1.4
1.5
1.5.1 Metoda stresanja bučke
1.5.2 Metoda stresanja bučke
1.5.3 Metoda stresanja bučke
1.6
1.6.2
1.6.2.1
1.6.2.3
1.6.3
1.6.3.1 Aparatura
1.6.3.2 Izračun mrtvega časa to
2. Metoda stresanja bučke
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)
A.9
1.
1.5
1.6
1.6.3
1.6.3.2. Aparatura Abel:
A.10
1.
1.6
1.6.2
3.
A.11
1.
1.6
A.12
1.
1.3
1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.3
1.6.4
A.13
1.
1.6
1.6.2
2.
A.14
1.
1.1
1.4
1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.2.2
1.6.3
1.6.3.2
3.
4.(1)(2)(3)(4)
A.15
1.
1.6
A.16
1.
1.6
1.6.1
4.
Slika 1 Vzorec za 20 mm-preskusno kocko
Slika 2 Značilna krivulja temperatura/čas
A.17
1.
1.6
1.6.1
1.6.2
3.
3.2
A.18
1.
1.6
2.
2.2
3.(1)(2)(3)(4)
A.19
1.
1.6
2.
2.2
3.(1)(2)(3)(4)
A.20
1.
1.5
1.5.4
2.
3.
3.1
A.21
1.
1.6
1.6.1
1.6.1.2
2.
2.1 Tabela 1 Primer rezultatov
3.
3.2
4.(1)
Slika 1 Tlačna posoda
Slika 2 Podporni podest
Slika 3 Sistem vžiga
1.
2.
4.
1.2 Za trdne snovi
Dodatek 1 Ocenjevalna metoda
UVOD
OCENJEVALNA METODA
RAČUNSKI POSTOPEK
POROČILO
LITERATURA
Dodatek 2
Slika 1 Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po dinamični metodi
Slika 2a Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po statični metodi (z uporabo manometra z U-cevko)
Slika 2b Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po statični metodi (z uporabo indikatorja tlaka)
Slika 3 Izoteniskop (glej vir 7)
Slika 4 Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po metodi s parnotlačno tehtnico
Slika 5 Primer aparature za uparjanje pri nizkem tlaku z efuzijsko celico z volumnom 8 cm3
Slika 6a Primer pretočnega sistema za določanje parnega tlaka z metodo nasičenega plina
Slika 6b Primer sistema za določanje parnega tlaka z metodo nasičenega plina, pri katerem je za saturacijsko kolono postavjena kapilara
Slika 7 Primer postavitve preskusa za rotorsko metodo
Slika 8 Primer vrtečega rotorskega merilnika
Slika 1 Metoda z izpiranjem kolone z recirkulacijsko črpalko
Slika 2 Značilna mikrokolona
Slika 3 Značilna mikrokolona
Slika 4 Metoda z izpiranjem kolone z nivojsko posodo
RAČUNSKE METODE Princip računskih metod
Hanschova p-metoda
Rekkerjeva metoda
Hansch-Leova metoda
Kombinirana metoda
Slika Kalup in pripomočki za pripravo kupčka
Slika Aparatura
Primer specifikacije materiala za preskus toplotne občutljivosti (glej DIN 1623) (1)(2)(3)
Slika 1 Aparatura za toplotno občutljivost
Slika 2 Preskus toplotne občutljivosti
Slika 3 Umeritev hitrosti segrevanja pri preskusu toplotne občutljivosti
Slika 4 Aparatura za udarni preskus
Slika 5 Aparatura za občutljivost za trenje
1.1.11.21.31.4
3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)
DEL B METODE ZA DOLOČANJE TOKSIČNOSTI IN DRUGIH UČINKOV NA ZDRAVJE
SPLOŠNI UVOD A.
B.1 bis.
1.
1.4
1.5
1.5.3
1.6
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)
B.1 tris.
1.
1.4
1.5
1.6
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)
B.2
1.
1.6
1.6.2
1.6.3
3.
3.1
B.3
1.
1.6
1.6.2
1.6.3 Ocena strupenosti pri drugem spolu
3.
B.4
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)
Tabela I Nastanek rdečine in krast Tvorba kožnih oteklin UVRŠČANJE KOŽNIH REAKCIJ V STOPNJE
B.5
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.2.3
1.4.2.7
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)
Tabela I RAZVRŠČANJE OČESNIH LEZIJ V STOPNJE
Roženica
Šarenica
Očesne veznice
Kemoterapija
B.6
1.
1.5
1.5.1
1.5.1.2
1.5.1.3
1.5.2
1.5.2.2
1.5.2.3
3.
Poročilo o preskusu (GPMT in Buehlerjev preskus)
B.7
1.
1.4
1.4.2
1.4.3
3.
POROČILO O PRESKUSU
B.8
1.
1.6
1.6.2
1.6.3
3.
3.1
pt_2
B.9
1.
1.6
1.6.2
1.6.3
3.
B.10
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.3
2.
3.
POROČILO O PRESKUSU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)
B.11
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.5
2.
3.
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)
B.12
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.5
1.5.2
2.
3.
POROČILO O PRESKUSU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)
B.13/14
1.
1.5
1.5.1
1.5.2
2.
3.
POROČILO O PRESKUSU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)
B.15
1.
1.6 Priprave
Metabolna aktivacija
Preskusni sevi
Gojišča
Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol
Koncentracije izpostavljenosti
Inkubacijski pogoji
Frekvence spontanih mutacij
Število dvojnikov
3.
B.16
1.
1.6 Priprave
Metabolna aktivacija
Preskusni sevi
Gojišča
Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol
Koncentracije izpostavljenosti
Inkubacijski pogoji
Frekvence spontane mitotične rekombinacije
Število dvojnikov
3.
B.17
1.
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.3
2.
3.
POROČILO O PRESKUSU
4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)
B.18
1.
1.6 Priprave
Število kultur
Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol
Koncentracije izpostavljenosti
Celice
Metabolna aktivacija
Priprava kultur
Tretiranje kultur s preskusno snovjo Primarni podganji hepatociti
Avtoradiografske določitve
Določitve s tekočinskim scintilacijskim štetjem
2.
3.
B.19
1.
1.6 Preskusni pogoji
Število kultur
Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol
Koncentracije izpostavljenosti
Priprava kultur
Tretiranje
Spravilo celic
Priprava in obarvanje kromosomov
Analiza
3.
B.20
1.
1.6 Priprave
Zaloge
Preskusna snov
Število živali
Način dajanja
Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol
Stopnje izpostavljenosti
3.
B.21
1.
1.6 Priprave
Celice
Gojišče
Preskusna snov
Metabolna aktivacija
Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol
Koncentracije izpostavljenosti
3.
B.22
1.
1.6 Priprave
Način dajanja
Preskusne živali
Število in spol
Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol
Velikosti odmerka
Mejni preskus

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH), o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije ter spremembi Direktive 1999/45/ES ter razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES ter zlasti člena 13(3) Uredbe,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) V skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 je treba testne metode sprejeti na ravni Skupnosti za namene testiranja snovi, kadar so takšni testi potrebni za pridobitev informacij o bistvenih lastnostih snovi.

(2) Direktiva Sveta 67/548/EGS z dne 27. junija 1967 o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi je v Prilogi V določila metode za ugotavljanje fizikalno-kemijskih lastnosti, toksičnosti in ekotoksičnosti snovi in pripravkov. Priloga V Direktive 67/548/EGS je bila črtana z Direktivo 2006/121/ES Evropskega parlamenta in Sveta z učinkom od 1. junija 2008.

(3) Testne metode iz Priloge V k Direktivi 67/548/EGS je treba vključiti v to uredbo.

(4) Ta uredba ne izključuje uporabe drugih testnih metod, če je njihova uporaba v skladu s členom 13(3) Uredbe 1907/2006.

(5) Načela nadomestitve, zmanjšanja in izboljšanja uporabe živali v postopkih se morajo popolnoma upoštevati pri oblikovanju testnih metod, zlasti če so na voljo ustrezne potrjene metode, ki lahko nadomestijo, zmanjšajo ali izboljšajo poskuse na živalih.

(6) Določbe te uredbe so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega v skladu s členom 133 Uredbe (ES) št. 1907/2006 –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

Člen 1 Testne metode, ki jih je treba uporabiti za namene Uredbe 1907/2006/ES, so določene v Prilogi k tej uredbi.

Člen 2 Komisija bo po potrebi pregledala testne metode iz te uredbe, da se nadomestijo, zmanjšajo ali izboljšajo poskusi na vretenčarjih.

Člen 3 Vsi sklici na Prilogo V k Direktivi 67/548/EGS se razlagajo kot sklici k tej uredbi.

Člen 4 Ta uredba začne veljati dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Uporablja se od 1. junija 2008. V Bruslju, 30. maja 2008 Za Komisijo Stavros Dimas Član Komisije

ANNEX

PRILOGA DEL A: METODE ZA DOLOČANJE FIZIKALNO-KEMIJSKIH LASTNOSTI

A.1 TALIŠČE/ZMRZIŠČE

A.1

1. METODA Večina opisanih metod temelji na smernici za preskušanje OECD(1). Temeljna načela so navedena v virih (2) in (3).

1.

1.1 UVOD Opisane metode in naprave se uporabljajo za določanje tališča snovi brez kakršnih koli omejitev glede njihove stopnje čistosti. Izbira metode je odvisna od narave preskusne snovi. Tako bo omejitveni dejavnik to, ali je snov lahko, težko ali nemogoče uprašiti. Za nekatere snovi je primernejše določanje zmrzišča ali strdišča in standardi za te meritve so tudi vključeni v to metodo. Kadar zaradi posebnih lastnosti snovi ni mogoče ustrezno izmeriti nobenega od navedenih parametrov, je morda primerna točka tečenja.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Tališče je opredeljeno kot temperatura, pri kateri pride do prehoda iz trdnega v tekoče agregatno stanje pri atmosferskem tlaku, in je enaka zmrzišču. Ker fazni prehod številnih snovi poteka v temperaturnem območju, se pogosto opiše kot talilno območje. Pretvorba enot (K v oC) t = T -273,15 t Celzijeva temperatura, stopinja Celzija ( oC) T termodinamična temperatura, kelvin (K)

1.3 REFERENČNE SNOVI Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preučuje nova snov. Predvsem naj bi se uporabljale za občasno preverjanje učinkovitosti metode in za omogočanje primerjave z rezultati drugih metod. Nekatere snovi za umerjanje so naštete v virih (4).

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Določi se temperatura (temperaturno območje) faznega prehoda iz trdnega v tekoče stanje ali iz tekočega v trdno stanje. To pomeni, da se med segrevanjem/hlajenjem vzorca preskusne snovi pri atmosferskem tlaku določita temperaturi začetne faze taljenja/zmrzovanja in končne faze taljenja/zmrzovanja. Opisanih je pet vrst metod, to so kapilarna metoda, metode z ogrevalno mizico, metode za določanje zmrzišča, metode termične analize in metoda za določanje točke tečenja (kakor je bila razvita za nafto). V nekateri primerih je lahko pripravneje izmeriti zmrzišče namesto tališča.

1.4

1.4.1 Kapilarna metoda

1.4.1

1.4.1.1 Naprave za merjenje tališča s tekočinsko kopeljo V kapilarno cevko damo majhno količino drobno zmlete snovi in jo dobro potlačimo. Cevko segrevamo skupaj s termometrom in med dejanskim taljenjem prilagodimo naraščanje temperature na manj kot približno 1 K/min. Določimo začetno in končno talilno temperaturo.

1.4.1.2 Naprave za merjenje tališča s kovinskim blokom Kakor je opisano v 1.4.1.1, le da sta kapilarna cevka in termometer postavljena v ogrevan kovinski blok; opazujemo ju lahko skozi luknje v bloku.

1.4.1.3 Fotocelična detekcija Vzorec v kapilarni cevki se avtomatično segreva v kovinskem valju. Skozi luknjo v valju se usmeri žarek svetlobe skozi snov na natančno umerjeno fotocelico. Optične lastnosti večine snovi se med taljenjem spremenijo, prej neprozorne postanejo prozorne. Jakost svetlobe, ki doseže fotocelico, naraste in pošlje signal za konec digitalnemu indikatorju, ki odčitava temperaturo na platinskem uporovnem termometru v grelni komori. Ta metoda ni primerna za nekatere močno obarvane snovi.

1.4.2 Ogrevalna mizica

1.4.2

1.4.2.1 Koflerjeva ogrevalna plošča Za Koflerjevo ogrevalno ploščo se uporabita dva kosa kovine z različno toplotno prevodnostjo, električno ogrevana, s ploščo, zasnovano tako, da je vzdolž nje sprememba temperature skoraj linearna. Temperatura ogrevalne plošče je lahko od 283 do 573 K in se odčita s posebno napravo, ki vključuje premično kolesce s kazalcem in jezičkom, zasnovano za posamezno ploščo. Za določanje tališča, se snov v tanki plasti nanese neposredno na površino ogrevalne plošče. V nekaj sekundah se pojavi ostra razmejitvena črta med tekočo in trdno fazo. Temperatura na razmejitveni črti se odčita tako, da se nanjo naravna kazalec.

1.4.2.2 Talilni mikroskop Za določanje tališča z zelo majhnimi količinami materiala se uporablja več mikroskopskih grelnih mizic. Pri večini grelnih mizic se temperatura meri z občutljivim termočlenom, vendar se včasih uporablja tudi živosrebrni termometer. Značilna mikroskopska aparatura z ogrevalnimi mizicami za določanje tališča ima grelno komoro, ki vsebuje kovinsko ploščo, na katero položimo vzorec na objektnem stekelcu. Na sredini kovinske plošče je luknjica, ki omogoča vstop svetlobe s kolektorja mikroskopa. Med uporabo je komora zaprta s stekleno ploščo, ki preprečuje vdor zraka v območje vzorca. Segrevanje vzorca se uravnava z reostatom. Za zelo natančne meritve pri optično anizotropnih snoveh se lahko uporabi polarizirana svetloba.

1.4.2.3 Metoda z meniskusom Ta metoda se uporablja posebej za poliamide. Vizualno se določi temperatura, pri kateri se premakne meniskus silikonskega olja, ki je med ogrevalno mizico in krovnim stekelcem na preskusnem vzorcu poliamida.

1.4.3 Metoda za določanje zmrzišča Vzorec se da v posebno epruveto, ta pa v aparaturo za določanje zmrzišča. Vzorec se ohlaja in ves čas rahlo meša in v primernih intervalih se meri temperatura. Ko je temperatura pri nekaj zaporednih odčitkih nespremenjena, se ta temperatura (popravljena z upoštevanjem napake termometra) zapiše kot zmrzišče. Treba je preprečiti podhladitev, in sicer tako da se vzdržuje ravnotežje med trdno in tekočo fazo.

1.4.4 Termična analiza

1.4.4

1.4.4.1 Diferenčna termična analiza (DTA) Pri tej tehniki se beleži razlika v temperaturi snovi in referenčnega materiala v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in na referenčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vključuje spremembo entalpije, se ta sprememba pokaže kot endotermni (tališče) ali eksotermni (zmrzišče) odmik od bazne črte zapisa temperature.

1.4.4.2 Diferenčna dinamična kalorimetrija (DSC) Pri tej tehniki se beleži razlika v vnosu energije v snov in referenčni material v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in referenčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. Ta energija je energija, ki je potrebna za izenačitev temperature snovi in referenčnega materiala. Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vključuje spremembo entalpije, se ta sprememba pokaže kot endotermni (tališče) ali eksotermni (zmrzišče) odmik od bazne črte zapisa toplotnega pretoka.

1.4.5 Točka tečenja Ta metoda je bila razvita za nafto in je primerna za oljaste snovi z nizkim tališčem. Po predhodnem segrevanju se vzorec ohlaja s točno določeno hitrostjo in v intervalih 3 K se opazujejo značilnosti tečenja. Najnižja temperatura, pri kateri se še opazi premikanje snovi, se zapiše kot točka tečenja.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Uporabnost in točnost različnih metod, ki se uporabljajo za določanje tališča/talilnega območja, sta navedeni v naslednji tabeli:

1.5 TABELA: UPORABNOST METOD A. B. C. D.

Kapilarne metode Merilna metoda Snovi, ki jih je mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni mogoče zlahka uprašiti Temperaturno območje Ocenjena točnost Veljavni standard Naprave za merjenje tališča s tekočinsko kopeljo da le za nekatere 273 do 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Naprave za merjenje tališča s kovinskim blokom da le za nekatere 293 do > 573 K ±0,5 K ISO 1218(E) Fotocelična detekcija da za številne z uporabo prilagoditvenih naprav 253 do 573 K ±0,5 K Metode z ogrevalnimi mizicami in metode za določanje zmrzišča Merilna metoda Snovi, ki jih je mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni mogoče zlahka uprašiti Temperaturno območje Ocenjena točnost Veljavni standard Koflerjeva ogrevalna plošča da ne 283 do > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 3451-76 Talilni mikroskop da le za nekatere 273 do > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Metoda z meniskusom ne posebej za poliamide 293 do > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Metode za določanje zmrzišča da da 223 do 573 K ±0,5 K npr. BS 4695 Termična analiza Merilna metoda Snovi, ki jih je mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni mogoče zlahka uprašiti Temperaturno območje Ocenjena točnost Veljavni standard Diferenčna termična analiza da da 173 do 1273 K do 600 K ±0,5 K do 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Diferenčna dinamična kalorimetrija da da 173 do 1273 K Do 600 K ±0,5 K do 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Točka tečenja Merilna metoda Snovi, ki jih je mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni mogoče zlahka uprašiti Temperaturno območje Ocenjena točnost Veljavni standard Točka tečenja za nafto in oljaste snovi za nafto in oljaste snovi 223 do 323 K ±3,0 K ASTM D 97-66

1.6 OPIS METOD Postopki skoraj vseh preskusnih metod so opisani v mednarodnih in nacionalnih standardih (glej dodatek 1).

1.6

1.6.1 Metode s kapilarno cevko Kadar se drobno uprašene snovi počasi segrevajo, se običajno pokažejo talilne faze s slike 1.

1.6.1

Slika 1 Faza A Faza B Faza C Faza D Faza E Faza A (začetek taljenja): drobne kapljice se enakomerno oprimejo notranje stene kapilarne cevke Faza B med vzorcem in notranjo steno se zaradi krčenja taline pojavi praznina Faza C skrčen vzorec se začne sesedati in utekočinjati Faza D na površini se oblikuje popoln meniskus, vendar znatna količina vzorca ostane trdna Faza E (zadnja faza taljenja): ni več nobenih trdnih delcev Pri določanju tališča zapišemo temperaturi na začetku taljenja in v zadnji fazi.

1.6.1.1 Naprave za merjenje tališča s tekočinsko kopeljo Slika 2 prikazuje vrsto standardizirane steklene aparature za merjenje tališča (JIS K 0064); vse specifikacije so v milimetrih.

1.6.1.1

Slika 2 A: Merilna posoda B: Zamašek C: Odprtina za zrak D: Termometer E: Pomožni termometer F: Tekočina za kopel G: Steklena kapilarna cevka, dolga 80 do 100 mm, z notranjim premerom 1,0 ± 0,2 mm in steno, debelo 0,2 do 0,3 mm H: Stranska cevka

Tekočina za kopel:

Izbrati je treba primerno tekočino. Izbira tekočine je odvisna od tališča, ki se določa, npr. tekoči parafin za tališča do največ 473 K, silikonsko olje za tališča do največ 573 K. Za tališča, višja od 523 K, se lahko uporabi zmes treh delov žveplove kisline in dveh delov kalijevega sulfata (v masnem razmerju). Pri uporabi take zmesi je treba upoštevati primerne varnostne ukrepe.

Termometer:

Uporabljajo se lahko samo termometri, ki izpolnjujejo zahteve naslednjih ali njim enakovrednih standardov: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Postopek:

Suha snov se na drobno upraši v terilnici in da v na enem koncu zataljeno kapilaro, tako da je tesno natlačene snovi v kapilari približno 3 mm. Da bo vzorec enakomerno potlačen, je treba kapilaro z višine približno 700 mm spustiti skozi stekleno cevko navpično na urno steklo. Napolnjena kapilarna cevka se postavi v kopel, tako da se srednji del bučke termometra z živim srebrom dotika kapilarne cevke na delu, kjer je vzorec. Običajno se kapilarna cevka vstavi v aparaturo pri temperaturi približno 10 K pod tališčem. Tekočina kopeli se segreva tako, da temperatura narašča približno za 3 K/min. Tekočino je treba mešati. Pri približno 10 K pod pričakovanim tališčem se naraščanje temperature naravna na največ 1 K/min.

Izračun:

Tališče izračunamo na naslednji način: T = TD+0,00016 (TD - TĚ) n pri čemer je: T popravljeno tališče v K TD odčitana temperatura na termometru D v K TE odčitana temperatura na termometru E v K n število graduacij živosrebrnega stolpca na termometru D na delu, ki gleda iz tekočine.

1.6.1.2 Naprave za merjenje tališča s kovinskim blokom

1.6.1.2 Aparatura:

Sestavljajo jo:

valjast kovinski blok, katerega zgornji del je votel in predstavlja komoro (glej sliko 3),

kovinski zamašek z dvema ali več luknjami, ki omogočajo vstavljanje cevk v kovinski blok,

grelni sistem za kovinski blok, na primer z električnim uporom, vgrajenim v blok,

reostat za uravnavanje dovoda energije, če se uporabi električno gretje,

štiri okenca iz stekla, odpornega proti vročini, v stranskih stenah komore, diametralno razporejenih pravokotno drug na drugega. Pred enim od okenc je postavljen okular za opazovanje kapilarne cevke. Ostala tri okenca se uporabljajo za osvetljevanje notranjosti komore z žarnicami,

kapilarna cevka iz stekla, odpornega proti vročini, na enem koncu zaprta (glej 1.6.1.1).

Glej standarde, navedene v 1.6.1.1. Lahko se uporabijo tudi termoelektrični instrumenti s primerljivo točnostjo.

Slika 3 Termometer Kapilarna cevka Kovinski zamašek Okular Žarnica Električni upor Kovinski ogrevalni blok

1.6.1.3 Fotocelična detekcija Aparatura in postopek: Aparaturo sestavlja kovinska komora z avtomatiziranim grelnim sistemom. Tri kapilarne cevke se napolnijo v skladu z 1.6.1.1 in postavijo v grelno komoro. Za umerjanje aparature je na voljo več linearnih naraščanj temperature in primerno naraščanje temperature se električno naravna na vnaprej določeno konstantno in linearno hitrost naraščanja. Zapisovalniki kažejo dejansko temperaturo grelne komore in temperaturo snovi v kapilarnih cevkah.

1.6.2 Ogrevalne mizice

1.6.2

1.6.2.1 Koflerjeva ogrevalna plošča Glej dodatek.

1.6.2.2 Talilni mikroskop Glej dodatek.

1.6.2.3 Metoda z meniskusom (poliamidi) Glej dodatek. Hitrost segrevanja v območju tališča mora biti manjša od 1 K/min.

1.6.3 Metode za določanje zmrzišča Glej dodatek.

1.6.4 Termična analiza

1.6.4

1.6.4.1 Diferenčna termična analiza Glej dodatek.

1.6.4.2 Diferenčna dinamična kalorimetrija Glej dodatek.

1.6.5 Delovanje točke tečenja Glej dodatek.

2. PODATKI V nekaterih primerih je potreben popravek termometra.

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije: Kot tališče se navede srednja vrednost najmanj dveh meritev, ki sta v območju predvidene točnosti (glej tabele). Če je razlika med temperaturo na začetku taljenja in tisto v zadnji fazi taljenja znotraj meja točnosti metode, se kot tališče navede temperatura v zadnji fazi taljenja; sicer pa se navedeta obe temperaturi. Če snov razpade ali sublimira, preden se doseže tališče, se navede temperatura, pri kateri so bile opažene te spremembe. Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečstot in agregatnega stanja snovi.

uporabljena metoda,

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote) ter predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno,

ocena točnosti.

4.(1)(2)(3)(4)

VIRI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, str. 803–834. R. Weissberger éd.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd éd., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, str. 505–515.

A.2 VRELIŠČE

A.2

1. METODA Večina opisanih metod temelji na smernici za preskušanje OECD (1). Temeljna načela so navedena v virih (2) in (3).

1.

1.1 UVOD Tukaj opisane metode in naprave se lahko uporabljajo za tekoče snovi in snovi z nizkim tališčem, pod pogojem da pri njih ne pride do kemične reakcije pri temperaturah pod vreliščem (na primer avtooksidacije, prerazporeditve, razgradnje itd.). Te metode se lahko uporabljajo za čiste in nečiste tekoče snovi. Poudarjene so metode s fotocelično detekcijo in termično analizo, ker te metode omogočajo določanje tališča in vrelišča. Poleg tega je meritve mogoče opraviti avtomatsko. Dinamična metoda ima to prednost, da se lahko uporabi tudi za določanje parnega tlaka ter da ni treba popravljati vrelišča glede na normalni tlak (101,325 kPa), ker se med merjenjem z manostatom lahko naravna normalni tlak. Opombe: Vpliv nečistot na določanje vrelišča je v veliki meri odvisen od narave nečistote. Kadar so v vzorcu hlapne nečistote, ki bi lahko vplivale na rezultat, se snov lahko prečisti.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Normalno vrelišče je opredeljeno kot temperatura, pri kateri je parni tlak tekočine enak 101,325 kPa. Če se vrelišče ne meri pri normalnem atmosferskem tlaku, lahko odvisnost parnega tlaka od temperature opisemo s Clausius-Clapeyronovo enačbo: log p = Δ Hv2,3 RT+konst. pri čemer je: P parni tlak snovi v paskalih AHV izparilna toplota v J mol-1 R splošna plinska konstanta = 8,314 J mol-1 K-1 T termodinamična temperatura v K Vrelišče se navede glede na zračni tlak med meritvijo. Pretvorbe Tlak (enote: kPa) 100 kPa 1 bar = 0,1 MPa (enota bar je še vedno dovoljena, vendar se ne priporoča) 133 Pa 1 mm Hg = 1 tor (enoti mm Hg in tor nista dovoljeni) 1 atm standardna atmosfera = 101325 Pa (enota atm ni dovoljena). Temperatura (enote: K) t = T - 273,15 t Celzijeva temperatura, stopinja Celzija ( oC) T termodinamična temperatura, kelvin (K)

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Pet metod za določanje vrelišča (vreliščnega območja) temelji na merjenju vrelišča, dve pa temeljita na termični analizi.

1.4

1.4.1 Določanje z uporabo ebulioskopa Ebulioskopi so bili prvotno zasnovani za določanje molekulske mase glede na naraščajoče vrelišče, vendar so primerni tudi za natančno merjenje vrelišča. Zelo preprosta aparatura je opisana v ASTM D 1120-72 (glej Dodatek). Tekočina se segrejeva v tej aparaturi v ravnotežnih pogojih pri atmosferskem tlaku, dokler ne zavre.

1.4.2 Dinamična metoda Ta metoda vključuje merjenje temperature rekondenzacije pare z ustreznim termometrom v povratnem toku med vretjem. Tlak se pri tej metodi lahko spreminja.

1.4.3 Destilacijska metoda za vrelišče Ta metoda vključuje destilacijo tekočine in merjenje temperature rekondenzacije pare ter določanje količine destilata.

1.4.4 Metoda po Siwoloboffu Vzorec se segreva v cevki, potopljeni v tekočino toplotne kopeli. V cevko z vzorcem se potopi zataljena kapilara, ki v spodnjem delu vsebuje zračni mehurček.

1.4.5 Fotocelična detekcija Po Siwoloboffovem principu se izvede avtomatsko fotoelektrično merjenje z uporabo dvigajočih se mehurčkov.

1.4.6 Diferenčna termična analiza Pri tej tehniki se beleži razlika v temperaturi snovi in referenčnega materiala v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in na referenčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vključuje spremembo entalpije, se ta sprememba pokaže kot endotermni (vrelišče) odmik od bazne črte zapisa temperature.

1.4.7 Diferenčna dinamična kalorimetrija Pri tej tehniki se beleži razlika v vnosu energije v snov in referenčni material v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in referenčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. Ta energija je energija, potrebna za izenačitev temperature snovi in referenčnega materiala. Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vključuje spremembo entalpije, se ta sprememba pokaže kot endotermni (vrelišče) odmik od bazne črte zapisa toplotnega pretoka.

1.5 Tabela 1 Primerjava metod

MERILA KAKOVOSTI Uporabnost in točnost različnih metod, ki se uporabljajo za določanje vrelišča/vreliščnega območja, sta navedeni v tabeli 1. Merilna metoda Ocenjena točnost Veljavni standard Ebulioskop ±1,4 K (do373K) ±2,5 K (do 600K) ASTMD 1120-72 Dinamična metoda ±0,5 K (do 600 K) Destilacijski proces (vreliščno območje) ±0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Po Siwoloboffu ± 2 K (do 600 K) Fotocelična detekcija ±0,3 K (do 373 K) Diferenčna termična kalorimetrija ±0,5 K (do 600 K) ±2,0 K (do 1273 K) ASTM E 537-76 Diferenčna dinamična kalorimetrija ±0,5 K (do 600 K) ±2,0 K (do1 1273 K) ASTM E 537-76

1.6 OPIS METOD Postopki nekaterih preskusnih metod so opisani v mednarodnih in nacionalnih standardih (glej dodatek).

1.6

1.6.1 Ebulioskop Glej dodatek.

1.6.2 Dinamifha metoda Glej preskusno metodo A.4 za določanje parnega tlaka. Zapišemo temperaturo vrelišča, ugotovljeno pri tlaku 101,325 kPa.

1.6.3 Destilacijski proces (vreliščno območje) Glej dodatek.

1.6.4 Metoda po Swiloboffu Vzorec se segreva v aparaturi za določanje tališča, v cevki s premerom približno 5 mm (slika 1). Slika 1 prikazuje vrsto standardizirane aparature za določanje tališča in vrelišča (JIS K 0064) (iz stekla, vse specifikacije v milimetrih). Kapilarna cevka (vreliščna kapilara), stisnjena približno 1 cm nad spodnjim delom, se da v cevko za vzorec. Doda se toliko preskusne snovi, da je stisnjeni del kapilare pod površino tekočine. Cevka z vzorcem, v kateri je vreliščna kapilara, se bodisi pritrdi na termometer z elastiko bodisi fiksira s podporo s strani (glej sliko 2). Slika 2 Princip po Siwoloboffu Slika 3 Prilagojeni princip Tekočina za kopel se izbere glede na vrelišče. Pri temperaturah do 573 K se lahko uporabi silikonsko olje. Tekoči parafin se lahko uporabi le do 473 K. Segrevanje tekočine kopeli mora biti sprva naravnano tako, da temperatura narašča 3 K/min. Tekočino kopeli je treba mešati. Pri približno 10 K pod pričakovanim vreliščem se segrevanje upočasni, tako da temperatura narašča manj kot 1 K/min. Ko se približujemo vrelišču, začnejo iz vreliščne kapilare hitro izhajati mehurčki. Vrelišče je temperatura, pri kateri se ob trenutni ohladitvi ustavi izhajanje mehurčkov, tekočina v kapilari pa se začne nenadoma dvigati. Ustrezen odčitek s termometra je vrelišče snovi. Pri prilagojenem principu (slika 3) se vrelišče določa v tališčni kapilari. Njen konec se raztegne v približno 2 cm dolgo tanko konico (a); vanjo se vsesa majhna količina vzorca. Odprti konec drobne kapilare se zatali, tako da je na koncu ostane zračni mehurček. Med segrevanjem v aparaturi za določanje tališča (b) se zračni mehurček razširi. Vrelišče sovpada s temperaturo, pri kateri zamašek iz snovi doseže nivo površine tekočine kopeli (c).

1.6.4 Slika l

A: Merilna posoda B: Zamašek C: Odprtina za zrak D: Termometer E: Pomožni termometer F: Tekočina za kopel G: Cevka za vzorec, zunanji premer največ 5 mm; vsebuje kapilarno cevko, dolgo približno 100 mm, z notranjim premerom približno 1 mm in steno, debelo približno 0,2 do 0,3 mm H: Stranska cevka

1.6.5 Fotocelična detekcija Vzorec se segreva v kapilarni cevki znotraj segrevanega kovinskega bloka. Skozi ustrezne luknje v bloku se usmeri svetlobni žarek skozi snov na natančno umerjeno fotocelico. Med naraščanjem temperature vzorca iz vreliščne kapilare izhajajo posamezni mehurčki. Ko se doseže vrelišče, se količina mehurčkov zelo poveča. To povzroči spremembo v jakosti svetlobe, ki jo beleži fotocelica, kar da signal za konec indikatorju, ki odčitava temperaturo s platinskega uporovnega termometra znotraj bloka. Ta metoda je se posebej uporabna, ker omogoča določanje vrelišča pri temperaturi, nižji od sobne, vse do 253,15 K (–20 oC) ne da bi bilo treba aparaturo kakor koli spreminjati. Instrument moramo le položiti v hladno kopel.

1.6.6 Termična analiza

1.6.6

1.6.6.1 Diferenčna termična analiza Glej dodatek.

1.6.6.1 Diferenčna dinamična kalorimetrija Glej dodatek.

2. Tabela 2 Temperatura – korekcijski faktorji fT

PODATKI Pri majhnih odstopanjih od normalnega tlaka (največ ± 5 kPa) se vrelišča normalizirajo na Tn po naslednji enačbi Sidneya Younga: Tn = T + (fT × Δp) pri čemer je: Δp (101,325 – p) [pazi na predznak] P izmerjeni tlak v kPa fT razmerje med spremembo vrelišča in tlakom v K/kPa T izmerjeno vrelišče v K Tn vrelišče, popravljeno na normalni tlak, v K V zgoraj navedenih mednarodnih in nacionalnih standardih so korekcijski faktorji za temperature, fT, in enačbe za njihove približke za mnoge snovi. Na primer, metoda DIN 53171 navaja naslednje okvirne korekcije za topila v barvah: Temperatura T (K) Korekcijski faktor fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije: Kot vrelišče se navede srednja vrednost najmanj dveh meritev, ki sta v območju predvidene točnosti (glej tabelo 1). Navedejo se izmerjena vrelišča in njihova srednja vrednost ter tlak(i), pri katerih so bile meritve opravljene, v kPa. Tlak naj bo po možnosti blizu normalnemu atmosferskemu tlaku. Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi.

uporabljena metoda,

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote) in predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno,

ocena točnosti.

4.(1)(2)(3) VIRI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, Volume II. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

A.3 RELATIVNA GOSTOTA

A.3

1. METODA Opisane metode temeljijo na smernici za preskušanje OECD (1). Temeljna načela so navedena v viru (2).

1.

1.1 UVOD Opisane metode za določanje relativne gostote se uporabljajo za trdne in tekoče snovi, brez kakršnih koli omejitev glede njihove stopnje čistosti. Različne metode, ki se uporabijo, so navedene v tabeli 1.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Relativna gostota, D420, trdnih snovi ali tekočin je razmerje med maso volumna preskusne snovi pri 20 oC in maso enakega volumna vode pri 4 oC. Relativna gostota nima enote. Gostota snovi, ρ, je količnik njene mase, m, in volumna, V. Gostota, ρ, se v enotah SI izrazi v kg/m3.

1.3 REFERENČNE SNOVI (1) (3) Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preučuje nova snov. Predvsem naj bi se uporabljale za občasno preverjanje učinkovitosti metode in za omogočanje primerjave z rezultati drugih metod.

1.4 PRINCIP METOD Uporabljajo se štiri vrste metod.

1.4

1.4.1 Vzgonske metode

1.4.1

1.4.1.1 Hidrometer (za tekoče snovi) Dovolj točno in hitro je gostoto mogoče določiti s plavajočimi hidrometri, ki omogočajo sklepanje o gostoti tekočine glede na globino potopitve z odčitavanjem z graduirane lestvice.

1.4.1.2 Hidrostatska tehtnica (za tekoče in trdne snovi) Za določitev gostote vzorca se lahko uporabi razlika med njegovo maso, izmerjeno na zraku, in tisto, izmerjeno v primerni tekočini (npr. vodi). V primeru trdnih snovi je izmerjena gostota reprezentativna le za uporabljeni vzorec. Pri določanju gostote tekočin, telo z znanim volumnom V, najprej stehtamo na zraku, potem pa še v tekočini.

1.4.1.3 Metoda s potopljenim telesom (za tekoče snovi) (4) Pri tej metodi se gostota tekočine določi iz razlike med rezultati tehtanja tekočine pred in po potopitvi telesa z znanim volumnom vanjo.

1.4.2 Piknometrske metode Za trdne snovi ali tekočine se lahko uporabijo piknometri različnih oblik in znanih volumnov. Gostota se izračuna iz razlike med maso polnega in maso praznega piknometra ter njegovega znanega volumna.

1.4.3 Piknometer s primerjanjem zraka (za trdne snovi) Gostota trdne snovi v kakršni koli obliki se lahko izmeri s piknometrom s primerjanjem plina pri sobni temperaturi. Volumen snovi se izmeri na zraku ali v inertnem plinu v valju s spremenljivim umerjenim volumnom. Za izračun gostote se po končanem merjenju volumna opravi ena meritev mase.

1.4.4 Oscilacijski denzitometer (5) (6) (7) Gostota tekočine se lahko izmeri z oscilacijskim denzitometrom. Mehanski oscilator, oblikovan kot U-cev, naj vibrira s svojo resonančno frekvenco, ki je odvisna od njegove mase. Ko se doda vzorec, se resonančna frekvenca oscilatorja spremeni. Aparaturo je treba umeriti z dvema tekočima snovema, katerih gostoti sta znani. Po možnosti se izbereta snovi, katerih gostoti pokrivata merjeno območje.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Uporabnost različnih metod za določanje relativne gostote je navedena v tabeli.

1.6 OPIS METOD Primeri standardov, ki so vir dodatnih tehničnih podatkov, so navedeni v dodatku. Preskusi morajo biti izvedeni pri 20 oC in vključevati najmanj dve meritvi.

2. PODATKI Glej standarde.

3. Tabela 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.21.4.31.4.4 Uporabnost metod

POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije: Relativna gostota, D204, se navede, kakor je opredeljeno v 1.2, skupaj z agregatnim stanjem merjene snovi. Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi. Merilna metoda Gostota Največja možna dinamična viskoznost Veljavni standardi trdna snov tekočina Hidrometer da 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2 NF T 20-050 Hidrostatska tehtnica da ISO 1183 (A) da 5 Pa s ISO 901 in 758 Metoda s potopljenim telesom da 20 Pa s DIN 53217 Piknometer ISO 3507 da ISO 1183(B), NF T 20-053 da 500 Pa s ISO 758 Piknometer s primerjanjem zraka di DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Oscilacijski denzitometer da 5 Pa s

uporabljena metoda,

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote) in predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno.

3. Tabela 1.4.1.11.4.1.2 Uporabnost metod

(a) trdne snovi

(b) tekočine

3. Tabela 1.4.1.11.4.1.21.4.1.31.4.2 Uporabnost metod

(a) trdne snovi

(b) tekočine

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

VIRI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. II, 427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297–302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.

A.4 PARNI TLAK

A.4

1. METODA Večina opisanih metod temelji na smernici za preskušanje OECD (1). Temeljna načela so navedena v virih (2) in (3).

1.

1.1 UVOD Za izvajanje tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o strukturi, tališču in vrelišču snovi. Ni enega samega merilnega postopka, ki bi bil uporaben za celotno območje parnih tlakov. Zato se priporoča uporaba več metod za merjenje parnega tlaka od < 10–4 do 105 Pa. Nečistote običajno vplivajo na parni tlak, kolikšen pa je ta vpliv, je zelo odvisno od vrste nečistote. Kadar so v vzorcu hlapne nečistote, ki bi lahko vplivale na rezultat, se snov lahko prečisti. Primerno je lahko tudi navesti parni tlak tehničnega materiala. Pri nekaterih tukaj opisanih metodah se uporablja aparatura s kovinskimi deli; to je treba upoštevati pri preskušanju jedkih snovi.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Parni tlak snovi je opredeljen kot tlak nasičene pare nad trdno ali tekočo snovjo. Pri termodinamičnem ravnotežju je parni tlak čiste snovi odvisen samo od temperature. Enota SI za tlak, ki jo je treba uporabljati, je paskal (Pa). V preteklosti uporabljane enote, skupaj s pretvorbenimi faktorji, so: 1 tor (= 1 mmHg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Enota SI za temperaturo je kelvin (K). Splošna plinska konstanta R je 8,314 J mol-1 K-1. Odvisnost parnega tlaka od temperature se opiše s Clausius-Clapeyronovo enačbo: log p = Δ Hv2,3 RT+konst. pri čemer je: p parni tlak snovi v paskalih ΔHv izparilna toplota v J mol-l R splošna plinska konstanta v J mol-l K-1 T termodinamična temperatura v K

1.4 PRINCIP PRESKUSNIH METOD Za določanje parnega tlaka je predlaganih sedem metod, ki se lahko uporabijo za različna območja parnega tlaka. Pri vsaki metodi se parni tlak določa pri različnih temperaturah. V omejenem temperaturnem območju je logaritem parnega tlaka čiste snovi linearna funkcija obratne vrednosti temperature.

1.4

1.4.1 Dinamična metoda Pri dinamični metodi se meri vrelišče, ki je povezano z določenim tlakom. Priporočeno območje: 103 do 105 Pa. Ta metoda se priporoča tudi za določanje normalnega vrelišča in je uporabna v ta namen do 600 K.

1.4.2 Statična metoda Med statičnim procesom, pri termodinamičnem ravnotežju, se pri določeni temperaturi določa parni tlak v zaprtem sistemu. Ta metoda je primerna za enokomponentne in večkomponentne trdne snovi in tekočine. Priporočeno območje: 10 do 105 Pa. Ta metoda se lahko uporabi tudi za območje od 1 do 10 Pa, pod pogojem, da smo previdni.

1.4.3 Izoteniskop Ta standardizirana metoda je tudi statična metoda, vendar običajno ni primerna za večkomponentne sisteme. Dodatne informacije so na voljo v metodi ASTM D-2879-86. Priporočeno območje: 100 do 105 Pa.

1.4.4 Efuzijska metoda: Parnotlačna tehtnica Določi se količina snovi, ki zapusti merilno celico v časovni enoti skozi odprtino znane velikosti, v takih vakuumskih pogojih, da je količina v celico vrnjene snovi zanemarljiva (npr. z merjenjem pulza na občutljivi tehtnici, ki ga povzroči curek pare, ali z merjenjem izgube mase). Priporočeno območje: 10-3 do 1 Pa.

1.4.5 Efuzijska metoda: Z izgubo mase ali lovljenjem pare Ta metoda temelji na oceni mase preskusne snovi, ki v obliki pare zapusti Knudsenovo celico (4) v časovni enoti skozi mikroodprtino v pogojih ultra visokega vakuuma. Masa izhajajoče pare se lahko ugotovi tako, da se bodisi določi izguba mase celice bodisi kondenzira para pri nizki temperaturi in določi količina izhlapele snovi s kromatografsko analizo. Parni tlak se izračuna z uporabo Hertz-Knudsenovega razmerja. Priporočeno območje: 10-3 do 1 Pa.

1.4.6 Metoda z nasičenjem plinov Preko snovi se usmeri tok inertnega nosilnega plina, tako da se plin nasiti z njeno paro. Količina snovi, ki se prenese z znano količino inertnega plina, se lahko izmeri bodisi z zbiranjem v ustrezni lovilnik bodisi z neposredno analitsko tehniko. Ta količina se nato uporabi za izračun parnega tlaka pri dani temperaturi. Priporočeno območje: 10-4 do 1 Pa. Ta metoda se lahko uporabi tudi za območje od 1 do 10 Pa, pod pogojem, da smo previdni.

1.4.7 Metoda z rotorjem Pri merilniku z rotorjem je dejanski merilni element jeklena kroglica, ki lebdi v magnetnem polju in se zelo hitro vrti. Tlak plina se določi s sklepanjem glede na upočasnitev jeklene kroglice, ki je odvisna od tlaka. Priporočeno območje: 10-4 do 0,5 Pa.

1.5 Tabela 1.4.11.4.21.4.31.4.41.4.51.4.61.4.7 Merila kakovosti

MERILA KAKOVOSTI Različne metode določanja parnega tlaka se primerjajo glede na uporabnost, ponovljivost, obnovljivost, merilno območje in veljavne standarde. Taka primerjava je v naslednji tabeli. Merilna metoda Snovi Ocenjena ponovljivost Ocenjena ponovljivost Priporočeno območje Veljavni standard trdna snov tekočina Dinamična metoda nizko tališče da do 25 % do 25 % 103 Pa do 2 × 103 Pa — 1 do 5 % 1 do 5 % 2 × 103 Pa do 105 Pa — Statična metoda da da 5 do 10 % 5 do 10 % 10 Pa do 105 Pa NET 20-048 (5) Izoteniskop da da 5 do 10 % 5 do 10 % 102 Pa do 105 Pa ASTM-D 2879-86 Efuzijska metoda, parnotlačna tehtnica da da 5 do 20 % Do 50 % 10-3 do 1 Pa NFT 20-047(6) Efuzijska metoda, izguba mase da da 10 do 30 % — 10-3 do 1 Pa — Metoda z nasičenjem plinov da da 10 do 30 % Do 50 % 10-4 Pa do1 Pa — Metoda z rotorjem da da 10 do 20 % — 10-4 Pa do 0,5 Pa —

1.6 OPIS METOD

1.6

1.6.1 Dinamično merjenje

1.6.1

1.6.1.1 Aparatura Merilna aparatura je običajno sestavljena iz vrelne posode s pritrjenim hladilnikom iz stekla ali kovine (slika 1), opreme za merjenje temperature ter opreme za uravnavanje in merjenje tlaka. Značilna merilna aparatura na sliki je narejena iz stekla, odpornega proti vročini, in sestavljena iz petih delov: Velika cev, delno z dvojno steno, je sestavljena iz brušene ovojne spojke, hladilnika, hladilne posode in vhodne odprtine. Stekleni valj s Cottrellovo črpalko je nameščen v vrelnem delu cevi in ima grobo površino iz brušenega stekla, da se prepreči sunkovito udarjanje med vrenjem. Temperatura se meri z ustreznim senzorjem temperature (npr. uporovnim termometrom, termočlenom v plašču), ki se skozi primerno odprtino (npr. zunanji (moški) obrus) potopi v aparaturo do merilne točke (št. 5 na sliki 1). Aparatura se ustrezno poveže z opremo za uravnavanje in merjenje tlaka. Bučka, ki deluje kot pufrski volumen, se poveže z merilno aparaturo preko kapilarne cevke. Vrelna posoda se segreva z grelnim elementom (npr. kartušnim grelnikom), vstavljenim v stekleno aparaturo od spodaj. Potrebni grelni tok se nastavi in uravnava preko termočlena. Potrebni vakuum med 102 in približno 105 Pa se ustvari z vakuumsko črpalko. Uporabi se ustrezni ventil za odmerjanje zraka ali dušika za uravnavanje tlaka (merilno območje približno 102 do 105 Pa) in zračenje. Tlak se meri z manometrom.

1.6.1.2 Merilni postopek Parni tlak se meri z določanjem vrelišča vzorca pri različnih točno določenih tlakih med približno 103 in 105 Pa. Nespremenjena temperatura pri konstantnem tlaku kaže, da je bilo doseženo vrelišče. Penečih se snovi ni mogoče meriti s to metodo. Snov se da v čisto in suho vzorčno posodo. Pri neuprašenih trdnih snoveh lahko nastanejo težave, ki pa se včasih lahko odpravijo s segrevanjem hladilnega plašča. Ko je posoda napolnjena, se aparatura zatesni pri robnici in snov razplini. Nato se nastavi najnižji želeni tlak ter vključi gretje. Hkrati se senzor temperature poveže z zapisovalnikom. Ravnotežje je doseženo, ko se zapiše konstantno vrelišče pri konstantnem tlaku. Posebej je treba paziti, da se prepreči sunkovito udarjanje med vrenjem. Poleg tega se mora kondenzacija v hladilniku popolnoma končati. Kadar se določa parni tlak trdnih snovi z nizkim tališčem, je treba paziti, da se hladilnik ne zamaši. Potem ko se zapiše točka ravnotežja, se nastavi višji tlak. Postopek se nadaljuje na enak način, dokler se ne doseže tlak 105 Pa (skupaj približno 5 do 10 merilnih točk). Za potrditev je treba ponoviti točke ravnotežja pri padajočih tlakih.

1.6.2 Statične meritve

1.6.2

1.6.2.1 Aparatura Aparaturo sestavljajo posoda za vzorec, grelni in hladilni sistem za uravnavanje temperature vzorca in naprava za merjenje temperature. Aparatura vključuje tudi inštrumente za uravnavanje in merjenje tlaka. Sliki 2a in 2b prikazujeta osnovne principe metode. Komora za vzorec (slika 2a) se na eni strani poveže z ustreznim visokovakuumskim ventilom. Na drugo stran se pritrdi U-cevka, ki vsebuje ustrezno manometrsko tekočino. En krak U-cevke vodi do vakuumske črpalke, dušikove jeklenke ali prezračevalnega ventila in do manometra. Namesto U-cevke se lahko uporabi merilnik tlaka z indikatorjem tlaka (slika 2b). Za uravnavanje temperature vzorca se vzorčna posoda skupaj z ventilom in U-cevko ali manometrom postavi v kopel, ki se vzdržuje pri konstantni temperaturi ±0,2 K. Temperatura se meri ob zunanji steni posode z vzorcem ali v sami posodi. Za odzračevanje naprave se uporabi vakuumska črpalka z ohlajeno pastjo na začetku toka. Pri metodi 2a se parni tlak snovi meri posredno z ničelnim indikatorjem. Pri tem se upošteva, da se gostota tekočine v U-cevki spremeni, če se zelo spremeni temperatura. Kot ničelni indikatorji za U-cevko so primerne naslednje tekočine, odvisno od območja tlaka in kemijskih lastnosti preskusne snovi: silikonska olja, ftalati. Preskusna snov se ne sme vidno topiti v tekočini v U-cevki ali z njo reagirati. Za manometer se lahko uporabijo živo srebro za območje od normalnega zračnega tlaka do 102 Pa ter silikonska olja in ftalati pri območju pod 102 Pa do 10 Pa. Membranski manometri, ki se lahko segrevajo, se lahko uporabljajo tudi pod 10–1 Pa. Obstajajo tudi drugi merilniki tlaka, ki se lahko uporabljajo pod 102 Pa.

1.6.2.2 Merilni postopek Pred merjenjem je treba sestavne dele aparature s slike 2 temeljito očistiti in posušiti. Za metodo 2a se U-cevka napolni z izbrano tekočino, ki jo je treba pred odčitavanjem razpliniti pri zvišani temperaturi. V aparaturo se da preskusna snov, aparatura se zapre in temperatura dovolj zmanjša za razplinjenje. Temperatura mora biti dovolj nizka, da se zagotovi izčrpanje zraka, vendar – pri večkomponentnih sistemih – ne sme povzročiti sprememb v sestavi snovi. Če je potrebno, se z mešanjem pospeši vzpostavljanje ravnotežja. Vzorec se lahko podhladi npr. s tekočim dušikom (pri čemer je treba paziti, da se zrak ali tekočina v črpalki ne kondenzira) ali zmesjo etanola in suhega ledu. Za meritve pri nizkih temperaturah uporabimo kopel z uravnavano temperaturo, povezano z ultra-kriostatom. Ob odprtem ventilu nad vzorčno posodo se nekaj minut izsesava zrak. Nato se zapre ventil in zmanjša temperatura vzorca do najnižje želene ravni. Če je potrebno, se postopek razplinjevanja večkrat ponovi. Ko se vzorec segreva, parni tlak narašča. To spremeni ravnotežje tekočine v U-cevki. Za izravnavo tega učinka, se skozi ventil v aparaturo spusti dušik ali zrak, dokler ni indikator tlaka spet na ničli. Tlak, potreben za to, se lahko odčita s preciznega manometra pri sobni temperaturi. Ta tlak ustreza parnemu tlaku snovi pri tej merilni temperaturi. Metoda 2b je podobna, le da se parni tlak odčita neposredno. Odvisnost parnega tlaka od temperature se določi v primernih intervalih (skupaj približno 5 do 10 merilnih točk) do želenega maksimuma. Za preveritev je treba meritve ponoviti pri nizkih temperaturah. Če vrednosti, dobljene pri ponovljenih meritvah, ne sovpadajo z dobljeno krivuljo za naraščajočo temperaturo, je to lahko posledica enega od naslednjih vzrokov:

1.6.2.2

1. V vzorcu je še vedno zrak (npr. snovi z veliko viskoznostjo) ali snovi z nizkim vreliščem, ki se sprosti(-jo) med segrevanjem in se lahko odstrani(-jo) z izsesavanjem po dodatnem podhlajevanju.

2. Temperatura hlajenja ni dovolj nizka. V tem primeru se za hlajenje uporabi tekoči dušik. Pri primerih 1 in 2 je treba meritve ponoviti.

3. V preučevanem temperaturnem območju snov kemično reagira (npr. razpada, polimerizira).

1.6.3 Izoteniskop Popoln opis te metode lahko najdemo v viru (7). Princip merilne naprave je prikazan na sliki 3. Podobno kot statična metoda iz 1.6.2 je izoteniskop primeren za preučevanje trdnih snovi ali tekočin. V primeru tekočin sama snov služi kot tekočina v pomožnem manometru. V izoteniskop se da zadostna količina tekočine, da se napolni bučka in krajši krak manometrskega dela. Izoteniskop se pritrdi na vakuumski sistem in odzrači, nato pa napolni z dušikom. Odzračevanje in splakovanje sistema se dvakrat ponovi, da se odstrani ves kisik. Napolnjen izoteniskop se postavi v vodoraven položaj, tako da se vzorec razlije v tanko plast v vzorčni bučki in manometrskem delu (U-cev). Tlak v sistemu se zmanjša na 133 Pa in vzorec se počasi segreva, dokler ravno ne začne vreti (odstranitev raztopljenih permanentnih plinov). Izoteniskop se nato postavi tako, da se vzorec vrne v bučko in krajši krak manometra ter se oba popolnoma napolnita s tekočino. Vzdržuje se tlak, kakor pri razplinjevanju; podaljšana konica bučke z vzorcem se segreva nad majhnim plamenom, dokler se sproščene pare vzorca toliko ne razširijo, da izpodrinejo del vzorca iz zgornjega dela bučke in kraka manometra, ga potisnejo v manometrski del izoteniskopa in tako ustvarijo s parami nasičen prostor brez dušika. Izoteniskop se nato postavi v kopel s konstantno temperaturo, tlak dušika pa se naravna tako, da je enak tlaku vzorca. Ravnotežje tlaka pokaže manometrski del izoteniskopa. Ob ravnotežju je parni tlak dušika enak parnemu tlaku snovi. Pri trdnih snoveh se odvisno od območja tlaka in temperature uporabljajo manometrske tekočine iz 1.6.2.1. Izboklina na daljšem kraku izoteniskopa se napolni z razplinjeno manometrsko tekočino. Potem se preskusna trdna snov da v bučko in razplini pri zvišani temperaturi. Nato se izoteniskop nagne tako, da manometrska tekočina steče v U-cevko. Parni tlak kot funkcija temperature se izmeri v skladu z 1.6.2.

1.6.4 Efuzijska metoda: Parnotlačna tehtnica

1.6.4

1.6.4.1 Aparatura V literaturi je opisanih več različic aparature (1). Tukaj opisana aparatura prikazuje glavni princip te metode (slika 4). Na sliki 4 so glavni sestavni deli aparature: visokovakuumska posoda iz nerjavečega jekla ali stekla, oprema za ustvarjanje in merjenje vakuuma ter vgrajeni deli za merjenje parnega tlaka na tehtnici. V aparaturo so vključeni naslednji vgrajeni sestavni deli:

uparjalna peč s prirobnico in vrtljivim dovodom. Uparjalna peč je valjasta posoda npr. iz bakra ali kemično odporne zlitine z dobro toplotno prevodnostjo. Lahko se uporabi tudi steklena posoda z bakreno oblogo. Polmer peči je približno 3 do 5 cm in višina 2 do 5 cm. Peč ima eno do tri odprtine različnih velikosti za tok pare. Peč se segreva bodisi z grelno ploščo pod njo bodisi z grelno spiralo, ovito okoli njene zunanje strani. Da se prepreči izguba toplote preko osnovne plošče, se grelnik pritrdi na osnovno ploščo s toplotno slabo prevodno kovino (nikelj-srebrovo ali krom-nikljevo jeklo), npr. nikelj-srebrova cev, pritrjena na vrtljivi dovod, če se uporabi peč z več odprtinami. Prednost take konstrukcije je, da se lahko doda bakrena palica. To omogoča hlajenje od zunaj s pomočjo hladilne kopeli,

če ima bakreni pokrov tri odprtine različnih premerov, ki ležijo pod kotom 90o ena na drugo, se lahko zajamejo različna območja parnega tlaka v celotnem merilnem območju (premer odprtin med približno 0,30 in 4,50 mm). Velike odprtine se uporabijo za nizek parni tlak in obratno. Z vrtenjem peči se lahko nastavi želena odprtina ali vmesni položaj na tok pare (odprtina peči – zaslon – skodelica tehtnice) in tako sprosti curek molekul ali ga skozi odprtino peči preusmeri na skodelico tehtnice. Za merjenje temperature snovi se na primerno točko namesti termočlen ali uporovni termometer,

nad zaslonom je posodica zelo občutljive mikrotehtnice (glej spodaj). Premer skodelice tehtnice je približno 30 mm. Primeren material je pozlačen aluminij,

skodelico tehtnice obdaja valjasta medeninasta ali bakrena hladilna posoda. Odvisno od vrste tehtnice, ima odprtine za gredeljnico tehtnice in odprtino v zaslonu za curek molekul ter bi morala zagotavljati popolno kondenzacijo pare na skodelici tehtnice. Odvajanje toplote navzven omogoča npr. bakrena palica, povezana s hladilno posodo. Palica je napeljana skozi osnovno ploščo in od nje toplotno izolirana, npr. s krom-nikljevo jekleno cevjo. Palica je potopljena v tekoči dušik v Dewarjevi posodi pod osnovno ploščo ali pa tekoči dušik kroži skoznjo. Temperatura hladilne posode se tako vzdržuje pri –120 oC. Skodelica tehtnice se hladi izključno s sevanjem in sicer ustrezno glede na preučevano območje tlaka (hlajenje približno 1 uro pred začetkom merjenja),

tehtnica se namesti nad hladilno posodo. Ustrezne tehtnice so npr. zelo občutljiva dvokraka elektronska mikrotehtnica (8) ali zelo občutljiv inštrument z vrtljivo tuljavo (glej Smernico za preskušanje OECD 104, izdano 12.5.81),

v osnovno ploščo so vgrajeni tudi električni priključki za termočlene (ali uporovne termometre) in grelne spirale,

v posodi se ustvari vakuum z uporabo delne vakuumske črpalke ali visokovakuumske črpalke (potreben je vakuum približno 1 do 2 × 0–3 Pa, ki se doseže po 2 h črpanja). Tlak se uravnava s primernim ionizacijskim manometrom.

1.6.4.2 Merilni postopek Posoda se napolni s preskusno snovjo in zapre s pokrovom. Zaslon in hladilna posoda se potisneta čez peč. Aparatura se zapre in vključijo se vakuumske črpalke. Končni tlak pred začetkom merjenja mora biti približno 10–4 Pa. Hlajenje hladilne posode se začne pri 10–2 Pa. Ko se doseže potrebni vakuum, začnemo umeritveni niz pri najnižji potrebni temperaturi. Nastavi se ustrezna odprtina v pokrovu, curek pare gre skozi zaslon neposredno nad odprtino in zadene ob ohlajeno skodelico tehtnice. Skodelica tehtnice mora biti dovolj velika, da jo zadene celotni curek, usmerjen skozi zaslon. Gibalna količina parnega curka deluje kot sila na skodelico tehtnice in molekule se kondenzirajo na njeni hladni površini. Gibalna količina in sočasna kondenzacija povzročita signal na zapisovalniku. Ovrednotenje signala da dve informaciji: p = G 2 π RT×103M pri čemer je: G hitrost izhlapevanja (kg s-1 m-2) M molska masa (g mol-1) T temperatura (K) R splošna plinska konstanta (J mol-1 K-1) p parni tlak (Pa) Ko se doseže potrebni vakuum, začnemo niz meritev pri najnižji želeni merilni temperaturi. Za nadaljnje meritve se temperatura dviga v majhnih intervalih, dokler se ne doseže najvišja želena temperatura. Vzorec se potem spet ohladi in lahko se zapiše druga krivulja parnega tlaka. Če drugi niz meritev ne potrdi rezultatov prvega, je možno, da snov v temperaturnem območju meritev razpada.

1.6.4.2

1. v opisani aparaturi se parni tlak določi neposredno iz gibalne količine na skodelici tehtnice (za to ni potreben podatek o molski masi (2)). Pri vrednotenju meritev je treba upoštevati geometrijske dejavnike, kakršna sta odprtina peči in kot molekulskega curka;

2. hkrati se lahko izmeri masa kondenzata in iz tega izračuna hitrost izhlapevanja. Parni tlak se lahko izračuna tudi iz hitrosti izhlapevanja in molske mase po Hertzovi enačbi (2).

1.6.5 Efuzijska metoda – z izgubo mase

1.6.5

1.6.5.1 Aparatura Efuzijsko aparaturo sestavljajo naslednji osnovni deli: Na sliki 5 je na primer prikazana električno ogrevana aluminijasta vakuumska posoda s 4 efuzijskimi celicami iz nerjavečega jekla. Folija iz nerjavečega jekla, debela približno 0,3 mm, ima efuzijsko odprtino s premerom 0,2 do 1,0 mm in je pritrjena na efuzijsko celico z navojnim pokrovom.

posoda, ki jo je mogoče termostatirati in odzračiti in v kateri so efuzijske celice,

visokovakuumska črpalka (npr. difuzijska črpalka ali turbomolekularna črpalka) z vakuummetrom,

past s tekočim dušikom ali suhim ledom.

1.6.5.2 Merilni postopek V vsako efuzijsko celico se da referenčna in preskusna snov, kovinska membrana z odprtino se pritrdi z navojnim pokrovom in vsaka celica se stehta do 0,1 mg točno. Celica se postavi v termostatirano aparaturo, ki se nato odzrači do tlaka, nižjega od ene desetine pričakovanega tlaka. V opredeljenih časovnih intervalih od 5 do 30 ur se v aparaturo spusti zrak in s ponovnim tehtanjem določi izguba mase efuzijskih celic. Da se zagotovi, da na rezultate ne vplivajo hlapne nečistote, se celice ponovno tehtajo v opredeljenih časovnih intervalih, s čimer se preveri, ali je hitrost izparevanja konstantna v najmanj dveh takih intervalih. Parni tlak p v efuzijski celici je izražen z: p = mKAt2 π R TM pri čemer je: P parni tlak (Pa) m masa snovi, ki zapusti celico v času t (kg) T čas (s) A ploščina odprtine (m2) K korekcijski faktor R splošna plinska konstanta (J mol-1 K-1) T temperatura (K) M molska masa (kg mol-1) Korekcijski faktor K je odvisen od razmerja med dolžino in polmerom valjaste odprtine: razmerje 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Zgornja enačba se lahko zapiše: p = E mtTM pri čemer je E = 1KA2πR in je konstantna za efuzijsko celico. Konstanta efuzijske celice E se lahko določi z referenčnimi snovmi (2,9) po naslednji enačbi: E = p(r)tmM(r)T pri čemer je: p(r) parni tlak referenčne snovi (Pa) M(r) molska masa referenčne snovi (kg × mol-l)

1.6.6 Metoda z nasičenjem plina

1.6.6

1.6.6.1 Aparatura Značilna aparatura za ta preskus je sestavljena iz več delov, prikazanih na sliki 6a in opisanih spodaj (1).

1.6.6.1 Inertni plin:

Nosilni plin ne sme kemijsko reagirati s preskusno snovjo. Dušik običajno zadošča za ta namen, občasno pa je treba uporabiti druge pline (10). Uporabljen plin mora biti suh (glej sliko 6a, točko 4: senzor relativne vlažnosti).

Uravnavanje pretoka:

Potreben je ustrezen plinski kontrolni sistem, da se zagotovi konstanten izbrani pretok skozi saturacijsko kolono.

Pasti za zbiranje pare:

Odvisni so od značilnosti posameznega vzorca in izbrane analitske metode. Paro je treba uloviti kvantitativno in v obliki, ki omogoča poznejšo analizo. Za nekatere preskusne snovi so primerne pasti, ki vsebujejo tekočine, kot je heksan ali etilen glikol. Za druge se lahko uporabljajo trdni absorbenti. Za določitev količine snovi, ki jo prenese znana količina nosilnega plina, se namesto lovljenja pare in poznejše analize lahko uporabijo neposredne analitske tehnike, kot je kromatografija. Lahko se izmeri tudi izguba mase vzorca.

Toplotni izmenjevalnik:

Za merjenje pri različnih temperaturah bo morda treba v sestav vključiti toplotni izmenjevalnik.

Saturacijska kolona:

Preskusna snov se iz raztopine nanese na primerno inerten nosilec. Z obloženim nosilcem se napolni saturacijska kolona, dimenzije in pretok katere morajo biti takšni, da je zagotovljeno popolno nasičenje nosilnega plina. Saturacijsko kolono je treba termostatirati. Za meritve pri temperaturah nad sobno je treba del med saturacijsko kolono in pastmi ogrevati, da se prepreči kondenzacija preskusne snovi. Da se zmanjša prenos mase z difuzijo, se za saturacijsko kolono lahko namesti kapilara (slika 6b).

1.6.6.2 Merilni postopek

1.6.6.2 Priprava saturacijske kolone:

Raztopina preskusne snovi v zelo lahko hlapnem topilu se doda primerni količini nosilca. Dodati je treba zadostno količino preskusne snovi, da se vzdržuje nasičenost ves čas preskusa. Topilo naj popolnoma izpari na zraku ali v rotacijskem uparjalniku, nato se temeljito premešan material doda v saturacijsko kolono. Po termostatiranju vzorca se skozi aparaturo spusti suhi dušik.

Merjenje:

Pasti ali detektor za neposredno analizo se poveže z odtočno cevko kolone in zapiše se čas. Pretok se preverja na začetku in v enakomernih intervalih med preskusom z merilnikom mehurčkov (ali ves čas z merilnikom masnega pretoka). Treba je izmeriti tlak pri izhodu iz saturatorja. To se lahko stori bodisi tako: Čas, potreben za to, da se zbere zadostna količina preskusne snovi za različne analitske metode, se določi s predhodnimi preskusi ali ocenami. Namesto zbiranja snovi za nadaljnjo analizo se lahko uporabi neposredna kvantitativna analitska tehnika (npr. kromatografija). Pred izračunom parnega tlaka pri dani temperaturi je treba izvesti predhodne preskuse, da se določi največji pretok, ki popolnoma nasiti nosilni plin s paro snovi. To je zagotovljeno, če se nosilni plin uvaja skozi saturator dovolj počasi, tako da manjši pretok ne daje nič večjega izračunanega parnega tlaka. Analitska metoda se določi glede na naravo preskusne snovi (npr. plinska kromatografija ali gravimetrija). Določi se količina snovi, ki jo prenese znan volumen nosilnega plina.

(a) da se med saturator in pasti priključi merilnik tlaka (to morda ne bo primerno, ker poveča mrtvi prostor in adsorpcijsko površino) bodisi

(b) da se določi padec tlaka v posameznem sistemu pasti kot funkcija pretoka v ločenem preskusu (to morda ne bo ustrezno za tekočinske pasti).

1.6.6.3 Izračun parnega tlaka Parni tlak se izračuna iz gostote pare, W/V, po enačbi: p = WV × RTM pri čemer je: P parni tlak (Pa) W masa uparjene preskusne snovi (g) V volumen nasičenega plina (m3) R splošna plinska konstanta (J mol-1 K-1) T temperatura (K) M molska masa preskusne snovi (g mol-1) Izmerjene volumne je treba popraviti glede na razlike v tlaku in temperaturi med merilnikom pretoka in termostatiranim saturatorjem. Če je merilnik pretoka glede na smer toka za pastjo pare, bodo morda potrebne korekcije, da se upošteva morebitna uparjena vsebina pasti(1).

1.6.7 Rotorska metoda (8, 11, 13)

1.6.7

1.6.7.1 Aparatura Metoda z rotorjem se lahko izvede z uporabo merilnika viskoznosti z rotorjem, prikazanega na sliki 8. Shematski prikaz postavitve preskusa kaže slika 7. Značilno merilno aparaturo sestavljajo vrteči rotorski merilnik, postavljena v termostatirano posodo (uravnavanje na 0,1 oC natančno). Posoda z vzorcem se postavi v termostatirano posodo (uravnavanje na 0,01 oC natančno), vsi ostali deli sestava pa se vzdržujejo pri višji temperaturi, da se prepreči kondenzacija. Visokovakuumska črpalka se priključi na sistem preko visokovakuumskih ventilov. Vrteči rotorski merilnik sestavlja jeklena kroglica (premera 4 do 5 mm) v cevi. Kroglica se postavi v magnetno polje in stabilizira, tako da lebdi, običajno s kombinacijo trajnih magnetov in kontrolnih tuljav. Vrtenje kroglice povzročajo rotirajoča polja tuljave. Sprejemne tuljave, ki merijo stalno prisotno šibko lateralno magnetizacijo kroglice, omogočajo merjenje hitrosti njenega vrtenja.

1.6.7.2 Merilni postopek Ko kroglica doseže določeno hitrost vrtenja v(o) (običajno približno 400 vrtljajev na sekundo), se ustavi dotok energije in zaradi trenja, ki ga povzroča plin, se vrtenje upočasni. Padec vrtilne hitrosti se meri kot funkcija časa. Ker je trenje, ki ga povzroča lebdenje v magnetnem polju zanemarljivo v primerjavi s trenjem plina, tlak plina p opisuje enačba: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) pri čemer je: c— povprečna hitrost plinskih molekul r polmer kroglice ρ masna gostota kroglice σ koeficient tangencialnega prenosa momenta (e = 1 za idealno krogelno površino kroglice) t čas v(t) hitrost vrtenja po času t v(o) začetna hitrost vrtenja Ta enačba se lahko zapiše tudi na naslednji način: p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 kjer sta tn, tn - 1 časa, potrebna za določeno število vrtljajev N. Časovna intervala tn in tn-1 si sledita in tn > tn-1. Povprečna hitrost plinskih molekul c—, se opiše z enačbo: c— = 8 RTπ M12 pri čemer je: T temperatura R splošna plinska konstanta M molska masa

2. PODATKI Pri kateri koli od navedenih metod je treba parni tlak določiti pri najmanj dveh temperaturah. Za preverjanje linearnosti krivulje parnega tlaka so zaželene najmanj tri temperature v območju od 0 do 50 oC.

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije: Če pride do prehoda (spremembe stanja, razpada), je treba navesti naslednje podatke: Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi.

uporabljena metoda,

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote) in predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno,

najmanj po dve vrednosti parnega tlaka in temperature, po možnosti v območju 0 do 50 oC,

vsi neobdelani podatki,

krivulja log p v odvisnosti od 1/T,

ocenjeni parni tlak pri 20 ali 25 oC.

vrsta spremembe,

temperatura, pri kateri pride do spremembe pri atmosferskem tlaku,

parni tlak pri 10 in 20 oC pod temperaturo prehoda in pri 10 in 20 oC nad to temperaturo (razen če gre za prehod iz trdnega v plinasto agregatno stanje).

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)

VIRI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final. Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593. NF T 20-048 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, VoI. 5 (4), 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, Vol. 7, 1173. B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), 642. G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, voI. 20 (4), 1148. J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, Vol. 3 (3), 1715.

A.5 POVRŠINSKA NAPETOST

A.5

1. METODA Opisane metode temeljijo na smernici za preskušanje OECD (1). Temeljna načela so navedena v viru (2).

1.

1.1 UVOD Opisane metode se uporabljajo za merjenje površinske napetosti vodnih raztopin. Pred izvajanjem teh preskusov je koristno imeti predhodne informacije o topnosti snovi v vodi, njeni zgradbi, hidrolitskih lastnostih in kritični koncentraciji za tvorbo micel. Metode, ki sledijo, so uporabne za večino kemijskih snovi, brez kakršnih koli omejitev glede njihove stopnje čistosti. Merjenje površinske napetosti z metodo tenziometra z obročkom je omejeno na vodne raztopine z dinamično viskoznostjo pod približno 200 mPa s.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Prosto površinsko entalpijo na enoto površine imenujemo površinska napetost. Površinska napetost se navede v: N/m (enota SI) ali mN/m (podenota SI) 1 N/m = 103 din/cm 1 mN/m = 1 din/cm v zastarelem sistemu cgs

1.3 REFERENČNE SNOVI Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preučuje nova snov. Predvsem naj bi se uporabljale za občasno preverjanje učinkovitosti metode in za omogočanje primerjave z rezultati drugih metod. Referenčne snovi, ki zajemajo široko območje površinskih napetosti, so navedene v virih 1 in 3.

1.4 PRINCIP METOD Metode temeljijo na merjenju največje navpične sile, ki jo je treba uporabiti na zanki ali obročku v stiku s površino preiskovane tekočine v merilni posodici, da bi ga ločili od te površine, ali na ploščici, katere rob se stika s površino, da bi potegnili nastali film navzgor. Snovi, ki so topne v vodi vsaj pri koncentraciji 1 mg/l, se preskušajo v vodni raztopini pri eni sami koncentraciji.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Natančnost teh metod je večja, kot je to običajno potrebno za okoljsko presojo.

1.6 OPIS METOD Pripravi se raztopina snovi v destilirani vodi. Koncentracija te raztopine mora biti 90 % koncentracije nasičene raztopine te snovi v vodi; kadar ta koncentracija presega 1 g/l, se za preskušanje uporabi koncentracija 1 g/l. Snovi, katerih topnost v vodi je manjša od 1 mg/l, ni treba preskušati.

1.6

1.6.1 Metoda s ploščico Glej ISO 304 in NF T 73-060 (Površinsko aktivne snovi – določanje površinske napetosti z dviganjem tekočinskih filmov).

1.6.2 Metoda z zanko Glej ISO 304 in NF T 73-060 (Površinsko aktivne snovi – določanje površinske napetosti z dviganjem tekočinskih filmov).

1.6.3 Metoda z obročkom Glej ISO 304 in NF T 73-060 (Površinsko aktivne snovi – določanje površinske napetosti z dviganjem tekočinskih filmov).

1.6.4 Usklajena metoda OECD z obročkom

1.6.4

1.6.4.1 Aparatura Za to merjenje so primerni na trgu dostopni tenziometri. Sestavljajo jih naslednji deli:

premična mizica za vzorec,

sistem za merjenje sile,

merilno telo (obroček),

merilna posoda.

1.6.4.1

1.6.4.1.1 Premična mizica za vzorec Premična mizica za vzorec se uporablja kot podpora za termostatirano merilno posodo, v kateri je preskusna tekočina. Skupaj s sistemom za merjenje sile je nameščena na stojalu.

1.6.4.1.2 Sistem za merjenje sile Sistem za merjenje sile (glej sliko) je nad mizico za vzorec. Napaka pri merjenju sile ne sme presegati ± 10-6 N, kar ustreza meji napake ±0,1 mg pri določanju mase. Merilna skala na trgu dostopnih tenziometrov je v večini primerov umerjena v mN/m, tako da se lahko površinska napetost odčita neposredno v mN/m na 0,1 mN/m točno.

1.6.4.1.3 Merilno telo (obroček) Obroček je običajno narejen iz platina-iridijeve žice, debele približno 0,4 mm, in s povprečnim obsegom 60 mm. Žičnati obroček visi v vodoravnem položaju s kovinske zaponke in žičnatega namestitvenega nosilca, tako da je povezan s sistemom za merjenje sile (glej sliko).

1.6.4.1.3 Slika Merilno telo

(Vse dimenzije so v milimetrih) Kovinska zaponka Namestitveni nosilec Obroček

1.6.4.1.4 Merilna posoda Merilna posoda, v kateri je preskusna raztopina, je termostatirana steklena posoda. Zasnovana je tako, da med merjenjem temperatura preskusne raztopine in plinske faze nad njeno površino ostane konstantna ter vzorec ne more izhlapeti. Sprejemljive so valjaste steklene posode z notranjim premerom najmanj 45 mm.

1.6.4.2 Priprava aparature

1.6.4.2

1.6.4.2.1 Čiščenje Steklene posode se temeljito očistijo. Če je potrebno, se operejo z vročo kromžveplovo kislino in nato z gosto tekočo fosforjevo kislino (83 do 98 masnih % H3PO4), temeljito sperejo pod tekočo vodo in nazadnje še z dvakrat destilirano vodo do nevtralne reakcije, nato se posušijoali splaknejo z delom preskusne tekočine. Obroček se najprej temeljito splakne z vodo, da se odstranijo vse v vodi topne snovi, nato se za kratek čas potopi v kromžveplovo kislino, opere v dvakrat destilirani vodi do nevtralne reakcije ter na koncu na hitro segreje nad metanolnim plamenom. Opomba: Nečistote, ki niso topne ali razgradljive v kromžveplovi ali fosforjevi kislini, na primer silikoni, se odstranijo z ustreznim organskim topilom.

1.6.4.2.2 Umerjanje aparature Validacija aparature obsega preverjanje ničelne točke in njeno naravnavo, tako da je omogočeno zanesljivo odčitavanje z instrumenta v mN/m.

1.6.4.2.2 Postavitev:

Aparatura se izravna, na primer s pomočjo vodne tehtnice na osnovni plošči tenziometra, z nastavitvijo izravnalnih vijakov na osnovni plošči.

Naravnava ničelne točke:

Po namestitvi obročka na aparaturo in pred potopitvijo v tekočino se tenziometer naravna na ničlo ter preveri, ali je obroček vzporeden s površino tekočine. V ta namen se površina tekočine lahko uporabi kot ogledalo.

Umeritev:

Dejansko umerjanje se lahko opravi po enem od dveh postopkov:

(a) Z uporabo mase: postopek z uporabo jahačev z znano maso med 0,1 in 1,0 g, postavljenih na obroček. Umeritveni faktor Φa, s katerim je treba pomnožiti vse odčitke z instrumenta, se določi po enačbi (1): Φa=σrσa (1) pri čemer je: σr=mg2b (mN/m) m masa jahača (g) g gravitacijski pospešek (981 cm s-2 na morski višini) b povprečni obseg obročka (cm) σa odčitek tenziometra po namestitvi jahača na obroček (mN/m).

(b) Z uporabo vode: postopek z uporabo čiste vode, katere površinska napetost pri, na primer, 23 oC je 72,3 mN/m. Ta postopek je hitrejši od masnega umerjanja, vendar vedno obstaja nevarnost, da je površinska napetost vode napačna zaradi sledov onesnaženja s površinsko aktivnimi snovmi. Umeritveni faktor Φb, s katerim je treba pomnožiti vse odčitke z instrumenta, se določi po enačbi (2): Φb=σoσg (2) pri čemer je: σo površinska napetost vode, navedena v literaturi (mN/m) σg izmerjena površinska napetost vode (mN/m), obe pri isti temperaturi.

1.6.4.3 Priprava vzorcev Pripravijo se vodne raztopine preskusnih snovi v potrebnih koncentracijah in ne smejo vsebovati nobenih neraztopljenih snovi. Vzdrževati je treba konstantno temperaturo (±0,5 oC) raztopine. Ker se površinska napetost raztopine v merilni posodi spreminja s časom, se izvede več meritev ob različnih časih in izdela krivulja, ki prikazuje površinsko napetost kot funkcijo časa. Ko ni več nadaljnjih sprememb, je doseženo stanje ravnotežja. Onesnaženje z drugimi snovmi v obliki prahu in plinov moti merjenje. Zato se delo izvaja pod zaščitnim pokrovom.

1.6.5 Preskusni pogoji Merjenje se opravi pri približno 20 oC, ob vzdrževanju konstantne temperature ±0,5 oC.

1.6.6 Izvedba preskusa Merjena raztopina se nalije v dobro očiščeno merilno posodo, pri čemer je treba paziti, da se ne peni, nato se merilna posoda postavi na mizico preskusne aparature. Vrh mizice z merilno posodo se dviga, dokler se obroček ne potopi pod površino merjene raztopine. Nato se vrh mizice postopoma in enakomerno spušča (s hitrostjo približno 0,5 cm/min), da bi se obroček odtrgal od površine, dokler se ne doseže največja sila. Tekoča plast, ki se drži obročka, se od njega ne sme ločiti. Po končani meritvi se obroček spet potopi pod površino in merjenja ponavljajo, dokler se ne doseže konstantna vrednost površinske napetosti. Za vsako meritev se zapiše čas, ki je minil od ulitja tekočine v merilno posodo. Vrednost se odčita pri največji sili, potrebni za odtrganje obročka od površine tekočine.

2. Tabela Popravljanje izmerjene površinske napetosti Le za vodne raztopine, ρ = 1 g/cm3

PODATKI Za izračun površinske napetosti se vrednost, odčitana z aparature v mN/m, najprej pomnoži z umeritvenim faktorjem Φa ali Φb (odvisno od uporabljenega umeritvenega postopka). Dobljena vrednost je le približna in jo je treba popraviti. Harkins in Jordan (4) sta empirično določila korekcijske faktorje za vrednosti površinske napetosti, izmerjene z metodo z obročkom, ki so odvisni od dimenzij obročka, gostote tekočine in njene površinske napetosti. Ker je postopek določanja korekcijskega faktorja za vsako posamezno meritev iz Harkinsovih in Jordanovih tabel dolgotrajen, se lahko za izračun površinske napetosti vodnih raztopin uporabi poenostavljeni postopek odčitavanja popravljenih vrednosti površinskih napetosti neposredno iz tabele. (Za odčitke med vrednostmi v tabeli se uporabi interpolacija.) r = 9,55 mm (povprečni polmer obročka) r = 0,185 mm (polmer žice obročka) Izmerjena vrednost (mN/m) Popravljena vrednost (mN/m) Umeritev z maso (glej 1.6.4.2.2(a)) Umertlev z vodo (glej 1.6.4.2.2(b)) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Ta tabela je bila sestavljena na podlagi Harkins-Jordanovega popravka. Podobna je tabeli iz standarda DIN (DIN 53914) za vodo in vodne raztopine (gostota ρ = 1 g/cm3) in velja za na trgu dostopen obroček z dimenzijami R = 9,55 mm (povprečni polmer obročka) in r = 0,185 mm (polmer žice obročka). V tabeli so popravljene vrednosti za meritve površinske napetosti, opravljene po umeritvi z utežmi ali vodo. Druga možnost je, da se brez predhodne umeritve površinska napetost izračuna po naslednji enačbi: σ=fxF4πR pri čemer je: F sila, izmerjena z dinamometrom, tik preden film poči R polmer obročka f korekcijski faktor (1)

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

uporabljena metoda,

vrsta uporabljene vode ali raztopine,

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

rezultati merjenja: površinska napetost (odčitek), tako posamezni odčitki kot tudi njihova aritmetična sredina in popravljena aritmetična sredina (upoštevajoč faktor opreme in korekcijsko tabelo),

koncentracija raztopine,

temperatura preskusa,

starost uporabljene raztopine; zlasti čas, pretekel od priprave do meritve raztopine,

opis časovne odvisnosti površinske napetosti po prenosu raztopine v merilno posodo,

informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi.

3.2 RAZLAGA REZULTATOV Glede na to, da je površinska napetost destilirane vode 72,75 mN/m pri 20 oC, je treba snovi, katerih površinska napetost pri pogojih te metode je manjša od 60 mN/m, šteti za površinsko aktivne snovi.

4.(1)(2)(3)(4)

VIRI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.

A.6 TOPNOST V VODI

A.6

1. METODA Opisane metode temeljijo na smernici za preskušanje OECD (1).

1.

1.1 UVOD Za izvajanje tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o strukturni formuli, parnem tlaku, disociacijski konstanti in hidrolizi (kot funkciji pH) snovi. Na voljo ni nobene posamezne metode, ki bi zajela celotno območje topnosti v vodi. Spodaj opisani metodi zajemata celotno območje topnosti, vendar nista primerni za hlapne snovi: Na topnost preskusne snovi v vodi lahko znatno vpliva prisotnost nečistot.

prva, imenovana metoda z izpiranjem kolone, se uporablja za v glavnem čiste snovi z majhno topnostjo (< 10-2 gramov na liter), ki so stabilne v vodi,

druga, imenovana metoda z bučko, se uporablja za v glavnem čiste snovi z večjo topnostjo (> 10-2 gramov na liter), ki so stabilne v vodi.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Topnost snovi v vodi določa masna koncentracija nasičene raztopine te snovi v vodi pri določeni temperaturi. Topnost v vodi se izrazi v enotah mase na volumen raztopine. Enota SI je kg/m3 (lahko se uporabljajo tudi grami na liter).

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Z enostavnim predhodnim preskusom je treba določiti približno količino vzorca in čas, ki sta potrebna, da se doseže koncentracija nasičenja.

1.4

1.4.1 Metoda z izpiranjem kolone Ta metoda temelji na izpiranju preskusne snovi z vodo iz mikro-kolone, ki je napolnjena z inertnim pomožnim materialom, kot so steklene kroglice ali pesek, prevlečenim s presežkom preskusne snovi. Topnost v vodi se določi, ko je masna koncentracija eluata konstantna. To se pokaže kot konstantna raven koncentracije v odvisnosti od časa.

1.4.2 Metoda z bučko Pri tej metodi se snov (trdne snovi je treba uprašiti) raztopi v vodi pri temperaturi, ki je nekoliko višja od temperature preskusa. Ko se doseže nasičenost, se zmes ohladi do temperature preskusa, nato se hrani pri tej temperaturi in meša, dokler se ne vzpostavi ravnotežje. Druga možnost je, da se meritev izvede neposredno pri temperaturi preskusa, če se z ustreznim vzorčenjem zagotovi, da je doseženo ravnotežje nasičenja. Nato se z ustrezno analitsko metodo določi masna koncentracija snovi v vodni raztopini, ki ne sme vsebovati nobenih neraztopljenih delcev.

1.5 MERILA KAKOVOSTI

1.5

1.5.1 Ponovljivost Pri metodi z izpiranjem kolone se lahko doseže ponovljivost < 30 %; pri metodi z bučko je treba doseči ponovljivost < 15 %.

1.5.2 Občutljivost Ta je sicer odvisna od analitske metode, vendar se masna koncentracija lahko določi do najmanj 10-6 gramov na liter.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Preskusni pogoji Preskus se po možnosti opravi pri 20 ±0,5 oC. Če se domneva, da je topnost odvisna od temperature (> 3 % na oC), se izvede še pri dveh drugih temperaturah, najmanj 10 oC nad in pod izbrano temperaturo. V tem primeru je treba temperaturo vzdrževati na ±0,1 oC. Izbrana temperatura mora biti konstantna v vseh bistvenih delih opreme.

1.6.2 Predhodni preskus Približno 0,1 g vzorca (trdne snovi je treba uprašiti) v 10 ml-merilnem valju s steklenim zamaškom se dodajajo vedno večje količine destilirane vode sobne temperature po korakih, prikazanih v spodnji tabeli: 0,1 g topen v x ml vode 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Približna topnost (grami na liter) > 1000 1000 do 200 200 do 100 100 do 50 50 do 10 10 do 1 < 1 Po vsakem dodatku navedene količine vode se zmes 10 minut močno stresa, nato se vizualno preveri, ali so v vzorcu prisotni neraztopljeni delci. Če po dodatku 10 ml vode vzorec ali del vzorca ostane neraztopljen, se preskus ponovi v 100 ml-merilnem valju z večjimi količinami vode. Pri manjši topnosti je lahko čas, potreben za raztopitev snovi, občutno daljši (počakati je treba najmanj 24 h). Približna topnost je navedena v tabeli pod tisto količino dodane vode, pri kateri se je vzorec popolnoma raztopil. Če je snov še vedno navidez netopna, je treba počakati več kot 24 h (največ 96 h) ali pa jo je treba še dodatno razredčiti, da se ugotovi, ali je treba uporabiti metodo za določanje topnosti z izpiranjem kolone ali metodo z bučko.

1.6.3 Metoda z izpiranjem kolone

1.6.3

1.6.3.1 Nosilec, topilo in eluent Nosilec pri metodi z izpiranjem kolone mora biti inerten. Možna materiala sta steklene kroglice in pesek. Za nanašanje preskusne snovi na nosilec je treba uporabiti ustrezno analitsko čisto hlapno topilo. Kot eluent je treba uporabiti vodo, dvakrat destilirano v stekleni ali kremenčevi aparaturi. Opomba: Ne sme se uporabiti voda neposredno iz organskega ionskega izmenjevalca.

1.6.3.2 Nanašanje na nosilec Približno 600 mg nosilca se stehta in prenese v 50 ml-bučko z okroglim dnom. Ustrezna stehtana količina preskusne snovi se raztopi v izbranem topilu. Primerna količina te raztopine se doda nosilcu. Topilo mora popolnoma upareti, npr. v rotavaporju, sicer se nosilec ne nasiti z vodo zaradi porazdelitvenih učinkov na površini nosilca. Nanašanje na nosilec lahko povzroči težave (napačne rezultate), če se preskusna snov poseda kot olje ali drugačna kristalinična faza. Take težave je treba preučiti s poskusi in o tem poročati. Nosilec z naneseno preskusno snovjo se pusti namakati približno dve uri v približno 5 ml vode, nato se suspenzija prenese v mikrokolono. Druga možnost je, da se v mikrokolono, napolnjeno z vodo, natrese nosilec z naneseno preskusno snovjo in nato pusti približno dve uri, da se vzpostavi ravnotežje.

1.6.3.2 Preskusni postopek:

Izpiranje snovi iz nosilca se lahko izvede na enega od naslednjih dveh načinov:

z recirkulacijsko črpalko (glej sliko 1),

z nivojsko posodo (glej sliko 4).

1.6.3.3 Metoda z izpiranjem kolone z recirkulacijsko črpalko

1.6.3.3 Aparatura

Shematski prikaz značilnega sistema je predstavljen na sliki 1. Ustrezna mikrokolona je prikazana na sliki 2, čeprav je primerna kakršna koli velikost, pod pogojem, da izpolnjuje merila glede ponovljivosti in občutljivosti. Kolona mora biti dovolj velika, da je volumen predkolone najmanj petkrat tolikšen kot volumen polnitve in da sprejme najmanj pet vzorcev. Velikost kolone se lahko tudi zmanjša, če se uporabi nadomestno topilo, ki nadomesti prvotnih pet volumnov polnitve, odstranjenih z nečistotami. Kolono je treba povezati z recirkulacijsko črpalko, s pretočno zmogljivostjo približno 25 mLh. Črpalka se poveže s politetrafluoroetilenskimi (P.T.F.E.) in/ali steklenimi priključki. Ko sta kolona in črpalka sestavljeni, morata omogočati vzorčenje eluenta in vzpostavljanje ravnotežja v predkoloni pri atmosferskem tlaku. Material v koloni podpira majhen (5 mm) zamašek iz steklene volne, ki služi tudi za filtracijo delcev. Recirkulacijska črpalka je lahko na primer peristaltična črpalka ali membranska črpalka (treba je paziti, da material cevi ne povzroči onesnaženja in/ali absorpcije).

Merilni postopek

Tok se požene skozi kolono. Priporočljivo je, da se uporabi pretok približno 25 ml/h (to ustreza približno 10 volumnov polnitve za opisano kolono). Prvih pet (najmanj) volumnov polnitve se zavrže, da se odstranijo v vodi topne nečistote. Zatem naj vodna črpalka deluje do vzpostavitve ravnotežja, ki je opredeljeno s petimi zaporednimi vzorci, katerih koncentracije se med seboj ne razlikujejo za več kot ± 30 %. Časovni intervali med temi vzorci morajo ustrezati prehodu najmanj 10 volumnov polnitve.

1.6.3.4 Metoda z izpiranjem kolone z nivojsko posodo

1.6.3.4 Aparatura (glej sliki 4 in 3)

Nivojska posoda: Nivojska posoda se priključi s spojko iz brušenega stekla, ki je povezana s PTFE cevjo. Priporočljivo je, da se uporabi pretok približno 25 ml/h. Zberejo se zaporedne frakcije eluata in analizirajo z izbrano metodo.

Merilni postopek

Za določitev topnosti v vodi se uporabijo frakcije eluata iz srednjega območja, kjer so koncentracije konstantne (± 30 %) pri najmanj petih zaporednih frakcijah,. V obeh primerih (pri uporabi recirkulacijske črpalke ali nivojske posode) je treba opraviti drugo meritev pri polovičnem pretoku prve meritve. Če so rezultati obeh meritev skladni, je preskus zadovoljiv; če je pri manjšem pretoku navidezna topnost večja, je treba nadaljevati z razpolavljanjem pretoka, dokler ni topnost enaka pri dveh zaporednih meritvah. V obeh primerih (pri uporabi recirkulacijske črpalke ali nivojske posode) je treba preveriti, ali frakcije vsebujejo koloidne snovi, na kar kaže prisotnost Tyndallovega efekta (razpršitev svetlobe). Prisotnost takšnih delcev razveljavi rezultate in preskus je treba ponoviti z izboljšano filtracijo v koloni. Zapisati je treba pH vsakega vzorca. Drugo meritev je treba izvesti pri enaki temperaturi.

1.6.4 Metoda z bučko

1.6.4

1.6.4.1 Aparatura Za metodo z bučko je potreben naslednji material:

običajna laboratorijska steklovina in instrumentarij,

naprava, primerna za mešanje raztopin pri nadzorovanih konstantnih temperaturah,

centrifuga (po možnosti termostatirana), če je potrebna za emulzije, in

oprema za analitsko določanje.

1.6.4.2 Merilni postopek S predhodnim preskusom se oceni količina materiala, potrebna za nasičenje želenega volumna vode. Volumen potrebne vode bo odvisen od analitske metode in območja topnosti. V tri steklene posode s steklenimi zamaški (npr. centrifugirke, bučke) se zatehta po petkrat tolikšna količina snovi, kot je bila določena zgoraj. V vsako posodo se doda izbrani volumen vode, nato se posode tesno zamašijo. Vsebina zaprtih posod se meša pri 30 oC. (Uporabi se naprava za stresanje ali mešanje, ki je zmožna delovati pri konstantni temperaturi, npr. magnetno mešanje v termostatirani vodni kopeli). Po enem dnevu se ena od posod odstrani ter se 24 ur hrani na temperaturi preskusa in občasno pretrese, da se ponovno vzpostavi ravnotežje. Nato se vsebina posode centrifugira pri temperaturi preskusa in z ustrezno analitsko metodo se določi koncentracija preskusne snovi v bistri vodni fazi. S preostalima posodama se ravna podobno po začetnem vzpostavljanju ravnotežja pri 30 oC, ki naj traja pri eni dva in pri drugi tri dni. Če se dobljene koncentracije vsaj pri zadnjih dveh posodah ujemajo s predpisano ponovljivostjo, je preskus zadovoljiv. Če se pri posodah 1, 2 in 3 kaže težnja k naraščanju vrednosti, je treba celoten preskus ponoviti, pri čemer se uporabi daljši čas za vzpostavljanje ravnotežja,. Merilni postopek se lahko izvede tudi brez predinkubacije pri 30 oC. Da se oceni hitrost vzpostavljanja ravnotežje nasičenja, se vzorči, dokler čas mešanja nič več ne vpliva na koncentracijo preskusne raztopine. Zapisati je treba pH vsakega vzorca.

1.6.5 Analiza Za takšna določanja je zaželena uporaba analitske metode, ki je najbolj primerna za posamezno snov, ker lahko majhne količine topnih nečistot povzročijo velike napake pri izmerjeni topnosti. Primeri takšnih metod so: plinska ali tekočinska kromatografija, titracijske metode, fotometrične metode in voltmetrične metode.

2. PODATKI

2.

2.1 METODA Z IZPIRANJEM KOLONE Za vsako ponovitev je treba izračunati srednjo vrednost najmanj petih zaporednih vzorcev, vzetih pri točki nasičenosti, in standardna deviacija. Rezultati se navedejo v enotah mase na volumen raztopine. Primerjajo se srednje vrednosti, izračunane pri dveh preskusih pri različnih pretokih, in ponovljivost mora biti pod 30 %.

2.2 METODA Z BUČKO Navesti je treba posamezne rezultate za vsako od treh bučk, nato se izračuna srednja vrednost tistih rezultatov, ki se štejejo za konstantne (ponovljivost pod 15 %), in se navede v enotah mase na volumen raztopine. Kadar je topnost zelo velika (> 100 gramov na liter) bo morda treba enote mase ponovno pretvoriti v volumske enote z uporabo gostote.

3. POROČANJE

3.

3.1 METODA Z IZPIRANJEM KOLONE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

rezultati predhodnega preskusa,

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

posamezne koncentracije, pretok in pH za vsak vzorec,

srednje vrednosti in standardna deviacija za najmanj pet vzorcev, vzetih pri točki nasičenosti vsake ponovitve,

povprečje dveh zaporednih, sprejemljivih ponovitev,

temperatura vode med procesom nasičenja,

uporabljena analitska metoda,

vrsta uporabljenega nosilca,

nanašanje na nosilec,

uporabljeno topilo,

dokazi o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom in uporabljena metoda,

vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi.

3.2 METODA Z BUČKO V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

rezultati predhodnega preskusa,

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistot),

posamezne analitske določitve in povprečje, če je bilo za eno bučko določenih več vrednosti,

pH vsakega vzorca,

povprečje vrednosti različnih bučk, pri katerih so bili rezultati skladni,

temperatura preskusa,

uporabljena analitska metoda,

dokazi o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom in uporabljena metoda,

vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi.

4.(1)(2)(3) VIRI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final. NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method

A.8 PORAZDELITVENI KOEFICIENT

A.8

1. METODA Opisana metoda stresanja bučke temelji na smernici za preskušanje OECD (1).

1.

1.1 UVOD Za izvajanje tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o strukturni formuli, disociacijski konstanti, topnosti v vodi, hidrolizi, topnosti v n-oktanolu in površinski napetosti snovi. Pri snoveh, ki tvorijo ione, je treba meritve opraviti le z njihovo neionizirano obliko (prosta kislina ali prosta baza), pridobljeno z uporabo ustreznega pufra s pH, ki je najmanj eno enoto pod (prosta kislina) ali nad (prosta baza) pK. Ta preskusna metoda vključuje dva ločena postopka: metodo stresanja bučke in tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Prvi se uporablja, kadar je vrednost log Pow (opredelitve glej spodaj) v območju od -2 do 4, in drugi, kadar je v območju od 0 do 6. Pred izvedbo katerega koli postopka, je treba pridobiti predhodno oceno porazdelitvenega koeficienta. Metoda stresanja bučke se uporablja samo za v glavnem čiste snovi, topne v vodi in n-oktanolu. Ni uporabna za površinsko aktivne snovi (za katere je treba navesti izračunano vrednost ali oceno na podlagi topnosti v n-oktanolu in topnosti v vodi). Metoda HPLC ni uporabna za močne kisline in baze, kovinske komplekse, površinsko aktivne snovi ali snovi, ki reagirajo z eluentom. Za te snovi je treba navesti izračunano vrednost ali oceno na podlagi topnosti v n-oktanolu in topnosti v vodi. Metoda HPLC je manj občutljiva za prisotnost nečistot v preskusni snovi kakor metoda stresanja bučke. Vendar v nekaterih primerih lahko nečistote otežijo razlago rezultatov, ker postane določitev vrha negotova. Za zmesi, ki dajo nedoločen pas, se navedejo zgornja in spodnja meja log P.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Porazdelitveni koeficient (P) je torej količnik dveh koncentracij in se ponavadi navede v obliki logaritma z osnovo 10 (log P). pow=cn-OctanolcVoda Porazdelitveni koeficient (P) je opredeljen kot razmerje ravnotežnih koncentracij (c) raztopljene snovi v dvofaznem sistemu, sestavljenem iz dveh topil, ki se v glavnem ne mešata. V primeru n-oktanola in vode:

1.3 REFERENČNE SNOVI

1.3 Metoda stresanja bučke

Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preučuje nova snov. Predvsem naj bi se uporabljale za občasno preverjanje učinkovitosti metode in za omogočanje primerjave z rezultati drugih metod.

Metoda HPLC

Za določitev soodvisnosti med rezultati meritev s HPLC za snov in njeno vrednostjo P, je treba izdelati umeritveno krivuljo log P v odvisnosti od kromatografskih podatkov z uporabo najmanj 6 referenčnih točk. Uporabnik sam izbere primerne referenčne snovi. Kadar je le mogoče, naj ima najmanj ena referenčna snov večji in ena manjši Pow kot preskusna snov. Za vrednosti log P, manjše od 4, umeritev lahko temelji na podatkih, dobljenih z metodo stresanja bučke. Za vrednosti log P, večje od 4, umeritev lahko temelji na validiranih podatkih iz literature, če so skladni z izračunanimi vrednostmi. Za večjo točnost je priporočljivo izbrati referenčne snovi, ki so strukturno sorodne preskusni snovi. Na voljo so izčrpni seznami vrednosti log Pow za mnoge skupine kemikalij (2)(3). Če ni podatkov o porazdelitvenih koeficientih strukturno sorodnih snovi, se lahko uporabi bolj splošna umeritev z drugimi referenčnimi snovmi. Seznam priporočenih referenčnih snovi in njihovih vrednosti Pow je v dodatku 2.

1.4 PRINCIP METODE

1.4

1.4.1 Metoda stresanja bučke Za določitev porazdelitvenega koeficienta je treba vzpostaviti ravnotežje med vsemi medsebojno delujočimi komponentami sistema in določiti koncentraciji snovi, raztopljene v dveh fazah. Študija literature o tej temi kaže, da se v ta namen lahko uporabi več različnih tehnik, npr. temeljito mešanje dveh faz, ki mu sledi njuno ločevanje, da se ugotovi ravnotežna koncentracija preiskovane snovi.

1.4.2 Metoda HPLC HPLC se izvaja z analitskimi kolonami, napolnjenimi z na trgu dostopno trdno fazo, ki vsebuje dolge verige ogljikovodikov (npr. C8, C18), vezane na silicijev dioksid. Snovi, injicirane v tako kolono, potujejo vzdolž nje z različnimi hitrostmi, zaradi različne stopnje porazdelitve med mobilno fazo in stacionarno fazo ogljikovodikov. Zmesi snovi se eluirajo v vrstnem redu po hidrofobnosti, pri čemer se prve eluirajo vodotopne snovi in zadnje tiste, topne v olju, sorazmerno z njihovim porazdelitvenim koeficientom ogljikovodik/voda. To omogoča določitev razmerja med retenzijskim časom v taki koloni (z reverzno fazo) in porazdelitvenim koeficientom n-oktanol/voda. Porazdelitveni koeficient se določi s sklepanjem iz faktorja kapacitete k, opisanega z enačbo: molekula topila, da pride skozi kolono (mrtvi čas). k=tR-toto pri čemer je tR = retenzijski čas preskusne snovi in to = povprečni čas, ki ga potrebuje molekula topila, da pride skozi kolono (mrtvi čas). Kvantitativna analiza ni potrebna, treba je določiti le elucijske čase.

1.5 MERILA KAKOVOSTI

1.5

1.5.1 Ponovljivost

1.5.1 Metoda stresanja bučke

Da se zagotovi točnost porazdelitvenega koeficienta, je treba izvesti po dve vzporedni meritvi pri treh različnih preskusnih pogojih, pri čemer se lahko spreminjata količina navedene snovi in razmerje volumnov topil. Določene vrednosti porazdelitvenega koeficienta, izražene kot logaritmi z osnovo 10, morajo biti v območju ±0,3 log enot.

Metoda HPLC

Za povečanje zanesljivosti meritve, je treba izvesti dve vzporedni določitvi. Vrednosti log P, izpeljane iz posameznih meritev, naj bodo v območju ±0,1 enot log.

1.5.2 Občutljivost

1.5.2 Metoda stresanja bučke

Merilno območje metode je določeno z mejo detekcije analitskega postopka. Ta bi morala omogočiti določitev vrednosti log Pow v območju od –2 do 4 (občasno, kadar so izpolnjeni pogoji, se to območje lahko razširi do vrednosti log Pow 5), kadar koncentracija topljenca v nobeni fazi ni večja od 0,01 mola na liter.

Metoda HPLC

Metoda HPLC omogoča ocenjevanje porazdelitvenega koeficienta v območju log Pow od 0 do 6. Navadno se porazdelitveni koeficient lahko oceni do ± 1 enote log vrednosti, dobljene z metodo stresanja bučke. Značilne soodvisnosti so navedene v literaturi (4)(5)(6)(7)(8). Običajno se lahko doseže večja točnost, kadar korelacijske krivulje temeljijo na strukturno sorodnih referenčnih snoveh (9).

1.5.3 Specifičnost

1.5.3 Metoda stresanja bučke

Nernstov porazdelitveni zakon velja samo pri konstantnih temperaturi, tlaku in pH za razredčene raztopine. Nanaša se le na čiste snovi, porazdeljene med dve čisti topili. Če se v eni ali obeh fazah istočasno pojavi več različnih topljencev, lahko to vpliva na rezultate. Disociacija ali asociacija raztopljenih molekul lahko povzroči odstopanje od Nernstovega porazdelitvenega zakona. Na takšna odstopanja pokaže dejstvo, da postane porazdelitveni koeficient odvisen od koncentracije raztopine. Ker ta preskusna metoda zajema več ravnotežij, se ne sme uporabljati za snovi, ki jih je mogoče ionizirati, ne da bi se upošteval popravek. Pri takšnih snoveh je treba presoditi o uporabi pufrskih raztopin namesto vode; pH pufra se mora najmanj za eno enoto pH razlikovati od pKa snovi, pri čemer je treba upoštevati pomen tega pH za okolje.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Predhodna ocena porazdelitvenega koeficienta Porazdelitveni koeficient se po možnosti oceni z računsko metodo (glej dodatek 1) ali, kadar je primerno, iz razmerja topnosti preskusne snovi v čistih topilih (10).

1.6.2 Metoda stresanja bučke

1.6.2

1.6.2.1 Priprava n-Oktanol: Določitev porazdelitvenega koeficienta je treba opraviti z zelo čistimi analitskimi reagenti. Voda: treba je uporabiti vodo, destilirano ali dvakrat destilirano v stekleni ali kremenčevi aparaturi. Za snovi, ki jih je mogoče ionizirati, se uporabijo pufri, če je to upravičeno. Opomba: Ne sme se uporabiti voda, vzeta neposredno iz ionskega izmenjevalca.

1.6.2.1

1.6.2.1.1 Predhodno nasičenje topil Preden se določi porazdelitveni koeficient, se topili medsebojno nasitita s stresanjem pri temperaturi preskusa. To se najlaže izvede tako, da se dve veliki standardni steklenici zelo čistega analitskega n-oktanola ali vode, v vsaki od katerih je zadostna količina drugega topila, stresata 24 ur na mehanskem stresalniku, nato se pustita stati tako dolgo, da se fazi ločita in se vzpostavi stanje nasičenosti.

1.6.2.1.2 Priprava na preskus Celoten volumen dvofaznega sistema naj bo tolikšen, da skoraj v celoti napolni preskusno posodo. To bo pomagalo preprečiti izgubo topila zaradi izhlapevanja. Volumsko razmerje in količine snovi, ki se bodo uporabili, se določijo glede na: Opravijo se trije preskusi. Pri prvem se uporabi izračunano volumsko razmerje n-oktanol/voda; pri drugem se to razmerje deli z dve; pri tretjem pa se pomnoži z dve (npr. 1:1, 1:2, 2:1).

predhodno oceno porazdelitvenega koeficienta (glej zgoraj),

najmanjšo količino preskusne snovi, potrebno za analitski postopek, in

omejitvijo največje koncentracije v kateri koli fazi na 0,01 mola na liter.

1.6.2.1.3 Preskusna snov Pripravi se osnovna raztopina v n-oktanolu, predhodno nasičenem z vodo. Preden se ta osnovna raztopina uporabi za določanje porazdelitvenega koeficienta, je treba natančno določiti njeno koncentracijo. Ta raztopina se hrani v pogojih, ki zagotavljajo njeno stabilnost.

1.6.2.2 Preskusni pogoji Temperatura preskusa mora biti konstantna (± 1 oC) in v območju med 20 in 25 oC.

1.6.2.3 Merilni postopek

1.6.2.3

1.6.2.3.1 Vzpostavitev porazdelitvenega ravnotežja Za vsakega od preskusnih pogojev je treba pripraviti po dve preskusni posodi, ki vsebujeta potrebni, točno odmerjeni količini obeh topil ter potrebno količino osnovne raztopine. Faze n-oktanola se merijo z volumni. Preskusne posode je treba bodisi namestiti na ustrezne stresalnike ali jih stresati ročno. Kadar se uporabljajo centrifugirke, je priporočena metoda hitro obračanje centrifugirke za 180o okrog njene prečne osi, tako da se morebitni ujeti zrak dvigne skozi obe fazi. Izkušnje so pokazale, da 50 takšnih obratov običajno zadostuje za vzpostavitev porazdelitvenega ravnotežja. Za večjo gotovost pa se priporoča 100 obratov v petih minutah.

1.6.2.3.2 Ločitev faz Kadar je potrebno, se fazi ločita s centrifugiranjem. To se opravi z laboratorijsko centrifugo, v kateri se vzdržuje sobna temperatura, če pa se uporabi centrifuga brez termostata, se centrifugirke pustijo najmanj eno uro pred analizo pri temperaturi preskusa, da se vzpostavi ravnotežje.

1.6.2.4 Analiza Za določitev porazdelitvenega koeficienta je treba določiti koncentracijo preskusne snovi v obeh fazah. To se lahko stori tako, da se vzame alikvot vsake izmed dveh faz iz vsake epruvete za vsak preskusni pogoj in se analizira po izbranem postopku. Izračunati je treba skupno količino snovi v obeh fazah in jo primerjati s prvotno vneseno količino snovi. Vzorec vodne faze je treba odvzeti s postopkom, ki kar se da zmanjša tveganje, da bi se v njem pojavile sledi n-oktanola: v ta namen se lahko uporabi steklena brizga z zamenljivo iglo. Brizga se najprej delno napolni z zrakom. Ta zrak se počasi iztiska med potiskanjem igle skozi plast n-oktanola. V brizgo se vsrka primeren volumen vodne faze. Brizga se hitro potegne iz raztopine in igla se odstrani. Vsebina brizge se nato lahko uporabi kot vodni vzorec. Koncentracija v obeh ločenih fazah se po možnosti določi z metodo, ki je najbolj primerna za posamezno snov. Primeri morebitnih ustreznih analitskih metod so:

fotometrične metode,

plinska kromatografija,

tekočinska kromatografija visoke ločljivosti.

1.6.3 HPLC metoda

1.6.3

1.6.3.1 Priprava

1.6.3.1 Aparatura

Potrebujemo tekočinski kromatograf, opremljen s črpalko s stabilnim pretokom in ustreznim detektorjem. Priporoča se uporaba injektorja z injicirnimi zankami. Prisotnost polarnih skupin v stacionarni fazi lahko resno zmanjša učinkovitost kolone HPLC. Zato mora imeti stacionarne faze le minimalni odstotek polarnih skupin (11). Lahko se uporabijo na trgu dostopna polnila za mikro kolone z reverzno fazo ali že pripravljene kolone. Med injektorskim sistemom in analitsko kolono se lahko namesti predkolona.

Mobilna faza

Topilo za eluiranje se pripravi iz metanola za HPLC in vode za HPLC ter pred uporabo razplini. Izvesti je treba izokratsko izpiranje. Uporabiti je treba razmerja metanol/voda z deležem vode najmanj 25 %. Običajno je zmes metanol/voda v razmerju 3:1 (v/v) zadovoljiva za eluiranje snovi z log P 6 v eni uri pri pretoku 1 ml/min. Pri snoveh z večjo vrednostjo log P bo morda treba skrajšati elucijski čas (in elucijski čas referenčnih snovi) z zmanjšanjem polarnosti mobilne faze ali podaljšanjem kolone. Snovi z zelo majhno topnostjo v n-oktanolu dajo pri metodi HPLC velikokrat nenormalno majhne vrednosti log Pow; vrhove takih snovi včasih spremlja fronta topila. To se verjetno zgodi zato, ker je porazdelitveni proces prepočasen, da bi dosegla ravnotežje v času, ki je običajno potreben za ločitev s HPLC. V takem primeru je lahko učinkovit način za dosego zanesljive vrednosti zmanjšanje pretoka in/ali razmerja metanol/voda. Preskusne in referenčne snovi morajo biti topne v mobilni fazi v zadostnih koncentracijah, da je omogočena njihova detekcija. Dodatki v zmesi metanol/voda se lahko uporabijo le izjemoma, saj spremenijo lastnosti kolone. Za kromatograme z dodatki je obvezna uporaba ločene kolone enake vrste. Če zmes metanol/voda ni primerna, se lahko uporabijo druge zmesi organsko topilo/voda, npr. etanol/voda ali acetonitril/voda. Pri snoveh, ki disociirajo na ione, je pH eluenta zelo pomemben. Mora biti v delovnem območju pH kolone, ki je običajno med 2 in 8. Priporoča se dodajanje pufra. Preprečiti je treba obarjanje soli in razpadanje kolone, ki lahko nastaneta pri nekaterih zmeseh organske faze in pufra. Meritve HPLC s stacionarnimi fazami z osnovo iz silicijevega dioksida in pH nad 8 niso priporočljive, saj uporaba alkalne mobilne faze lahko povzroči hitro poslabšanje učinkovitosti kolone.

Topljenci

Referenčne snovi morajo biti čim bolj čiste. Snovi, ki se bodo uporabile za preskus ali umerjanje, se po možnosti raztopijo v mobilni fazi.

Preskusni pogoji

Med merjenjem se temperatura ne sme spreminjati za več kot ± 2 K.

1.6.3.2 Merjenje

1.6.3.2 Izračun mrtvega časa to

Mrtvi čas to se lahko določi z uporabo bodisi homolognih vrst (npr. n-alkilmetil-ketoni) bodisi z organskimi spojinami, ki se ne zadržijo v koloni (npr. tiosečnina ali formamid). Za izračun mrtvega časa to z uporabo homolognih vrst se injicira niz najmanj sedmih spojin homologne vrste in določijo njihovi retenzijski časi. Izriše se krivulja dobljenih retenzijskih časov tr(nc + 1) v odvisnosti od tr(nc) ter določita presek, a, in naklon, b, regresijske enačbe: tr(nc+1) = a + btr(nc) (nc = število ogljikovih atomov). Mrtvi čas to je določen z: to = a/(1 - b)

Umeritvena krivulja

Naslednji korak je izdelava krivulje vrednosti log k v odvisnosti od log P za ustrezne referenčne snovi. V praksi to pomeni, da se hkrati injicira 5 do 10 standardnih referenčnih snovi, katerih log P je blizu pričakovanega območja, in določijo retenzijski časi, po možnosti na integratorju zapisovalniku, povezanem z detektorjem. Izračunajo se ustrezni logaritmi faktorjev kapacitete, log k, in nariše se krivulja log k v odvisnosti od log P, določenega z metodo stresanja bučke. Umerjanje se izvaja redno, najmanj enkrat dnevno, tako da se lahko upoštevajo morebitne spremembe v delovanju kolone.

Določanje faktorja kapacitete preskusne snovi

Preskusna snov se injicira v najmanjšo možno količino mobilne faze. Določi se retenzijski čas (z dvema vzporednima meritvama), ki omogoča izračun faktorja kapacitete k. Iz korelacijske krivulje za referenčne snovi se lahko interpolira porazdelitveni koeficient preskusne snovi. Pri zelo majhnih in zelo velikih porazdelitvenih koeficientih je potrebna ekstrapolacija. V takih primerih je treba še posebej upoštevati meje zaupanja regresijske premice.

2. PODATKI

2. Metoda stresanja bučke

Zanesljivost določenih vrednosti P je mogoče preskusiti s primerjanjem srednjih vrednosti vzporednih določitev s skupno srednjo vrednostjo.

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

kadar metode niso uporabne (npr. pri površinsko aktivnih snoveh), je treba navesti izračunano vrednost ali oceno na podlagi topnosti v n-oktanolu in topnosti v vodi,

vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi.

rezultat predhodne ocene, če je bila opravljena,

temperatura določanja,

podatki o uporabljenih analitskih postopkih za določanje koncentracij,

čas in hitrost centrifugiranja, če je bilo uporabljeno,

izmerjene koncentracije v obeh fazah za vsako določitev (to pomeni, da bo v poročilu skupaj 12 koncentracij),

masa preskusne snovi, volumen vsake faze, uporabljene v vsaki posodi, in izračunana skupna količina preskusne snovi v vsaki fazi po vzpostavitvi ravnotežja,

izračunane vrednosti porazdelitvenega koeficienta (P) in njihova srednja vrednost za vsak sklop preskusnih pogojev ter srednja vrednost vseh določitev. Če kar koli kaže na odvisnost porazdelitvenega koeficienta od koncentracije, je to treba vključiti v poročilo,

standardna deviacija posameznih vrednosti P od njihove srednje vrednosti,

srednja vrednost P vseh določitev mora biti izražena tudi z logaritmom (osnova 10),

izračunana teoretična vrednost Pow, če je bila določena, ali če je izmerjena vrednost > 104,

pH uporabljene vode in vodne faze med preskusom,

če se uporabijo pufri, utemeljitev uporabe pufrov namesto vode, sestavo, koncentracijo in pH pufrov ter pH vodne faze pred in po preskusu.

rezultat predhodne ocene, če je bila opravljena,

preskusna in referenčne snovi ter njihova čistost,

temperaturno območje določitev,

pH, pri katerem so bile opravljene določitve,

podatki o analitski koloni in predkoloni, mobilni fazi ter načinu detekcije,

podatki o retenziji in vrednosti log P iz literature za referenčne snovi, uporabljene za umerjanje,

podatki o prilagojeni regresijski premici (log k v odvisnosti od log P),

podatki o povprečni retenziji in interpolirana vrednost log P za preskusno snov,

opis opreme in delovnih pogojev,

elucijski diagrami,

količine preskusne in referenčnih snovi, vnesene v kolono,

mrtvi čas in kako je bil izmerjen.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)

VIRI OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) –Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981). B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223–339. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984, Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base 1, 1978. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

A.9 PLAMENIŠČE

A.9

1. METODA

1.

1.1 UVOD Pred izvajanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o vnetljivosti snovi. Preskusni postopek se lahko uporablja za tekoče snovi, katerih hlape je mogoče prižgati z viri vžiga. Preskusne metode, naštete v tem besedilu, so zanesljive samo za območja plamenišča, navedena pri posameznih metodah. Pri izbiri metode je treba upoštevati možnost kemičnih reakcij med snovjo in posodo za vzorec.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Plamenišče je najnižja temperatura, popravljena glede na tlak 101,325 kPa, pri kateri tekočina razvije hlape, pri pogojih, opredeljenih v preskusni metodi, v takšni količini, da se v preskusni posodi tvori vnetljiva zmes hlapov in zraka. Enote: oC t = T – 273,15 (t v oC in T v K)

1.4 PRINCIP METODE Snov se da v preskusno posodo in segreje ali ohladi do temperature preskusa v skladu s postopkom, opisanim v posamezni preskusni metodi. S poskušanjem vžiga se ugotavlja, ali vzorec vzplamti pri temperaturi preskusa ali ne.

1.5 MERILA KAKOVOSTI

1.5

1.5.1 Ponovljivost Ponovljivost se spreminja glede na območje plamenišča in uporabljeno preskusno metodo; največ 2 oC.

1.5.2 Občutljivost Občutljivost je odvisna od uporabljene preskusne metode.

1.5.3 Specifičnost Specifičnost nekaterih preskusnih metod je omejena na določena območja plamenišča in odvisna od podatkov o snovi (npr. velika viskoznost).

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Priprave Vzorec preskusne snovi se vnese v preskusno aparaturo v skladu z 1.6.3.1 in/ali 1.6.3.2. Zaradi varnosti se priporoča, da se pri energetsko bogatih ali strupenih snoveh uporabi metoda, pri kateri je vzorec majhen, pribl. 2 cm3.

1.6.2 Preskusni pogoji Aparaturo je treba postaviti na mesto, kjer ni prepiha, če je to v skladu z varnostjo.

1.6.3 Izvedba preskusa

1.6.3

1.6.3.1 Ravnotežna metoda Glej ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Neravnotežna metoda

1.6.3.2. Aparatura Abel:

Glej BS 2000 del 170, NF M07-011, NF T66-009.

Aparatura Abel-Pensky:

Glej EN 57, DIN 51755 del 1 (za temperature od 5 do 65 oC), DIN 51755 del 2 (za temperature pod 5 oC), NF M07-036.

Aparatura Tag:

Glej ASTM D 56.

Aparatura Pensky-Martens:

Glej ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Opombe:

Kadar je plamenišče, določeno z neravnotežno metodo iz 1.6.3.2, enako 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC ali 55 ± 2 oC, je treba to vrednost potrditi z ravnotežno metodo z uporabo iste aparature. Za prijavo se lahko uporabijo le metode, s katerimi je mogoče določiti plamenišče. Za določitev plamenišča viskoznih tekočin (barve, gume in podobno), ki vsebujejo topila, se lahko uporabijo samo aparature in preskusne metode, primerne za določanje plamenišča viskoznih tekočin. Glej ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213, del 1.

2. PODATKI

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

navesti je treba uporabljeno metodo in kakršna koli možna odstopanja,

rezultati in vse dodatne opombe, ki so pomembne za razlago rezultatov.

4. VIRI Jih ni.

A.10 VNETLJIVOST (TRDNE SNOVI)

A.10

1. METODA

1.

1.1 UVOD Pred izvajanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o morebitnih eksplozivnih lastnostih snovi. Ta preskus je treba uporabljati samo za prašnate, granularne ali pastozne snovi. Šteje se, da so lahko vnetljive samo snovi, katerih hitrost gorenja presega neko mejno vrednost, zato da ne bi bile mednje vključene vse snovi, ki jih je mogoče prižgati, ampak le tiste, ki gorijo hitro, ali tiste, katerih način gorenja je kakor koli posebej nevaren. Posebej je nevarno, če se žarenje širi preko kovinskega prahu, zaradi težav pri gašenju. Kovinski prah se šteje za lahko vnetljivega, če omogoča razširjenje žarenja po celi masi v določenem času.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Čas gorenja izražen v sekundah.

1.3 REFERENČNE SNOVI Niso določene.

1.4 PRINCIP METODE Snov se oblikuje v neprekinjen trak ali pas prahu, dolg približno 250 mm, in opravi se predhodni presejalni preskus, da se ugotovi, ali se ob vžigu s plinskim plamenom gorenje širi s plamenom ali tlenjem. Če se v določenem času gorenje razširi čez 200 mm pasu, se opravi popoln preskus za določanje hitrosti gorenja.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Niso navedena.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Predhodni presejalni preskus Snov se oblikuje v neprekinjen trak ali pas prahu, približno 250 mm dolg, 20 mm širok in 10 mm visok, na negorljivi, neporozni in toplotno slabo prevodni osnovni plošči. K enemu koncu pasu prahu se približa vroč plamen plinskega gorilnika (premer najmanj 5 mm), dokler se prah ne vname ali za najmanj 2 minuti (5 minut pri prahu iz kovin ali kovinskih zlitin). Zapiše se, ali se gorenje razširi vzdolž 200 mm pasu v 4 minutah preskusa (ali 40 minutah pri kovinskem prahu). Če se snov ne vname in se gorenje v 4 minutah (ali 40 minutah) trajanja preskusa ne razširi ne s plamenom ne s tlenjem vzdolž 200 mm pasu prahu, se šteje, da snov ni lahko vnetljiva, in nadaljnje preskušanje ni potrebno. Če se gorenje razširi po snovi do 200 mm dolžine pasu prahu v manj kot 4 minutah, ali manj kot 40 minutah pri kovinskem prahu, je treba izvesti spodaj opisani postopek (točka 1.6.2 in naslednje).

1.6.2 Preskus hitrosti gorenja

1.6.2

1.6.2.1 Priprava Prašnate ali granularne snovi se narahlo natresejo v kalup, dolg 250 mm, s trikotnim prečnim prerezom z notranjo višino 10 mm in širino 20 mm. Na obe vzdolžni stranici kalupa je pritrjena kovinska plošča, kot stranska pregrada, ki sega 2 mm nad gornji rob trikotnega prečnega prereza (slika). Nato se kalup trikrat spusti z višine 2 cm na trdo podlago. Če je potrebno, se kalup dopolni. Nato se stranski pregradi odstranita in presežek snovi postrga stran. Na vrh kalupa se položi plošča iz negorljivega, neporoznega in toplotno slabo prevodnega materiala, nato se cela priprava obrne za 180o in kalup odstrani. Pastozne snovi se nanesejo na negorljivo, neporozno in toplotno slabo prevodno osnovno ploščo v obliki 250 mm dolgega valja s prečnim prerezom približno 1 cm2.

1.6.2.2 Preskusni pogoji V primeru snovi, občutljivih na vlago, je treba preskus opraviti čim prej po odstranitvi snovi iz vsebnika.

1.6.2.3 Izvedba preskusa Kupček se namesti v digestorij, prečno na tok zraka. Hitrost zraka mora biti zadostna, da dim ne uhaja v laboratorij, in se med preskusom ne sme spreminjati. Okrog aparature je treba namestiti zaslon, za zaščito pred prepihom. Z vročim plamenom plinskega gorilnika (s premerom najmanj 5 mm) se prižge en konec kupčka. Ko kupček zgori do dolžine 80 mm, se izmeri hitrost gorenja naslednjih 100 mm. Preskus se izvede šestkrat, vsakokrat s čisto, hladno ploščo, razen če se že prej dobi pozitiven rezultat.

2. PODATKI Za vrednotenje sta pomembna čas gorenja iz predhodnega presejalnega preskusa (1.6.1) in najmanjši čas gorenja v do šestih preskusih (1.6.2.3).

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

opis preskusne snovi, njeno agregatno stanje vključno z vsebnostjo vlage,

rezultati predhodnega presejalnega preskusa in preskusa hitrosti gorenja, če je bil opravljen,

vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.

3.2 RAZLAGA REZULTATA Prašnate, granularne ali pastozne snovi se štejejo za lahko vnetljive, če je čas gorenja v katerem koli od preskusov, opravljenih v skladu s preskusnim postopkom, opisanim v 1.6.2, manj kot 45 sekund. Prah kovin ali kovinskih zlitin se šteje za lahko vnetljivega, če ga je mogoče prižgati in se plamen ali območje reakcije razširi po celotnem vzorcu v 10 minutah ali manj.

4. VIRI NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

A.11 VNETLJIVOST (PLINI)

A.11

1. METODA

1.

1.1 UVOD Ta metoda omogoča ugotavljanje, ali so plini, zmešani z zrakom, pri sobni temperaturi (ca. 20 oC) in atmosferskem tlaku vnetljivi, in če so, v katerem območju koncentracij. Zmesi preskušanega plina z zrakom naraščajočih koncentracij se izpostavijo električni iskri, nato se opazuje, ali pride do vžiga.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Območje vnetljivosti je območje koncentracije med spodnjo in zgornjo mejo eksplozivnosti. Zgornja in spodnja meja eksplozivnosti sta tisti meji koncentracije vnetljivega plina v zmesi z zrakom, pri katerih se plamen ne širi.

1.3 REFERENČNE SNOVI Niso določene.

1.4 PRINCIP METODE Koncentracija plina v zraku se postopoma zvišuje in zmes se vsakokrat izpostavi električni iskri.

1.5. MERILA KAKOVOSTI Niso navedena.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Aparatura Preskusna posoda je pokončni stekleni valj z notranjim premerom najmanj 50 mm in višino najmanj 300 mm. Vžigalni elektrodi sta med seboj oddaljeni 3 do 5 mm in nameščeni 60 mm nad dnom valja. Valj je opremljen z odprtino za razbremenitev tlaka. Aparaturo je treba zaščiti z zaslonom, da se omeji morebitna škoda zaradi eksplozije. Kot vir vžiga se uporabi indukcijska iskra, ki traja 0,5 s in jo proizvede visoko napetostni transformator z izhodno napetostjo od 10 do 15 kV (največja vhodna moč 300 W). Primer primerne aparature je opisan v viru (2).

1.6.2 Preskusni pogoji Preskus je treba izvajati pri sobni temperaturi (ca. 20 oC).

1.6.3 Izvedba preskusa Z uporabo dozirne črpalke se v stekleni valj potisne znana koncentracija plina v zraku. Skozi zmes se pošlje iskra, nato se opazuje, ali se plamen loči od vira vžiga in neodvisno širi ali ne. Postopoma se povečuje koncentracija plina, vsakokrat za 1 volumski %, do pojava vžiga, kakor je opisan zgoraj. Če kemijska struktura plina kaže, da bi bil lahko nevnetljiv, in se lahko izračuna sestava stehiometrične zmesi z zrakom, je treba preskusiti le zmesi v območju od 10 % pod do 10 % nad stehiometrično sestavo, v intervalih po 1 %.

2. PODATKI Pojav širjenja plamena je edini relevantni podatek za določitev te lastnosti.

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

opis uporabljene aparature skupaj z dimenzijami,

temperatura, pri kateri je bil opravljen preskus,

preskušene koncentracije in dobljeni rezultati,

rezultat preskusa: nevnetljiv plin ali lahko vnetljiv plin,

če se ugotovi, da je plin nevnetljiv, je treba navesti območje koncentracij, v katerem je bil preskušen v intervalih po 1 %,

vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov.

4.(1)(2) VIRI NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases. W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse – einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, 126–127. Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. 'Entwicklung

A.12 VNETLJIVOST (STIK Z VODO)

A.12

1. METODA

1.

1.1 UVOD Ta preskusna metoda se lahko uporablja za ugotavljanje, ali se zaradi reakcije snovi ob stiku z vodo ali vlažnim zrakom razvije nevarna količina plina ali plinov, ki so morda lahko vnetljivi. Preskusna metoda se lahko uporablja za trdne in tekoče snovi. Ta metoda ni primerna za snovi, ki se v stiku z zrakom spontano vnamejo.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Lahko vnetljivo: snovi, ki v stiku z vodo ali vlažnim zrakom razvijejo nevarne količine lahko vnetljivih plinov s hitrostjo najmanj 1 liter/kg na uro.

1.3 PRINCIP METODE Snov se preskusi v skladu s spodaj opisanim zaporedjem faz; če pri kateri koli fazi pride do vžiga, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Če je znano, da snov z vodo ne reagira burno, se preskušanje začne s fazo 4 (1.3.4).

1.3

1.3.1 Faza 1 Preskusna snov se da v kadičko z destilirano vodo pri 20 oC, nato se zapiše, ali se razviti plin vname ali ne.

1.3.2 Faza 2 Preskusna snov se da na filtrirni papir, ki plava na površini destilirane vode pri 20 oC v posodici, nato se zapiše, ali se razviti plin vname ali ne. Edini namen filtrirnega papirja je obdržati snov na enem mestu, da se poveča verjetnost vžiga.

1.3.3 Faza 3 Preskusna snov se oblikuje v približno 2 cm visok kupček s premerom približno 3 cm. Na kupček se kane nekaj kapljic vode, nato se zapiše, ali se razviti plin vname ali ne.

1.3.4 Faza 4 Preskusna snov se zmeša z destilirano vodo pri 20 oC, nato se sedem ur v enournih presledkih meri hitrost razvijanja plina. Če je hitrost razvijanja plina po sedmih urah neenakomerna ali naraščajoča, je treba čas merjenja podaljšati na največ pet dni. Preskus se lahko prekine, če hitrost ob katerem koli času preseže 1 liter/kg na uro.

1.4 REFERENČNE SNOVI Niso določene.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Niso navedena.

1.6 OPIS METOD

1.6

1.6.1 Faza 1

1.6.1

1.6.1.1 Preskusni pogoji Preskus se izvaja pri sobni temperaturi (ca. 20 oC).

1.6.1.2 Izvedba preskusa Majhna količina (približno 2 mm v premeru) preskusne snovi se da v kadičko z destilirano vodo. Zapisati je treba, (i) ali se razvije kakršen koli plin in (ii) ali se ta plin vname. Če se plin vname, nadaljnje preskušanje snovi ni več potrebno, saj se snov obravnava kot nevarna.

1.6.2 Faza 2

1.6.2

1.6.2.1 Aparatura Filtrirni papir se plosko položi na površino destilirane vode v kakršni koli ustrezni posodi, npr. izparilnici s premerom 100 mm.

1.6.2.2 Preskusni pogoji Preskus se izvaja pri sobni temperaturi (ca. 20 oC).

1.6.2.3 Izvedba preskusa Majhna količina preskusne snovi (približno 2 mm v premeru) se da na sredino filtrirnega papirja. Zapisati je treba, (i) ali se razvije kakršen koli plin in (ii) ali se ta plin vname. Če se plin vname, nadaljnje preskušanje snovi ni več potrebno, saj se snov obravnava kot nevarna.

1.6.3 Faza 3

1.6.3

1.6.3.1 Preskusni pogoji Preskus se izvaja pri sobni temperaturi (ca. 20 oC).

1.6.3.2 Izvedba preskusa Preskusna snov se oblikuje v približno 2 cm visok in 3 cm širok kupček z jamico na vrhu. V jamico se kane nekaj kapljic vode in zapiše, (i) ali se razvije kakršen koli plin in (ii) ali se ta plin vname. Če se plin vname, nadaljnje preskušanje snovi ni več potrebno, saj se snov obravnava kot nevarna.

1.6.4 Faza 4

1.6.4

1.6.4.1 Aparatura Aparatura se sestavi, kakor je prikazano na sliki.

1.6.4.2 Preskusni pogoji Preveri se ali posoda s preskusno snovjo vsebuje prah < 500 μm (velikost delcev). Če prah predstavlja več kot 1 % m/m celotne količine ali če je vzorec drobljiv, je treba celotno snov pred preskušanjem zmleti v prah, da se upošteva manjšanje velikosti delcev med shranjevanjem in uporabo; sicer se snov preskuša takšna, kakršna je bila prejeta. Preskus je treba izvajati pri sobni temperaturi (pribl. 20 oC) in atmosferskem tlaku.

1.6.4.3 Izvedba preskusa V lij kapalnik aparature se da 10 do 20 ml vode in v erlenmajerico 10 g snovi. Volumen razvitega plina se lahko izmeri s kakršnimi koli primernimi pripomočki. Odpre se pipica lija, da voda steče v erlenmajerico, in sproži štoparica. V obdobju sedmih ur se vsako uro se izmeri razvijanje plina. Če je v tem obdobju razvijanje plina neenakomerno ali če ob koncu tega obdobja hitrost razvijanja plina narašča, se merjenje nadaljuje do največ petih dni. Če hitrost razvijanja plina kadar koli med merjenjem preseže 1 liter/kg na uro, se preskus lahko prekine. Ta preskus je treba izvesti trikrat. Če kemijska identiteta plina ni znana, je treba plin analizirati. Če plin vsebuje lahko vnetljive sestavine in ni znano, ali je celotna zmes lahko vnetljiva, je treba pripraviti zmes z enako sestavo in jo preskusiti po metodi A.11.

2. PODATKI Snov se šteje za nevarno, če:

v kateri koli fazi preskusnega postopka pride do spontanega vžiga, ali

se razvija vnetljiv plin s hitrostjo več kot 1 liter/kg snovi na uro.

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

podrobnosti o kakršni koli predpripravi preskusne snovi,

rezultati preskusov (faze 1, 2, 3 in 4),

kemijska identiteta razvitega plina,

hitrost razvijanja plina, če se izvede faza 4 (1.6.4),

kakršne koli dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.

4.(1)(2) VIRI Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

A.13 PIROFORNE LASTNOSTI TRDNIH SNOVI IN TEKOČIN

A.13

1. METODA

1.

1.1 UVOD Preskusni postopek se uporablja za trdne ali tekoče snovi, ki se že v majhnih količinah spontano vnamejo kmalu zatem, ko pridejo v stik z zrakom pri sobni temperaturi (ca. 20 oC). V to metodo niso vključene snovi, ki morajo biti izpostavljene zraku več ur ali dni pri sobni temperaturi ali pri zvišani temperaturi, preden se vnamejo.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Šteje se, da so snovi piroforne, če se vnamejo ali povzročijo zoglenelost pri pogojih, opisanih v 1.6. Morda bo treba preskusiti tudi samovnetljivost tekočin po metodi A.15 Temperatura samovžiga (tekočine in plini).

1.3 REFERENČNE SNOVI Niso določene.

1.4 PRINCIP METODE Snov, naj bo trdna ali tekoča, se da v inertno posodo in za pet minut izpostavi zraku pri sobni temperaturi. Če se tekoča snov ne vname, jo absorbiramo na filtrirni papir in za pet minut izpostavimo zraku pri sobni temperaturi (pribl. 20 oC). Če se trdna snov ali tekočina vname ali če tekočina vžge ali poogleni filtrirni papir, se šteje, da je snov piroforna.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Ponovljivost: zaradi varnosti zadostuje en sam pozitiven rezultat, da se snov šteje za piroforno.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6

1.6.1 Aparatura V porcelanski lonček s premerom približno 10 cm se natrese približno 5 mm visok kupček diatomejske zemlje pri sobni temperaturi (ca. 20 oC). Opomba: Diatomejska zemlja ali katera koli druga primerljiva splošno dostopna inertna snov se šteje za reprezentativno prst, na katero bi se lahko v primeru nesreče razlila preskusna snov. Za preskušanje tekočin, ki se ne vnamejo ob stiku z zrakom, če so v stiku z inertnim nosilcem, potrebujemo suh filtrirni papir.

1.6.2 Izvedba preskusa

1.6.2

(a) Prašnate trdne snovi Z višine približno 1 m se na negorljivo površino strese 1 do 2 cm3 prašnate preskusne snovi in opazuje, ali se snov vname med padanjem ali v petih minutah posedanja. Preskus se izvede šestkrat, razen če že prej pride do vžiga.

(b) Tekočine Približno 5 cm3 preskusne tekočine se vlije v pripravljen porcelanski lonček in opazuje, ali se tekočina vname v petih minutah. Če v šestih preskusih ne pride do vžiga, se opravijo naslednji preskusi: Iz brizge se na prepognjen filtrirni papir nanese 0,5 ml preskusne snovi in opazuje, ali se filtrirni papir v petih minutah od nanosa tekočine vname ali zogleni. Preskus se izvede trikrat, razen če že prej pride do vžiga.

2. PODATKI

2.

2.1 OBDELAVA REZULTATOV Preskus se lahko prekine, takoj ko se v katerem koli od preskusov dobi pozitiven rezultat.

2.2 VREDNOTENJE Če se snov vname v petih minutah po dodatku v inertno posodo in izpostavitvi zraku ali če tekoča snov povzroči pooglenitev ali vžig filtrirnega papirja v petih minutah po dodatku in izpostavitvi zraku, se šteje, da je piroforna.

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

rezultati preskusov,

kakršne koli dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.

4.(1)(2) VIRI NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14 EKSPLOZIVNE LASTNOSTI

A.14

1. METODA

1.

1.1 UVOD Metoda predstavlja preskusno shemo za ugotavljanje, ali trdna ali pastozna snov predstavlja nevarnost eksplozije, ko se izpostavi plamenu (toplotna občutljivost) ali udarcu ali trenju (občutljivost za mehanske dražljaje), in ali tekoča snov predstavlja nevarnost eksplozije, ko se izpostavi plamenu ali udarcu. Metoda zajema tri dele: Metoda daje podatke za oceno verjetnosti povzročitve eksplozije s pomočjo nekaterih običajnih dražljajev. Metoda ni namenjena ugotavljanju zmožnosti snovi, da eksplodira v kakršnih koli pogojih. Metoda je primerna za ugotavljanje, ali bo snov predstavljala nevarnost eksplozije (toplotna in mehanska občutljivost), v pogojih, določenih v direktivi. Temelji na številnih vrstah aparatur, ki se splošno uporabljajo na mednarodni ravni (1) in običajno dajejo uporabne rezultate. Priznava se, da metoda ni dokončna. Lahko se uporabi aparatura, ki je drugačna od navedene, pod pogojem da je mednarodno priznana in se rezultati lahko zadovoljivo primerjajo z rezultati, dobljenimi z navedeno aparaturo. Preskusov ni treba izvesti, kadar je iz razpoložljivih podatkov o termodinamiki (toplota proizvajanja, toplota razgrajevanja) in/ali odsotnosti nekaterih reaktivnih skupin (2) v strukturni formuli brez vsakršnega dvoma razvidno, da snov ni zmožna hitre razgradnje s proizvodnjo plinov ali sproščanjem toplote (tj. snov ne predstavlja nevarnosti eksplozije). Preskus mehanske občutljivosti za trenje pri tekočinah ni potreben.

1.1

(a) preskus toplotne občutljivosti (1);

(b) preskus mehanske občutljivosti za udarce (1);

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Eksplozivno: Snovi, ki lahko eksplodirajo ob izpostavitvi plamenu ali so občutljive za udarce ali trenje v posebni aparaturi (ali so bolj mehansko občutljive kakor 1,3-dinitrobenzen v nadomestni aparaturi).

1.3 REFERENČNE SNOVI 1,3-dinitrobenzen, tehnični, kristaliničen, presejan do velikosti delcev do 0,5 mm, za metode udarca in trenja. Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, heksogen, ciklonit – CAS 121-82-4), rekristaliziran iz vodnega cikloheksanona, mokro presejan skozi sito z odprtinami 250 μm in zadržan na situ z odprtinami 150 μm ter posušen pri 103 ± 2 oC (4 ure) za drugi niz preskusov trenja in udarcev.

1.4 PRINCIP METODE Za določitev varnih pogojev izvedbe treh preskusov občutljivosti so potrebni predhodni preskusi.

1.4

1.4.1 Preskusi varnosti pri ravnanju s snovjo (3) Zaradi varnosti se pred izvedbo glavnih preskusov zelo majhni vzorci (ca. 10 mg) snovi segrevajo na odprtem s plamenom plinskega gorilnika ter izpostavijo udarcu v kakršni koli primerni aparaturi in trenju z uporabo kladiva in nakovala ali kakršne koli druge torne naprave. Namen preskusa je ugotoviti, ali je snov tako občutljiva in eksplozivna, da je treba predpisane preskuse občutljivosti, zlasti tiste za toplotno občutljivost, izvajati še posebej previdno, da se izvajalec preskusov ne poškoduje.

1.4.2 Toplotna občutljivost Pri tej metodi se snov segreva v jekleni cevi, zaprti s šobnimi ploščami s spremenljivim premerom odprtine, da se določi, ali je verjetno, da bo snov eksplodirala pri intenzivni toploti in določeni zaprtosti.

1.4.3 Mehanska občutljivost (udarec) Pri tej metodi se snov izpostavi udarcu določene mase, spuščene z določene višine.

1.4.4 Mehanska občutljivost (trenje) Pri tej metodi se trdna ali pastozna snov izpostavi trenju med standardnimi površinami v določenih pogojih obremenitve in relativnega gibanja.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Niso navedena.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Toplotna občutljivost (učinek plamena)

1.6.1

1.6.1.1 Aparatura Aparaturo sestavlja jeklena cev za enkratno uporabo s pripravo za zapiranje za večkratno uporabo (slika 1), nameščena v grelno in zaščitno napravo. Vsaka cev je izdelana z globokim vlečenjem iz jeklene pločevine (glej dodatek), njen notranji premer je 24 mm, dolžina 75 mm in debelina stene 0,5 mm. Na odprtem koncu cevi je prirobnica, ki omogoča zapiranje cevi s šobnim sklopom. Ta sklop sestavlja proti tlaku odporna šobna plošča z odprtino na sredini, ki je trdno pritrjena na cev z dvodelno vijačno zvezo (matica in navojni obroč). Matica in navojni obroč sta izdelana iz krom-manganovega jekla (glej dodatek), ki ne proizvaja isker do 800 oC. Šobne plošče so debele 6 mm, izdelane iz jekla, obstojnega na vročino (glej dodatek), in so na voljo z različnimi premeri odprtin.

1.6.1.2 Preskusni pogoji Običajno se snov preskuša takšna, kakršna je bila prejeta, čeprav je v nekaterih primerih, npr. pri stisnjenih, litih ali kako drugače kondenziranih, morda treba snov pred preskušanjem zdrobiti. Pri trdnih snoveh se masa snovi, ki se bo uporabila v vsakem preskusu, določi z dvostopenjskim predhodnim preskusom. Stehtana cev se napolni z 9 cm3 snovi, nato se snov potlači s pritiskom sile 80 N po celotnem prečnem prerezom cevi. Zaradi varnosti, ali kadar se stiskanjem lahko spremeni agregatno stanje snovi, se lahko uporabijo drugi postopki polnjenja; npr. če je snov zelo občutljiva za trenje, stiskanje ni primerno. Če je snov stisljiva, se dodajajo nove količine snovi z vsakokratnim stiskanjem, dokler ni cev napolnjena do višine 55 mm od roba. Določi se skupna masa, porabljena za napolnitev cevi do višine 55 mm od roba, nato se še dvakrat doda enaka količina snovi, ki se vsakokrat potlači s silo 80 N. Zatem se snov bodisi doda s stiskanjem bodisi odvzame, kar je potrebno, da se cev napolni do višine 15 mm od roba. Nato se izvede drugi predhodni preskus, ki se začne s stisnjeno količino, enako tretjini skupne mase, določene pri prvem predhodnem preskusu. Dodata se še dve taki količini in potlačita s silo 80 N, nato se z dodajanjem ali odvzemanjem snovi prilagodi njen nivo v cevi do višine 15 mm od roba. Pri vseh preskusih se uporabi količina trdne snovi, določena v drugem predhodnem preskusu; cev se polni v treh korakih, s tremi enako velikimi deli, pri čemer se vsak del s potrebno silo stisne do volumna 9 cm3. (To se lahko olajša z uporabo distančnih obročev.) Tekočine in geli se nalijejo v cev do višine 60 mm, pri čemer je treba pri gelih posebej paziti, da vmes ni praznih prostorov. Na cev se od spodaj natakne navojni obroč, vstavi se ustrezna šobna plošča, nato se nanese nekaj maziva na osnovi molibdenovega disulfida in privije matica. Nujno se je treba prepričati, da nič snovi ni ujete med prirobnico in ploščo ali v navoju. Kot gorivo se uporabi propan iz industrijske jeklenke, opremljene z regulatorjem tlaka (60 do 70 mbar), ki se dovaja skozi merilnik in preko razdelilnika enakomerno porazdeli (kar se določi z opazovanjem plamenov gorilnikov) med štiri gorilnike. Gorilniki so po preskusni komori razporejeni, kakor prikazuje slika 1. Skupna poraba vseh štirih gorilnikov je 3,2 litra propana na minuto. Lahko se uporabijo tudi drugi plini in gorilniki, vendar mora biti hitrost segrevanja taka, kot je določena na sliki 3. Pri vseh aparaturah je treba periodično preverjati hitrost segrevanja z uporabo cevi, napolnjenih z dibutilftalatom, kakor je navedeno na sliki 3.

1.6.1.3 Izvedba preskusov V vsakem preskusu se cev segreva, dokler je ne raznese vendar ne dalj kot 5 minut. Preskus, pri katerem cev razpade na tri ali več delov, ki so v nekaterih primerih lahko med seboj povezani s tankimi trakovi kovine, kakor je prikazano na sliki 2, se ovrednoti kot preskus, pri katerem je prišlo do eksplozije. Preskus, pri katerem cev razpade na manj delov ali sploh ne razpade, se šteje kot preskus, ki ne povzroči eksplozije. Najprej se opravi niz treh preskusov z odprtino premera 6,0 mm na šobni plošči, in če pri nobenem ni eksplozije, se izvede drugi niz treh preskusov z odprtino premera 2,0 mm na šobni plošči. Če pri nobenem nizu preskusov ne nastane eksplozija, nadaljnje preskušanje ni potrebno.

1.6.1.4 Vrednotenje Rezultat preskusa je pozitiven, če pri katerem koli od zgoraj navedenih nizov preskusov nastane eksplozija.

1.6.2 Mehanska občutljivost (udarec)

1.6.2

1.6.2.1 Aparatura (slika 4) Bistveni deli značilne aparature z udarnim kladivom so blok iz jeklene litine z osnovno ploščo, nakovalo, stebriček, vodila, udarne uteži, sprožilna naprava in priprava za vzorec. Jekleno nakovalo, 100 mm (premer) × 70 mm (višina), je privito na zgornji del jeklenega bloka, 230 mm (dolžina) × 250 mm (širina) × 200 mm (višina), z ulito osnovno ploščo, 450 mm (dolžina) × 450 mm (širina) × 60 mm (višina). Stebriček iz brezšivne vlečene jeklene cevi je nameščen v držalu, privitem na zadnjo stran jeklenega bloka. Aparatura je s štirimi vijaki pritrjena na masiven cementni blok 60 × 60 × 60 cm, tako da sta vodilni tirnici točno navpični in udarna utež prosto pade. Na voljo za uporabo sta dve uteži, 5 in 10 kg, iz masivnega jekla. Udarna glava vsake uteži je iz utrjenega jekla, 60 do 63 HRC, in ima premer najmanj 25 mm. Vzorec se zapre v udarno pripravo, ki jo sestavljata dva valja iz masivnega jekla s skupno osjo, postavljena eden nad drugim, v votlem jeklenem valju, ki predstavlja vodilni obroč. Premer masivnih jeklenih valjev mora biti 10 (–0,003, –0,005) mm in višina 10 mm, njuna površina mora biti zloščena, robovi zaobljeni (polmer krivulje 0,5 mm), njuna trdota pa znašati 58 do 65 HRC. Zunanji premer votlega valja mora biti 16 mm, zloščene izvrtine 10 (+0,005, +0,010) mm, višina pa 13 mm. Udarna priprava se sestavi na vmesnem nakovalu (premer 26 mm in višina 26 mm) iz jekla in centrira z obročem, ki ima odprtinice za odvajanje hlapov.

1.6.2.2 Preskusni pogoji Volumen vzorca mora biti 40 mm3 ali ustrezen za kakršno koli nadomestno aparaturo. Trdne snovi se preskušajo v suhem stanju in pripravljene na naslednji način: Snovi, ki se običajno dobavljajo v pastozni obliki, se, kadar je mogoče, preskušajo v suhem stanju, v vsakem primeru pa po odstranitvi čim večje količine redčila. Pri preskušanju tekočih snovi se med zgornjim in spodnjim jeklenim valjem pusti razmik 1 mm.

1.6.2.2

(a) prašnate snovi se presejejo (sito z odprtinami 0,5 mm); v preskusu se uporabi vsa snov, ki se preseje skozi sito;

(b) stisnjene, ulite ali kako drugače kondenzirane snovi se razbijejo na manjše delce in presejejo; v preskusu se uporabi presejana frakcija s premerom 0,5 do 1 mm, ki mora biti reprezentativna za izvirno snov.

1.6.2.3 Izvedba preskusov Izvede se niz šestih preskusov s spuščanjem mase 10 kg z višine 0,40 m (40 J). Če pri teh šestih preskusih pri 40 J nastane eksplozija, je treba izvesti dodaten niz šestih preskusov s spuščanjem mase 5 kg z višine 0,15 m (7,5 J). V drugih napravah se vzorec primerja z izbrano referenčno snovjo po uveljavljenem postopku (npr. s tehniko dviganja in spuščanja itd.).

1.6.2.4 Vrednotenje Šteje se, da je rezultat pozitiven, če eksplozija (vzplamenitev in/ali pokanje sta enakovredna eksploziji) nastane najmanj enkrat med katerim koli od preskusov s predpisano udarno aparaturo ali če je vzorec bolj občutljiv kot 1,3-dinitrobenzen ali RDX pri drugačnem preskusu z udarcem.

1.6.3 Mehanska občutljivost (trenje)

1.6.3

1.6.3.1 Aparatura (slika 5) Torna aparatura je sestavljena iz osnovne plošče iz jeklene litine, na katero je postavljena torna naprava. To sestavljata nepremični porcelanast valjček in premična porcelanasta ploščica. Porcelanasta ploščica je pritrjena na drsnik, ki se premika po dveh vodilih. Drsnik je povezan z elektromotorjem preko pomikalnika, ekscentra in ustreznega menjalnika, tako da se porcelanasta ploščica enkrat samkrat premakne naprej in nazaj pod porcelanastim valjčkom za 10 mm. Porcelanast valjček se lahko obremeni z npr. 120 ali 360 newtoni. Porcelanaste ploščice so izdelane iz belega tehničnega porcelana (hrapavost 9 do 32 mm) in imajo dimenzije 25 mm (dolžina) × 25 mm (širina) × 5 mm (višina). Porcelanast valjček, je prav tako narejen iz belega tehničnega porcelana ter je dolg 15 mm, ima premer 10 mm in hrapava zaokrožena konca s polmerom zaokroženega dela 10 mm.

1.6.3.2 Preskusni pogoji Volumen vzorca mora biti 10 mm3 ali ustrezen za kakršno koli drugačno aparaturo. Trdne snovi se preskušajo v suhem stanju in pripravljene na naslednji način: Snovi, ki se običajno dobavljajo v pastozni obliki, se, kadar je mogoče, preskušajo v suhem stanju. Če se snovi ne da posušiti, se pasta (po odstranitvi največje možne količine redčila) preskusi kot 0,5 mm debel, 2 mm širok in 10 mm dolg film, pripravljen s šablono.

1.6.3.2

(a) prašnate snovi se presejejo (sito z odprtinami 0,5 mm); v preskusu se uporabi vsa presejana snov;

(b) stisnjene, ulite ali kako drugače kondenzirane snovi se zdrobijo na manjše delce in presejejo; v preskusu se uporabi presejana frakcija s premerom < 0,5 mm.

1.6.3.3 Izvedba preskusov Porcelanast valjček se postavi na vzorec in obremeni. Med izvajanjem preskusa morajo zareze na porcelanasti ploščici ležati prečno na smer premikanja. Paziti je treba, da valjček stoji na vzorcu, da je pod valjčkom dovolj preskusne snovi in da se ploščica pravilno premika pod valjčkom. Pri pastoznih snoveh se za nanos snovi na ploščico uporabi 0,5 mm debela šablona z odprtino 2 × 10 mm. Porcelanasta ploščica se mora v 0,44 sekundah premakniti 10 mm naprej in nazaj pod porcelanastim valjčkom. Vsak del površine ploščice in valjčka se sme uporabiti le enkrat; oba konca vsakega valjčka se uporabita za dva preskusa in vsaka površina ploščice za tri preskuse. Izvede se niz šestih preskusov z obremenitvijo 360 N. Če se v teh šestih preskusih dobi pozitiven rezultat, je treba izvesti dodaten niz šestih preskusov z obremenitvijo 120 N. V drugi aparaturi se vzorec primerja z izbrano referenčno snovjo po uveljavljenem postopku (npr. s tehniko dviganja in spuščanja itd.).

1.6.3.4 Vrednotenje Šteje se, da je rezultat pozitiven, če eksplozija (prasketanje in/ali pokanje ali vzplamenitev so enakovredni eksploziji) nastane vsaj enkrat med katerim koli od preskusov s predpisano torno aparaturo ali če izpolnjuje enakovredna merila pri drugačnem tornem preskusu.

2. PODATKI Načeloma se šteje, da snov predstavlja nevarnost eksplozije v smislu te direktive, če preskus toplotne, udarne ali torne občutljivosti da pozitiven rezultat.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

identiteta, sestava, čistost, vsebnost vlage itd., preskusne snovi,

agregatno stanje vzorca in ali je bil zdrobljen, zdrobljen in/ali presejan,

opažanja med preskusi toplotne občutljivosti (npr. masa vzorca, število delov itd.),

opažanja med preskusi mehanske občutljivosti (npr. nastajanje velikih količin dima ali popoln razpad brez pokanja, plamena, isker, prasketanja itd.),

rezultati vsake vrste preskusov,

če je bila uporabljena drugačna aparatura, je treba navesti znanstveno utemeljitev ter dokaze o soodvisnosti med rezultati, pridobljenimi s predpisano aparaturo, in tistimi, pridobljenimi z enakovredno aparaturo,

kakršne koli koristne opombe, na primer sklicevanja na preskuse s podobnimi proizvodi, ki so lahko pomembne za pravilno razlago rezultatov,

vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.

3.2 RAZLAGA IN VREDNOTENJE REZULTATOV V poročilu o preskusu je treba navesti tudi kakršne koli rezultate, ki se štejejo za lažne, anomalne ali nereprezentativne. Če je treba katerega od rezultatov zavreči, je treba navesti obrazložitev in rezultate kakršnega koli nadomestnega ali dopolnilnega preskušanja. Če se anomalnega rezultata ne da obrazložiti, ga je treba sprejeti takšnega, kakršen je, in ga uporabiti za ustrezno razvrstitev snovi.

4.(1)(2)(3)(4)

VIRI Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30–42. NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

A.15 TEMPERATURA SAMOVŽIGA (TEKOČINE IN PLINI)

A.15

1. METODA

1.

1.1 UVOD Eksplozivne snovi in snovi, ki se spontano vnamejo v stiku z zrakom pri sobni temperaturi, se ne smejo preskušati s tem preskusom. Preskusni postopek se uporablja za pline, tekočine in pare, ki se ob prisotnosti zraka lahko vnamejo na vroči površini. Temperaturo samovžiga lahko znatno zniža prisotnost katalitskih nečistot, material površine ali večji volumen preskusne posode.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Stopnja samovnetljivosti se izraža s temperaturo samovžiga. Temperatura samovžiga je najnižja temperatura, pri kateri se preskusna snov vname, če se pomeša z zrakom v pogojih, opredeljenih v preskusni metodi.

1.3 REFERENČNE SNOVI Referenčne snovi so naštete v standardih (glej 1.6.3). Predvsem naj bi se uporabljale za občasno preverjanje učinkovitosti metode in za omogočanje primerjave z rezultati drugih metod.

1.4 PRINCIP METODE S to metodo se določa najnižja temperatura notranje površine posode, pri kateri se plin, para ali tekočina, vbrizgana v posodo, vname.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Ponovljivost se spreminja v skladu z območjem temperatur samovžiga in uporabljeno preskusno metodo. Občutljivost in specifičnost sta odvisni od uporabljene preskusne metode.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Aparatura Aparatura je opisana v metodi iz 1.6.3.

1.6.2 Preskusni pogoji Preskus na vzorcu preskusne snovi se izvede v skladu z metodo iz 1.6.3.

1.6.3 Izvedba preskusa Glej IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. PODATKI Zapišejo se temperatura preskusa, atmosferski tlak, uporabljena količina vzorca, čas, ki preteče do samovžiga.

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistote),

uporabljena količina vzorca, atmosferski tlak,

uporabljena aparatura,

rezultati meritev (temperature preskusa, rezultati v zvezi z vžigom, ustrezni časovni zamik),

vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.

4. VIRI Jih ni.

A.16 RELATIVNA TEMPERATURA SAMOVŽIGA ZA TRDNE SNOVI

A.16

1. METODA

1.

1.1 UVOD Eksplozivne snovi in snovi, ki se spontano vnamejo v stiku z zrakom pri sobni temperaturi, se ne smejo preskušati s tem preskusom. Namen tega preskusa je zagotoviti predhodne podatke o samovnetljivosti trdnih snovi pri povišani temperaturi. Če se vročina, ki se razvije ob reagiranju snovi s kisikom ali eksotermni razgradnji, ne porazgubi dovolj hitro po okolici, se bo snov samosegrevala in vnela. Samovžig se torej pojavi, kadar se toplota proizvaja hitreje, kot se izgublja. Preskusni postopek je koristen kot predhodni presejalni preskus za trdne snovi. Zaradi zapletene narave vžiga in izgorevanja trdnih snovi je treba temperaturo samovžiga, določeno v skladu s to preskusno metodo, uporabljati le za primerjanje.

1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Temperatura samovžiga, dobljena s to metodo, je najnižja temperatura okolja, izražena v oC, pri kateri se določen volumen snovi v določenih pogojih vname.

1.3. REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4. PRINCIP METODE Določen volumen preskusne snovi se da v peč pri sobni temperaturi; zapisuje se krivulja temperatura/čas, ki se nanaša na razmere v sredini vzorca, medtem ko se temperatura peči viša do 400 oC, ali do tališča, če je to nižje, s hitrostjo 0,5 oC/min. Pri tem preskusu se temperatura peči, pri kateri temperatura vzorca doseže 400 oC s samosegrevanjem, imenuje temperatura samovžiga.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Aparatura

1.6.1

1.6.1.1 Peč Laboratorijska peč s temperaturnim programom (volumen približno 2 litra), opremljena s sistemom za naravno kroženje zraka in protieksplozijsko zaščito. Da se prepreči nastanek morebitne eksplozije, je treba kakršnim koli razgradnim plinom preprečiti stik z električnimi grelnimi elementi.

1.6.1.2 Kocka iz žičnate mreže Kos žičnate mreže iz nerjavnega jekla z odprtinami 0,045 mm se razreže v skladu z vzorcem na sliki 1. Mreža se pregane in poveže z žico v kocko brez zgornje ploskve.

1.6.1.3 Termočlena Primerna termočlena.

1.6.1.4 Zapisovalnik Kakršen koli dvokanalni zapisovalnik, umerjen na 0 do 600 oC ali ustrezno napetost.

1.6.2 Preskusni pogoji Snovi se preskušajo takšne, kakršne so bile prejete.

1.6.3 Izvedba preskusa Kocka se napolni s preskusno snovjo, nato se narahlo stresa in polni s snovjo, dokler ni povsem polna. Kocka se nato obesi na sredino peči pri sobni temperaturi. En termočlen se namesti v sredino kocke, drugi pa med kocko in steno peči, da se beleži temperatura peči. Temperatura se viša do 400 oC ali do tališča, če je to nižje, s hitrostjo 0,5 oC/min in med tem se ves čas zapisujeta temperaturi peči in vzorca. Ko se snov vname, termočlen v vzorcu pokaže izjemno skokovit porast temperature nad temperaturo peči.

2. PODATKI Za vrednotenje je pomembna temperatura peči, pri kateri temperatura vzorca s samosegrevanjem doseže 400 oC (glej sliko 2).

3. POROČANJE V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

opis preskusne snovi,

rezultati merjenja, vključno s krivuljo temperatura/čas,

vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.

4. VIRI NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

4.

Slika 1 Vzorec za 20 mm-preskusno kocko

Slika 2 Značilna krivulja temperatura/čas

temperatura vzorca temperatura peči temperatura vžiga čas

A.17 OKSIDACIJSKE LASTNOSTI (TRDNE SNOVI)

A.17

1. METODA

1.

1.1 UVOD Pred izvajanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o vseh morebitnih eksplozivnih lastnostih snovi. Ta preskus ni uporaben za tekočine, pline, eksplozivne ali lahko vnetljive snovi ali organske perokside. Preskusa ni treba izvesti, če se na podlagi preučitve strukturne formule brez vsakršnega dvoma ugotovi, da snov ni zmožna eksotermno reagirati z gorljivo snovjo. Treba je izvesti predhodni preskus, da se ugotovi, ali so pri izvedbi preskusa potrebni posebni varnostni ukrepi.

1.2 OPREDELITEV IN ENOTE Čas gorenja: reakcijski čas v sekundah, v katerem reakcijsko območje prepotuje določeno razdaljo vzdolž kupčka, v skladu s postopkom iz 1.6. Hitrost gorenja: izražena v milimetrih na sekundo. Največja hitrost gorenja: največja vrednost izmed hitrosti gorenja, dobljenih z zmesmi, ki vsebujejo od 10 do 90 utežnih % oksidanta.

1.3 REFERENČNA SNOV Pri preskusu in predhodnem preskusu se kot referenčna snov uporablja barijev nitrat (analitska čistost). Referenčna zmes je zmes barijevega nitrata in uprašene celuloze, pripravljena v skladu z 1.6, ki ima največjo hitrost gorenja (običajno zmes s 60 utežnimi % barijevega nitrata).

1.4 PRINCIP METODE Zaradi varnosti se izvede predhodni preskus. Kadar predhodni preskus jasno pokaže, da ima preskusna snov oksidacijske lastnosti, nadaljnje preskušanje ni potrebno. V nasprotnem primeru je treba s snovjo izvesti popoln preskus. V popolnem preskusu se pripravijo zmesi iz preskusne snovi in določene gorljive snovi v različnih razmerjih. Vsaka zmes se nato oblikuje kupček, ki se na enem koncu prižge. Največja določena hitrost gorenja se primerja z največjo hitrostjo gorenja referenčne zmesi.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Če je treba snov drobiti in mešati, se za to lahko uporabi katera koli metoda, pod pogojem da razlika v največji hitrosti gorenja v šestih ločenih preskusih ne odstopa od aritmetične sredine za več kakor 10 %.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Priprava

1.6.1

1.6.1.1 Preskusna snov Velikost delcev v vzorcu se zmanjša do < 0,125 mm po naslednjem postopku: preskusna snov se preseje, preostala frakcija se zmelje in postopek se ponavlja, dokler skozi sito ni presejana vsa preskusna snov. Uporabi se lahko katera koli metoda za mletje in presejanje, ki ustreza merilom kakovosti. Pred pripravo zmesi se snov posuši pri 105 oC do konstantne mase. Če je temperatura razgradnje preskusne snovi nižja od 105 oC, je treba snov posušiti pri ustrezni nižji temperaturi.

1.6.1.2 Gorljiva snov Kot gorljiva snov se uporabi uprašena celuloza. Izbrati je treba vrsto celuloze, ki se uporablja za tenkoplastno kromatografijo ali kolonsko kromatografijo. Izkazalo se je, da je primerna celuloza z več kakor 85 % vlaken z dolžino med 0,020 in 0,075 mm. Celulozni prah se preseje skozi sito z odprtinami velikosti 0,125 mm. V celem preskusu je treba uporabiti celulozo iz iste serije. Pred pripravo zmesi se uprašena celuloza posuši pri 105 oC do konstantne mase. Če se v predhodnem preskusu uporabi žagovina, se pripravi žagovina mehkega lesa, tako da se zbere delež, presejan skozi sito z odprtinami velikosti 1,6 mm, se temeljito premeša in nato štiri ure suši pri 105 oC v plasti, debeli največ 25 mm. Žagovina se ohladi in hrani v čim bolj polni nepredušno zaprti posodi do uporabe, kar naj bo po možnosti v 24 urah po sušenju.

1.6.1.3 Vir vžiga Kot vir vžiga se uporabi vroč plamen plinskega gorilnika (premer najmanj 5 mm). Če se uporabi kak drug vir vžiga (npr. pri preskušanju v inertni atmosferi), ga je treba opisati v poročilu in utemeljiti njegovo uporabo.

1.6.2 Izvedba preskusa Opomba: Zmesi oksidantov in celuloze ali žagovine je treba obravnavati kot morebitno eksplozivne in z njimi ravnati z ustrezno previdnostjo.

1.6.2

1.6.2.1 Predhodni preskus Posušena snov se temeljito zmeša s posušeno celulozo ali žagovino v razmerju 2 utežna dela preskusne snovi in 1 utežni del celuloze ali žagovine, nato se zmes oblikuje v majhen stožčast kupček z dimenzijami 3,5 cm (premer osnovne ploskve) × 2,5 cm (višina), tako da se brez tlačenja napolni stožčast kalup (npr. laboratorijski stekleni lij z zamašeno odtočno cevko). Kupček se da na hladno, negorljivo, neporozno in toplotno slabo prevodno osnovno ploščo. Preskus je treba izvesti v digestoriju, kakor v 1.6.2.2. Z virom vžiga se dotaknemo kupčka. Opazujeta in zapišeta se silovitost in trajanje nastale reakcije. Če je reakcija silovita, se šteje, da je snov oksidativna. Kadar koli je rezultat dvomljiv, je treba izvesti spodaj opisani popolni preskusni postopek.

1.6.2.2 Popolni preskus Pripravijo se zmesi oksidanta in celuloze, ki vsebujejo od 10 do 90 utežnih % oksidanta, vsaka za 10 % več. Pri mejnih primerih je treba uporabiti tudi vmesne koncentracije zmesi oksidanta in celuloze, da se največja hitrost gorenja določi natančneje. S pomočjo kalupa se oblikuje kupček. Kalup je narejen iz kovine, dolg 250 mm ter ima trikotni prečni prerez z notranjo višino 10 mm in notranjo širino 20 mm. Na obe vzdolžni stranici kalupa je pritrjena kovinska plošča, kot stranska pregrada, ki sega 2 mm nad gornji rob trikotnega prečnega prereza (slika). Ta priprava se napolni z zmesjo v majhnem presežku. Kalup se enkrat spusti z višine 2 cm na trdno podlago, nato se presežek snovi postrga s ploščico v poševnem položaju. Snameta se stranski pregradi, preostali prah pa zgladi z valjčkom. Na vrh kalupa se položi osnovna plošča iz negorljivega, neporoznega in toplotno slabo prevodnega materiala, nato se cela priprava obrne za 180o in odstrani kalup. Kupček se namesti v digestorij, prečno na tok zraka. Hitrost odvajanja zraka mora biti zadostna, da dim ne uhaja v laboratorij, in se med preskusom ne sme spreminjati. Okrog aparature je treba namestiti zaslon, za zaščito pred prepihom. Zaradi higroskopičnosti celuloze in nekaterih preskusnih snovi je treba preskus izvesti čim hitreje. Prižgemo en konec kupčka, tako da se ga dotaknemo s plamenom. Ko reakcijsko območje preide začetno razdaljo 30 mm se meri reakcijski čas prek razdalje 200 mm. Preskus se izvede z referenčno snovjo in vsaj po enkrat z vsako od zmesi preskusne snovi in celuloze. Če je največja hitrost gorenja znatno večja od hitrosti gorenja referenčne zmesi, se preskus lahko ustavi; sicer je treba preskus petkrat ponoviti z vsako od treh zmesi, pri katerih je bila hitrost gorenja največja. Če se sumi, da je rezultat lažno pozitiven, je treba preskus ponoviti z inertno snovjo s podobno velikostjo delcev, kakršna je diatomejska zemlja, namesto celuloze. Druga možnost je, da se zmes preskusne snovi in celuloze z največjo hitrostjo gorenja ponovno preskusi v inertni atmosferi (vsebnost kisika < 2 % v/v).

2. PODATKI Zaradi varnosti se za značilno oksidativno lastnost preskusne snovi šteje največja hitrost gorenja – ne srednja vrednost. Za vrednotenje je pomembna največja vrednost hitrosti gorenja dane zmesi v nizu šestih preskusov. Izdela se graf največje vrednosti hitrosti gorenja vsake zmesi v odvisnosti od koncentracije oksidanta. Iz grafa se določi največja hitrost gorenja. Šest izmerjenih vrednosti hitrosti gorenja v enem nizu preskusov na zmesi z največjo hitrostjo gorenja se ne sme razlikovati od aritmetične sredine za več kot 10 %; sicer je treba izboljšati metodi mletja in mešanja. Dobljena največja hitrost gorenja se primerja z največjo hitrostjo gorenja referenčne zmesi (glej 1.3). Če se preskusi izvajajo v inertni atmosferi, se največja hitrost reakcije primerja s hitrostjo reakcije referenčne zmesi v inertni atmosferi.

3. POROČILO

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

identiteta, sestava, čistost, vsebnost vlage itd., preskusne snovi,

kakršna koli obdelava vzorca (npr. mletje, sušenje …),

v preskusih uporabljeni vir vžiga,

rezultati meritev,

način reagiranja (npr. hitro gorenje na površini, gorenje skozi celotno maso, kakršne koli informacije o produktih izgorevanja …),

vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov, vključno z opisom silovitosti (plamenenje, iskrenje, dimljenje, počasno tlenje itd.) in približno trajanje, ugotovljeno v predhodnih varnostnih/presejalnih preskusih za preskusno in referenčno snov,

rezultati preskusov z inertno snovjo, če so bili izvedeni,

rezultati preskusov v inertni atmosferi, če so bili izvedeni.

3.2 RAZLAGA REZULTATA Šteje se, da je snov oksidativna, kadar: Da se izognemo lažno pozitivnim rezultatom, je treba pri razlagi rezultatov upoštevati tudi rezultate, dobljene pri preskušanju snovi, zmešane z inertnim materialom, in/ali pri preskušanju v inertni atmosferi.

3.2

(a) je v predhodnem preskusu nastala silovita reakcija;

(b) je v popolnem preskusu največja hitrost gorenja preskušenih zmesi večja ali enaka največji hitrosti referenčne zmesi celuloze in barijevega nitrata.

4. VIRI NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

A.18 POVPREČNO ŠTEVILO MOLEKULSKE MASE IN PORAZDELITEV MOLEKULSKE MASE POLIMEROV

A.18

1. METODA Ta metoda gelske permeacijske kromatografije je posnetek OECD smernice 118 (1996). Temeljna načela in nadaljnje tehnične informacije so navedene v literaturi 1.

1.

1.1 UVOD Ker so lastnosti polimerov tako raznolike, je nemogoče opisati eno samo metodo, s katero bi bili natančno določeni pogoji za separacijo in ocenjevanje, ki bi pokrivali vse možnosti in posebnosti, do katerih pride pri separaciji polimerov. Zlasti se gelni permeacijski kromatografiji (GPC) pogosto ne da podrediti kompleksnih sistemov polimerov. Kadar GPC metode ni mogoče uporabiti, lahko molekulsko maso določimo s pomočjo drugih metod (glej Prilogo). V takšnih primerih je treba uporabljeno metodo natančno obrazložiti in utemeljiti. Opisana metoda temelji na DIN standardu 55672 (1). Ta DIN standard vsebuje podrobne informacije o načinu izvajanja poskusov in ocenjevanja podatkov. V primeru, da je treba pogoje poskusa spremeniti, je treba takšne spremembe utemeljiti. Lahko uporabimo tudi druge standarde, če so v celoti podprti z viri. Opisana metoda uporablja vzorce polistirena znane polidisperznosti za kalibriranje in jo bo mogoče treba spremeniti, da bo ustrezala določenim polimerom, npr. v vodi topnim polimerom in razvejanim polimerom z dolgimi verigami.

1.2 DEFINICIJE IN ENOTE Povprečno število molekulske mase Mn in povprečno maso molekulske mase Mw določimo s pomočjo naslednjih enačb: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi kjer je: Hi stopnja signala detektorja od osnovne črte za retenzijski volumen Vi, Mi molekulska masa frakcije polimera pri retenzijskem volumnu Vi in n število podatkovnih točk. Razpon porazdelitve molekulske mase, ki je mera za disperznost sistema, se kaže z razmerjem Mw/Mn.

1.3 REFERENČNE SNOVI Ker je GPC relativna metoda, je treba opraviti kalibriranje. Običajno za to uporabimo ozko porazdeljene, linearno strukturirane vzorce polistirena z znanimi povprečnimi molekulskimi masami Mn in Mw in znano porazdelitvijo molekulske mase. Kalibracijsko krivuljo lahko uporabimo le pri določanju molekulske mase neznanega vzorca, če so pogoji za separacijo vzorca in standardov izbrani na povsem enak način. Določeno razmerje med molekulsko maso in volumnom elucije je veljavno le pod specifičnimi pogoji posameznega poskusa. Ti pogoji vključujejo predvsem temperaturo, topilo (ali mešanico topila), kromatografske pogoje in separacijsko kolono ali sistem kolon. Tako določene molekulske mase vzorca so relativne vrednosti in so opisane kot ekvivalentne molekulske mase polistirena. To pomeni, da se lahko glede na strukturalne in kemične razlike med vzorcem in standardi molekulske mase bolj ali manj oddaljijo od absolutnih vrednosti. Če uporabimo druge standarde, npr. polietilen glikol, polietilen oksid, polimetil metakrilat, poliakrilno kislino, je treba za to navesti razloge.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Porazdelitev molekulske mase vzorca in povprečno molekulsko maso (Mn, Mw) lahko določimo z uporabo GPC metode. GPC je poseben tip tekočinske kromatografije, kjer vzorec separiramo v skladu s hidrodinamičnimi volumni posameznih sestavin (2). Separacija se izvede, ko vzorec preteče skozi kolono, napolnjeno s poroznim materialom, običajno z organskim gelom. Majhne molekule lahko predrejo skozi pore, večje molekule pa se izločijo. Pot večjih molekul je tako krajša in te so najprej eluirane. Srednje velike molekule predrejo skozi nekaj por in so eluirane pozneje. Najmanjše molekule, katerih povprečen hidrodinamični premer je manjši od por gela, lahko predrejo skozi vse pore. Te so eluirane zadnje. V idealnih razmerah na separacijo v celoti vpliva velikost molekulskih vrst, vendar pa se v praksi težko izognemo vsaj nekaterim ovirajočim učinkom absorbcije. Neenakomerna napolnjenost kolon in mrtvi volumni lahko razmere poslabšajo (2). Ugotavljanje izvedemo, na primer, na osnovi refrakcijskega indeksa ali UV absorpcije in dobimo preprosto distribucijsko krivuljo. Da pa bi na krivulji opredelili dejanske vrednosti molekulske mase, moramo kalibrirati kolono, tako da skoznjo pretečejo polimeri z znano molekulsko maso in, v idealnem primeru, v glavnem podobno strukturo, npr. različni standardi polistirena. Rezultat Gaussove krivulje, čeprav včasih popačen z majhnim repom na strani nizke molekulske mase, je običajno tak, da navpična os kaže količino, izraženo z maso, raznih eluiranih vrst molekulske mase, vodoravna os pa logaritem molekulske mase.

1.5 KRITERIJI KAKOVOSTI Ponovljivost (Relativna standardna deviacija: RSD) volumna elucije bi morala preseči 0,3 %. Zahtevana ponovljivost analize mora biti zagotovljena s korekcijo prek internega standarda, če je kromatogram ocenjen v časovni odvisnosti in če ne ustreza zgoraj navedenem kriteriju (1). Polidisperznosti so odvisne od molekulskih mas standardov. V primeru standarda polistirena so tipične vrednosti naslednje: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 ≤ Mp ≤ 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp je mulekulska masa standarda pri maksimumu vrha)

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6

1.6.1 Priprava standardnih raztopin polistirena Standardi polistirena se raztopijo s previdnim mešanjem v izbranem eluatu. Pri pripravi raztopin je treba upoštevati navodila proizvajalca. Koncentracije izbranih standardov so odvisne od različnih dejavnikov, npr. injekcijski volumen, viskoznost raztopine in občutljivost analitskega detektorja. Maksimalen injekcijski volumen mora biti prilagojen dolžini kolone, da bi se izognili preobremenitvi. Tipični injekcijski volumni za analitične separacije pri uporabi GPC metode s kolono 30 cm × 7,8 mm so navadno med 40 in 100 μl. Možni so višji volumni, vendar ne smejo presegati 250 μl. Optimalno razmerje med injekcijskim volumnom in koncentracijo je treba določiti pred dejanskim kalibriranjem kolone.

1.6.2 Priprava raztopine vzorca Načeloma veljajo za pripravo raztopin vzorca enake zahteve. Vzorec se raztopi v ustreznem topilu, npr. tetrahidrofuranu (THF), če ga previdno pretresemo. V nobenem primeru ga ne smemo raztopiti z uporabo ultrazvočne kopeli. Kadar je potrebno, se raztopina vzorca očisti skozi membranski filter z velikostjo por med 0,2 in 2 μm. Prisotnost neraztopljenih delcev je treba zabeležiti v zaključnem poročilu, saj do tega lahko pride zaradi vrst visoke molekulske mase. Uporabiti je treba ustrezno metodo za določitev odstotka razgrajenih delcev po masi. Raztopine je treba uporabiti v 24 urah.

1.6.3 Aparat Zagotoviti je treba da je sistem GPC inerten v zvezi z uporabljenimi topili (npr. z uporabo jeklenih kapilar za topilo THF).

zbiralnik za topilo,

digestorij (kjer je primerno),

črpalka,

blažilec tresljajev (kjer je primerno),

injekcijski sistem,

kromatografske kolone,

detektor,

merilec pretoka (kjer je primerno),

snemalnik in obdelovalec podatkov,

posoda za odpadke.

1.6.4 Injekcijski sistem in sistem prenosa topila Določen volumen raztopine vzorca nanesemo na kolono bodisi z avtomatičnim vzorčevalcem bodisi ročno na natančno določeno mesto. Če pri ročnem nanosu konico brizgalke prehitro umaknemo ali pritisnemo, lahko povzročimo spremembe v ugotovljeni porazdelitvi molekulske mase. Sistem prenosa topila mora biti, kolikor je mogoče, brez tresljajev, zato je najbolje, če uporabimo blažilec tresljajev. Red stopnje pretoka je 1 ml/min.

1.6.5 Kolona Polimer je opredeljen z uporabo bodisi preproste kolone bodisi več zaporedno povezanih kolon, odvisno od vzorca. V prodaji so na voljo številni porozni materiali kolon z opredeljenimi lastnostmi (npr. velikost por, meje izločanja). Izbor separacijskega gela ali dolžine kolone je odvisen tako od lastnosti vzorca (hidrodinamični volumni, porazdelitev molekulske mase) in specifičnih pogojev za separacijo, kot so topilo, temperatura in pretok (1) (2) (3).

1.6.6 Teoretični platoji Kolona ali kombinacija kolon, uporabljenih za separacijo, mora biti opredeljen s številom teoretičnih platojev. V primeru THF kot elucijskega topila to vsebuje nanos raztopine etil benzena ali drugega ustreznega nepolarnega vzorca na kolono znane dolžine. Število teoretičnih platojev dobimo z naslednjo enačbo: N=5,54VeW1/22 ali N=16VeW2 kjer je N število teoretičnih platojev Ve elucijski volumen na maksimumu vrha W temelj širine vrha W1/2 širina vrha na polovici višine

1.6.7 Učinkovitost separacije Poleg števila teoretičnih platojev, ki predstavlja količino, ki določa širino traku, svojo vlogo igra tudi učinkovitost separacije, ki jo določa nagib kalibracijske krivulje. Učinkovitost separacije kolone dobimo iz naslednjega razmerja: Ve,Mx-Ve,(10Mx)prečni prerez kolone≥6,0 cm3cm2 kjer je: Ve, Mx elucijski volumen za polistiren z molekulsko maso Mx Ve,(10.Mx) elucijski volumen za polistiren z 10 krat večjo molekulsko maso Resolucijo sistema običajno opredelimo na naslednji način: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kjer sta: Ve1, Ve2 elucijska volumna dveh standardov polistirena na maksimumu vrha W1, W2 širini vrha pri osnovni črti M1, M2 molekulski masi pri maksimumu vrha (naj se razlikujeta s faktorjem 10). R-vrednost sistema kolone mora biti večja od 1, 7 (4).

1.6.8 Topila Vsa topila morajo biti visoke čistosti (za THF se uporablja čistost 99,5 %). Zbiralnik za topilo (če je potreben v inertnem plinskem ozračju) mora biti dovolj velik za kalibriranje kolon in nekaj analiz vzorca. Topilo je treba razpliniti preden ga s črpalko prenesemo na kolono.

1.6.9 Nadzor temperature Temperatura kritičnih internih sestavin (injekcijski zvitek, kolone, detektor in cevovod) mora biti konstantna in v skladu z izbranim topilom.

1.6.10 Detektor Namen detektorja je količinsko beleženje koncentracije iz kolone eluiranega vzorca. Da bi se izognili nepotrebni širitvi vrhov, mora kivetni volumen detektorske celice ostati čim manjši. Razen v primeru disperzije svetlobe in detektorjev viskoznosti ne sme presegati 10 μl. Za detekcijo se navadno uporablja diferencialna refraktometrija. Vendar pa, če to zahtevajo specifične lastnosti vzorca ali elucijskega topila, je mogoče uporabiti tudi druge tipe detektorjev, npr. UV/VIS, IR, detektorje viskoznosti, itd.

2. PODATKI IN POROČANJE

2.

2.1 PODATKI Za podrobne ocenjevalne kriterije kot tudi za zahteve, ki se nanašajo na zbiranje in obdelavo podatkov, se je treba sklicevati na DIN standard (1). Za vsak vzorec je treba opraviti dva samostojna poskusa. Analizirati je treba vsakega posebej. Za vsako meritev je treba določiti Mn, Mw, Mw/Mn in Mp. Potrebno je eksplicitno označiti, da so merjene vrednosti relativne vrednosti, ekvivalentne molekulskim masam uporabljenega standarda. Po določitvi retenzijskih volumnov ali retenzijskih časov (po možnosti popravljenih z uporabo internega standarda), se logaritem Mp vrednosti (kjer je Mp maskimum vrha kalibracijskega standarda) prikažejo ob eni izmed teh količin. Najmanj dve kalibracijski točki sta potrebni za dekado molekulske mase, najmanj pet meritvenih točk pa je zahtevanih za celotno krivuljo, ki bi morala pokrivati ocenjeno molekulsko maso vzorca. Končno točko nizke molekulske mase na kalibracijski krivulji določa n-heksil benzen ali katera drug ustrezen nepolaren vzorec. Povprečno število in povprečno maso molekulskih mas navadno določimo s pomočjo elektronske obdelave podatkov, ki temelji na enačbah iz oddelka 1.2. V primeru ročne digitalizacije, se lahko upošteva ASTM D 3536-91 (3). Porazdelitvena krivulja mora biti posredovana v obliki tabele ali grafa (diferencialna frekvenca ali odstotek vsot proti logaritmu M). V grafičnem prikazu mora biti normalna širina ene dekade molekulske mase 4 cm, maksimum vrha pa naj sega približno 8 cm v višino. V primeru integralnih porazdelitvenih krivulj mora biti razlika na ordinati med 0 in 100 % približno 10 cm.

2.2 PRESKUSNO POROČILO Preskusno poročilo mora vsebovati naslednje informacije:

2.2

2.2.1 Preskusna snov

razpoložljive informacije o preskusni snovi (identiteta, aditivi, nečistote),

opis obdelave vzorca, ugotovitve, problemi.

2.2.2 Inštrumenti

zbiralnik za eluat, inertni plin, razplinjanje eluata, sestava eluata, nečistote,

črpalka, blažilec tresljajev, injekcijski sistem,

separacijske kolone (proizvajalec, vse informacije o značilnostih kolon, kot so velikost por, vrsta separacije, material, itd., število, dolžina in zaporedje uporabljenih kolon),

število teoretičnih platojev kolone (ali kombinacije), učinkovitost separacije (resolucija sistema),

informacije o simetriji vrhov,

temperatura kolone, vrste nadzora temperature,

detektor (principi merjenja, tip, volumen kivete),

merilec pretoka, če je uporabljen (proizvajalec, principi merjenja),

sistem zapisovanja in obdelovanja podatkov (strojna in programska oprema).

2.2.3 Kalibriranje sistema

podroben opis metode, uporabljene za sestavo kalibracijske krivulje,

informacije o kriterijih kakovosti za to metodo (npr. korelacijski koeficient, vsota kvadratov odstopanj, itd.),

informacije o vseh ekstrapolacijah, domnevah in približevanjih, opravljenih med poskusnim postopkom in ocenitev ter obdelava podatkov,

vse uporabljene meritve za ustvarjanje kalibracijske krivulje morajo biti dokumentirane na tabeli, ki vsebuje naslednje informacije za vsako kalibracijsko točko:

ime vzorca,

proizvajalec vzorca,

značilne vrednosti standardov Mp, Mn, Mw in Mw/Mn, kot jih posreduje proizvajalec, ali kot so izpeljane iz naknadnih meritev, skupaj s podrobnostmi o metodi določanja,

injekcijski volumen in injekcijska koncentracija,

Mp vrednost, uporabljena za kalibriranje,

elucijski volumen ali popravljeni retenzijski čas, izmerjen pri maksimumih vrha,

Mp, izračunan na maksimumu vrha,

odstotek odstopanja od izračunanega Mpin kalibracijska vrednost.

2.2.4 Ocenjevanje

ocena na časovni podlagi: metode, uporabljene za zagotovitev zahtevane obnovljivosti (metode popravljanja, interni standard, itd.),

informacije o tem, ali je ocena izvedena na podlagi elucijskega volumna ali retenzijskega časa,

informacije o mejah ocenjevanja, če vrh ni analiziran v celoti,

opis blažilnih metod, če so uporabljene,

postopki priprave in predobdelave vzorca,

prisotnost morebitnih neraztopljenih delcev,

injekcijski volumen (μl) in injekcijska koncentracija (mg/μl),

ugotovitve, ki kažejo na učinke, ki peljejo k odklonom od idealnega GPC profila,

podroben opis vseh sprememb v preskusnih postopkih,

podrobnosti o stopnjah odstopanj,

vse druge informacije in ugotovitve, ki so pomembne za razlago rezultatov.

3.(1)(2)(3)(4)

VIRI DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size – Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.19 VSEBNOST POLIMEROV NIZKE MOLEKULSKE MASE

A.19

1. METODA Ta gelska permeacijska kromatografija metoda je posnetek OECD smernice 119 (1996). Temeljna načela in nadaljnje tehnične informacije so navedene v literaturi 1.

1.

1.1 UVOD Ker so lastnosti polimerov tako raznolike, je nemogoče opisati eno samo metodo, s katero bi bili natančno določeni pogoji za separacijo in ocenjevanje, ki bi pokrivali vse možnosti in posebnosti, do katerih pride pri separaciji polimerov. Zlasti se gelski permeacijski kromatografiji (GPC) pogosto ne da podrediti kompleksnih sistemov polimerov. Kadar GPC metode ni mogoče uporabiti, lahko molekulsko maso določimo s pomočjo drugih metod (glej Prilogo). V takšnih primerih je treba uporabljeno metodo natančno obrazložiti in utemeljiti. Opisana metoda temelji na DIN standardu 55672 (1). Ta DIN standard vsebuje podrobne informacije o načinu izvajanja poskusov in ocenjevanja podatkov. V primeru, da je treba pogoje poskusa spremeniti, je treba takšne spremembe utemeljiti. Lahko uporabimo tudi druge standarde, če so v celoti podprti z viri. Opisana metoda uporablja vzorce polistirena znane polidisperznosti za kalibriranje in jo bo mogoče treba spremeniti, da bo ustrezala določenim polimerom, npr. v vodi topnim polimerom in razvejanim polimerom z dolgimi verigami.

1.2 DEFINICIJE IN ENOTE Nizka molekulska masa je arbitrarno opredeljena kot molekulska masa pod 1000 daltoni. Povprečno število molekulske mase Mn in povprečno maso molekulske mase Mw določimo s pomočjo naslednjih enačb: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1Hi × MiΣni=1Hi kjer je HI stopnja signala detektorja od osnovne črte za retenzijski volumen Vi Mi molekulska masa frakcije polimera pri retenzijskem volumnu Vi in n število podatkovnih točk. Razpon porazdelitve molekulske mase, ki je mera za disperznost sistema, se kaže z razmerjem Mw/Mn.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Porazdelitev molekulske mase vzorca in povprečno molekulsko maso (Mn, Mw) lahko določimo z uporabo GPC metode. GPC je poseben tip tekočinske kromatografije, kjer vzorec separiramo v skladu s hidrodinamičnimi volumni posameznih sestavin (2). Separacija se izvede, ko vzorec preteče skozi kolono, napolnjeno s poroznim materialom, običajno z organskim gelom. Majhne molekule lahko predrejo skozi pore, večje molekule pa se izločijo. Pot večjih molekul je tako krajša in te so najprej eluirane. Srednje velike molekule predrejo skozi nekaj por in so eluirane pozneje. Najmanjše molekule, katerih povprečen hidrodinamični premer je manjši od por gela, lahko predrejo skozi vse pore. Te so eluirane zadnje. V idealnih razmerah na separacijo v celoti vpliva velikost molekulskih vrst, vendar pa se v praksi težko izognemo vsaj nekaterim oviraj očim učinkom absorbcije. Neenakomerna napolnjenost kolon in mrtvi volumni lahko razmere poslabšajo (2). Ugotavljanje izvedemo, npr., na osnovi refrakcijskega indeksa ali UV absorpcije in dobimo preprosto distribucijsko krivuljo. Da pa bi na krivulji opredelili dejanske vrednosti molekulske mase, moramo kalibrirati kolono, tako da skoznjo pretečejo polimeri z znano molekulsko maso in, v idealnem primeru, v glavnem podobno strukturo, npr. različni standardi polistirena. Rezultat Gaussove krivulje, čeprav včasih popačen z majhnim repom na strani nizke molekulske mase, je običajno tak, da navpična os kaže količino, izraženo z maso, raznih eluiranih vrst molekulske mase, vodoravna os pa logaritem molekulske mase. Vsebnost nizke molekulske mase izhaja iz te krivulje. Izračun je lahko točen le, če se vrste z nizko molekulsko maso ekvivalentno na osnovi mase odzivajo na polimer kot celota.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6

1.6.3 Korekcija vsebnosti nečistot in aditivov Ponavadi je nujno opraviti korekcijo vsebnosti vrst z M < 1000 za prispevek prisotnih nepolimerskih specifičnih sestavin (npr. nečistote in/ali aditivi), razen če je izmerjena vsebnost že < 1 %. To izvedemo z direktno analizo polimerske raztopine ali GPC eluata. V primerih, kadar je eluat pri prehajanju skozi kolono preveč razredčen za nadaljnjo analizo, ga je treba koncentrirati. Mogoče bo potrebno izhlapeti eluat do suhega stanja in ga še enkrat raztopiti. Koncentriranje eluata se mora izvesti v pogojih, ki zagotavljajo, da na eluatu ne pride do nikakršnih sprememb. Tretiranje eluata po opravljeni GPC je odvisno od analitične metode, uporabljene za kvantitativno določitev.

1.6.4 Aparat GPC aparat vsebuje naslednje komparente: Zagotoviti je treba da je sistem GPC inerten v zvezi z uporabljenimi topili (npr. z uporabo jeklenih kapilar za topilo THF).

zbiralnik za topilo,

digestorij (kjer je primerno),

črpalka,

blažilec tresljajev (kjer je primerno),

injekcijski sistem,

kromatografske kolone,

detektor,

merilec pretoka (kjer je primerno),

snemalnik in obdelovalec podatkov,

posoda za odpadke.

1.6.5 Injekcijski sistem in sistem prenosa topila Določen volumen raztopine vzorca nanesemo na kolono bodisi z avtomatičnim vzorčevalcem bodisi ročno na natančno določeno mesto. Če pri ročnem nanosu konico brizgalke prehitro umaknemo ali pritisnemo, lahko povzročimo spremembe v ugotovljeni porazdelitvi molekulske mase. Sistem prenosa topila mora biti, kolikor je mogoče, brez tresljajev, zato je najbolje, če uporabimo blažilec tresljajev. Red stopnje pretoka je 1 ml/min.

1.6.6 Kolona Polimer je opredeljen z uporabo bodisi preproste kolone bodisi več zaporedno povezanih kolon, odvisno od vzorca. V prodaji so na voljo številni porozni materiali kolon z opredeljenimi lastnostmi (npr. velikost por, meje izločanja). Izbor separacijskega gela ali dolžine kolone je odvisen tako od lastnosti vzorca (hidrodinamični volumni, porazdelitev molekulske mase) in specifičnih pogojev za separacijo, kot so topilo, temperatura in pretok (1) (2) (3).

1.6.7 Teoretični platoji Kolona ali kombinacija kolon, uporabljenih za separacijo, mora biti opredeljen s številom teoretičnih platojev. V primeru THF kot elucijskega topila to vsebuje nanos raztopine etil benzena ali drugega ustreznega nepolarnega vzorca na kolono znane dolžine. Število teoretičnih platojev dobimo z naslednjo enačbo: N=5,54VeW1/22 ali N=16VeW2 kjer je N število teoretičnih platojev Ve elucijski volumen na maksimumu vrha W temelj širine vrha W1/2 širina vrha na polovici višine

1.6.8 Učinkovitost separacije Poleg števila teoretičnih platojev, ki predstavlja količino, ki določa širino traku, svojo vlogo igra tudi učinkovitost separacije, ki jo določa nagib kalibracijske krivulje. Učinkovitost separacije kolone dobimo iz naslednjega razmerja: Ve,Mx-Ve,(10Mx)prečni preres kolone≥6,0cm3cm2 kjer je: Ve, Mx elucijski volumen za polistiren z molekulsko maso Mx Ve,(10.Mx) elucijski volumen za polistiren z 10 krat večjo molekulsko maso Resolucijo sistema običajno opredelimo na naslednji način: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 kjer sta: Ve1, Ve2 elucijska volumna dveh standardov polistirena na maksimumu vrha W1, W2 širini vrha pri osnovni črti M1, M2 molekulski masi pri maksimumu vrha (naj se razlikujeta s faktorjem 10). R-vrednost sistema kolone mora biti večja od 1,7 (4).

1.6.9 Topila Vsa topila morajo biti visoke čistosti (za THF se uporablja čistost 99,5 %). Zbiralnik za topilo (če je potreben v inertnem plinskem ozračju) mora biti dovolj velik za kalibriranje kolon in nekaj analiz vzorca. Topilo je treba razpliniti preden ga s črpalko prenesemo na kolono.

1.6.10 Nadzor temperature Temperatura kritičnih internih sestavin (injekcijski zvitek, kolone, detektor in cevovod) mora biti konstantna in v skladu z izbranim topilom.

1.6.11 Detektor Namen detektorja je količinsko beleženje koncentracije iz kolone eluiranega vzorca. Da bi se izognili nepotrebni širitvi vrhov, mora kivetni volumen detektorske celice ostati čim manjši. Razen v primeru disperzije svetlobe in detektorjev viskoznosti ne sme presegati 10 μ l. Za detekcijo se navadno uporablja diferencialna refraktometrija. Vendar pa, če to zahtevajo specifične lastnosti vzorca ali elucijskega topila, je mogoče uporabiti tudi druge tipe detektorjev, npr. UV/VIS, IR, detektorje viskoznosti, itd.

2. PODATKI IN POROČANJE

2.

2.1 PODATKI Za podrobne ocenjevalne kriterije kot tudi za zahteve, ki se nanašajo na zbiranje in obdelavo podatkov, se je treba sklicevati na DIN standard (1). Za vsak vzorec je treba opraviti dva samostojna poskusa. Analizirati je treba vsakega posebej. V vseh primerih je bistveno, da določimo tudi podatke iz praznih polj, s katerimi smo ravnali v enakih pogojih kot vzorec. Potrebno je eksplicitno označiti, da so merjene vrednosti relativne vrednosti, ekvivalentne molekulskim masam uporabljenega standarda. Po določitvi retenzijskih volumnov ali retenzijskih časov (po možnosti popravljenih z uporabo internega standarda), se logaritem Mp vrednosti (kjer je Mp maskimum vrha kalibracijskega standarda) prikažejo ob eni izmed teh količin. Najmanj dve kalibracijski točki sta potrebni za dekado molekulske mase, najmanj pet meritvenih točk pa je zahtevanih za celotno krivuljo, ki bi morala pokrivati ocenjeno molekulsko maso vzorca. Končno točko nizke molekulske mase na kalibracijski krivulji določa n-heksil benzen ali kateri drug ustrezen nepolaren vzorec. Povprečno število in povprečno maso molekulskih mas navadno določimo s pomočjo elektronske obdelave podatkov, ki temelji na enačbah iz oddelka 1.2. V primeru ročne digitalizacije, se lahko upošteva ASTM D 3536-91 (3). Če na koloni ostane kak netopen polimer, bo njegova molekulska masa verjetno višja od mase topne frakcije; v kolikor je ne bi upoštevali, bi to lahko pripeljalo do previsoke ocene vsebnosti nizke molekulske mase. Smernice za korekcijo vsebnosti nizke molekulske mase za netopen polimer se nahajajo v Prilogi. Porazdelitvena krivulja mora biti posredovana v obliki tabele ali grafa (diferencialna frekvenca ali odstotek vsot proti logaritmu M). V grafičnem prikazu mora biti normalna širina ene dekade molekulske mase 4 cm, maksimum vrha pa naj sega približno 8 cm v višino. V primeru integralnih porazdelitvenih krivulj mora biti razlika na ordinati med 0 in 100 % približno 10 cm.

2.2 PRESKUSNO POROČILO Preskusno poročilo mora vsebovati naslednje informacije:

2.2

2.2.1 Preskusna snov

razpoložljive informacije o preskusni snovi (identiteta, aditivi, nečistote),

opis obdelave vzorca, ugotovitve, problemi.

2.2.2 Inštrumenti

zbiralnik za eluat, inertni plin, razplinjanje eluata, sestava eluata, nečistote,

črpalka, blažilec tresljajev, injekcijski sistem,

separacijske kolone (proizvajalec, vse informacije o značilnostih kolon, kot so velikost por, vrsta separacije, material, itd., število, dolžina in zaporedje uporabljenih kolon),

število teoretičnih platojev kolone (ali kombinacije), učinkovitost separacije(resolucija sistema),

informacije o simetriji vrhov,

temperatura kolone, vrste nadzora temperature,

detektor (principi merjenja, tip, volumen kivete),

merilec pretoka, če je uporabljen (proizvajalec, principi merjenja),

sistem zapisovanja in obdelovanja podatkov (strojna in programska oprema).

2.2.3 Kalibriranje sistema

podroben opis metode, uporabljene za sestavo kalibracijske krivulje,

informacije o kriterijih kakovosti za to metodo (npr. korelacijski koeficient, vsota kvadratov odstopanj, itd.),

informacije o vseh ekstrapolacijah, domnevah in približevanjih, opravljenih med poskusnim postopkom in ocenitev ter obdelava podatkov,

vse uporabljene meritve za ustvarjanje kalibracijske krivulje morajo biti dokumentirane na tabeli, ki vsebuje naslednje informacije za vsako kalibracijsko točko:

ime vzorca,

proizvajalec vzorca,

značilne vrednosti standardov Mp, Mn, Mw in Mw/Mn, kot jih posreduje proizvajalec, ali kot so izpeljane iz naknadnih meritev, skupaj s podrobnostmi o metodi določanja,

injekcijski volumen in injekcijska koncentracija,

Mp vrednost, uporabljena za kalibriranje,

elucijski volumen ali popravljeni retenzijski čas, izmerjen pri maksimumih vrha,

Mp, izračunan na maksimumu vrha,

odstotek odstopanja od izračunanega Mpin kalibracijska vrednost.

2.2.4 Informacije o vsebnosti nizke molekulske mase

opis uporabljenih metod pri analizi in način izvedbe poskusov,

informacije o odstotkih vsebnosti vrst nizke molekulske mase (w/w), ki se nanaša na celotni vzorec,

informacije o nečistotah, aditivih in drugih nepolimerskih vrstah v odstotkih po teži, ki se nanašajo na celoten vzorec.

2.2.5 Ocenjevanje

ocena na časovni podlagi: metode, uporabljene za zagotovitev zahtevane obnovljivosti (metode popravljanja, interni standard, itd.),

informacije o tem, ali je ocena izvedena na podlagi elucijskega volumna aliretenzijskega časa,

informacije o mejah ocenjevanja, če vrh ni analiziran v celoti,

opis blažilnih metod, če so uporabljene,

postopki priprave in predobdelave vzorca,

prisotnost morebitnih neraztopljenih delcev,

injekcijski volumen (μl) in injekcijska koncentracija (mg/μl),

ugotovitve, ki kažejo na učinke, ki peljejo k odklonom od idealnega GPC profila,

podroben opis vseh sprememb v preskusnih postopkih,

podrobnosti o stopnjah odstopanj,

vse druge informacije in ugotovitve, ki so pomembne za interpretacijo rezultatov.

3.(1)(2)(3)(4)

LITERATURA DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

A.20 OBNAŠANJE RAZTOPINE IZVLEČKA POLIMEROV V VODI

A.20

1. METODA Opisana metoda je v skladu s revidirano različico OECD smernice 120 (1997). Nadaljnje tehnične informacije so navedene v literaturi (1).

1.

1.1 UVOD Za določene polimere, kot so emulzijski polimeri, bo mogoče potrebno opraviti začetno pripravo, preden se uporabi tukaj podana metoda. Metoda se ne uporablja pri tekočinskih polimerih in polimerih, ki v preskusnih pogojih reagirajo z vodo. Kadar metoda ni izvedljiva ali mogoča, lahko obnašanje raztopine/izvlečka raziščemo s pomočjo drugih metod. V takšnih primerih je treba uporabljeno metodo natančno obrazložiti in utemeljiti.

1.2 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.3 PRINCIPI PRESKUSNE METODE Obnašanje raztopine/izvlečka polimerov v vodnem gojišču določimo z uporabo metode z bučko (glej A.6 vodna topnost, metoda z bučko), upoštevajoč spodaj opisane spremembe.

1.4 KRITERIJI KAKOVOSTI Jih ni.

1.5 OPIS PRESKUSNE METODE

1.5

1.5.1 Oprema Za metodo je potrebna naslednja oprema:

drobilna naprava, npr. mlinček za proizvajanje delcev znane velikosti,

aparat za tresenje z možnostjo nadzora temperature,

sistem membranskega filtra,

ustrezna oprema za analizo,

standardizirana sita.

1.5.2 Priprava vzorca Reprezentativni vzorec je treba najprej z uporabo ustreznih sit zmanjšati na velikost delca med 0,125 in 0,25 mm. Mogoče bo potrebno hlajenje, da se doseže stabilnost vzorca ali zaradi procesa drobitve. Materiali gumijaste narave se lahko na temperaturi tekočega dušika zdrobijo (1). Če zahtevane frakcije velikosti delca ni mogoče doseči, je treba velikost delca zmanjšati, kolikor je mogoče, in poročati o rezultatu. V poročilu je treba označiti, kako smo zdrobljen vzorec hranili pred preskusom.

1.5.3 Postopek Tri vzorce po 10 g preskusne snovi odmerimo v vsako izmed treh posod, zaprtih s steklenimi zamaški, in v vsako posodo dodamo 1000 ml vode. Če se izkaže, da je ravnanje s količino 10 g polimera neizvedljivo, je treba uporabiti naslednjo najvišjo količino, s katero je mogoče ravnati, in temu ustrezno prilagoditi količino vode. Posode tesno zamašimo in jih pretresemo pri 20 oC. Uporabiti moramo napravo za tresenje ali mešanje, ki lahko deluje na stalni temperaturi. Po 24 urah vsebino vsake posamezne posode centrifugiramo ali prefiltriramo, koncentracijo polimera v čisti vodni fazi pa določimo z ustrezno analitično metodo. Če ustreznih analitičnih metod za vodno fazo ni na voljo, lahko skupno topljivost/izločljivost ocenimo iz suhe teže prefiltriranega ostanka ali centrifugirane oborine. Ponavadi je treba po količini razločiti nečistote in aditive na eni strani in vrste z nizko molekulsko maso na drugi. V primeru gravimetrične določitve je prav tako pomembno opraviti prazni preskus brez uporabe vseh preskusnih snovi, da bi izračunali ostanke, do katerih pride med poskusnim postopkom. Obnašanje raztopine/izvlečka polimerov v vodi pri 37 oC na pH 2 in pH 9 lahko določimo na enak način, kot je opisano za izvajanje eksperimenta pri 20 oC. pH vrednosti se lahko dosežejo z dodajanjem bodisi primernih puferjev ali ustreznih kislin ali baz, kot so hidrokloridna kislina, acetatna kislina, natrij analitične stopnje ali kalijev hidroksid ali NH3. Glede na uporabljeno metodo analize moramo izpeljati enega ali dva preskusa. Kadar je za neposredno analizo vodne faze polimerskega delca na voljo dovolj specifičnih metod, bi moral zadostovati en sam preskus, kot je opisano zgoraj. Kadar pa takšne metode niso na voljo in je določitev obnašanja raztopine/izvlečka polimera omejena na posredno analizo z določanjem zgolj skupne vsebnosti organskega karbona (TOC) vodnega izvlečka, je treba opraviti dodaten preskus. Ta dodaten preskus je treba opraviti v treh izvedbah in uporabiti 10-krat manjše vzorce polimera in enake količine vode, kot je bila uporabljena v prvem preskusu.

1.5.4 Analiza

1.5.4

1.5.4.1 Preskus, opravljen z eno velikostjo vzorca Metode so lahko na voljo za neposredno analizo sestavin polimera v vodni fazi. Po drugi strani je mogoče upoštevati tudi posredno analizo raztopljenih/izločenih sestavin polimera z določanjem skupne vsebnosti topnih delcev in korekcijo za sestavine, ki niso značilne za polimer. Analiza vodne faze za vse polimerske vrste je mogoča: bodisi z dovolj občutljivo metodo, npr.: ali z vakuumskim izhlapevanjem do suhega stanja vodnega ekstrakta in spektroskopijo (IR, UV, itd.) ali AAS/ICP analizo ostanka. Če analiza vodne faze kot takšne ni izvedljiva, je treba vodni izvleček izvleči z organskim topilom, ki ni združljiv z vodo, npr. s kloriranim hidrokarbonom. Topilo nato izhlapimo, ostanek pa analiziramo kot zgoraj, da bi ugotovili njegovo vsebnost v ustreznem polimeru. Vsako sestavino v tem ostanku, ki je prepoznana kot nečistota ali aditiv, je treba odšteti, da bi določili stopnjo raztopine/izvlečka samega polimera. Kadar so prisotne relativno velike količine takšnih materialov, je mogoče ostanek potrebno analizirati, na primer, s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) ali plinsko kromatografijo (GC), da bi razločili nečistote od prisotnega monomera in vrst, ki so iz monomera izpeljane, s čimer nato določimo pravo vsebnost teh vrst. V nekaterih primerih lahko zadostuje preprosto izhlapevanje organskega topila do suhega stanja in tehtanje suhega ostanka.

TOC z uporabo persulfata ali digeriranjem dikromata za sprostitev CO2, ki mu sledi ocena z IR ali kemična analiza,

atomska absorpcijska spektrometrija (AAS) ali njen emisijski ekvivalent induktivno sklopljene plazme (ICP) za polimere, ki vsebujejo silikon ali kovino,

UV absorpcija ali spektrofluorometrija za akrilne polimere,

LC-MS za vzorce z nizko molekulsko maso,

1.5.4.2 Preskus, opravljen z dvema različnima velikostma vzorca Vsi vodni izvlečki se analizirajo za TOC. Gravimetrična določitev se izvede na neraztopljenem/neizvlečenem delu vzorca. Če po centrifugiranju ali filtriranju vsebnosti vsake posode ostanek polimera ostane pritrjen na stene posode, je treba posodo sprati s filtratom, dokler z nje ne odstranimo vseh vidnih ostankov. Temu sledi ponovno centrifugiranje ali filtriranje filtrata. Ostanke, ki ostanejo na filtru ali v centrifugini cevi posušimo pri 40 oC v vakuumu in jih stehtamo. S sušenjem nadaljujemo, dokler ne dosežemo konstantne teže.

2. PODATKI

2.

2.1 PRESKUS, OPRAVLJEN Z ENO VELIKOSTJO VZORCA Posamezni rezultati za vsako izmed treh bučk in povprečne vrednosti je treba podati in izraziti v enotah mase na volumen raztopine (značilno mg/l) ali mase na maso vzorca polimera (značilno mg/g). Poleg tega je treba podati tudi izgubo teže vzorca (izračunano kot teža vzorca, deljeno s težo začetnega vzorca). Izračunati je treba relativne standardne deviacije (RDS). Za celotno snov (polimer + bistveni aditivi, itd.) in samo za polimere (t.j. po odštetju prispevka takšnih aditivov) je treba podati posamezne številke.

2.2 PRESKUS, OPRAVLJEN Z DVEMA RAZLIČNIMA VELIKOSTIMA VZORCA Posamezne TOC vrednosti vodnih izvlečkov dveh trojnih poskusov in povprečno vrednost za vsak poskus je treba podati izraženo v enotah mase na volumen raztopine (značilno mgC/l), kakor tudi v enotah mase na težo začetnega vzorca (značilno mgC/g). Če med rezultatom na visokem in nizkem razmerju vzorec/voda ni razlike, lahko to pomeni, da so bile vse izločljive sestavine zares izvlečene. V tem primeru ponavadi direktna analiza ni potrebna. Posamezne teže ostankov je treba podati izražene v odstotku začetnih tež vzorca. Povprečne vrednosti je treba izračunati za vsak poskus. Razlike med 100 % in dobljenimi odstotki predstavljajo odstotke topljivega in izločljivega materiala v izvirnem vzorcu.

3. POROČANJE

3.

3.1 PRESKUSNO POROČILO Preskusno poročilo mora vsebovati naslednje informacije:

3.1

3.1.1 Preskusna snov

razpoložljive informacije o preskusni snovi (identiteta, aditivi, nečistote, vsebnost vrst z nizko molekulsko maso).

3.1.2 Poskusni pogoji

opis uporabljenih postopkov in poskusnih pogojev,

opis analitičnih in detekcijskih metod.

3.1.3 Rezultati

rezultati o topnosti/izločljivosti v mg/l; posamezne in povprečne vrednosti za ekstrakcijske preskuse v različnih raztopinah, porazdeljenih v vsebnosti polimera in nečistotah, aditivih, itd.

rezultati topnosti/izločljivosti v mg/g polimera,

TOC vrednosti vodnega ekstrakta, masa vzorca in izračunani odstotki, če so merjeni,

pH vsakega posameznega vzorca,

informacije o praznih vrednostih,

kjer je potrebno, napotki o kemični nestabilnosti preskusne snovi med preskusnim postopkom in analitičnim procesom,

vse informacije, ki so pomembne za interpretacijo rezultatov.

4.(1) LITERATURA DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21 OKSIDATIVNE LASTNOSTI (TEKOČE SNOVI)

A.21

1. METODA

1.

1.1 UVOD Ta metoda preskušanja je namenjena merjenju potenciala tekoče snovi za povečanje stopnje gorenja ali intenzivnosti gorenja vnetljive snovi ali za tvorbo mešanice z vnetljivo snovjo, ki se sama vname, ko se obe temeljito premešata. Njena podlaga je preskus ZN za oksidativne tekoče snovi (1) in mu je enakovredna. Ker je metoda A.21 v prvi vrsti namenjena izpolnjevanju zahtev Uredbe 1907/2006, je potrebna primerjava le z eno referenčno snovjo. Če je pričakovati, da se bodo rezultati preskusov uporabljali za druge namene, bo morda potrebno preskušanje in primerjava z dodatnimi referenčnimi snovmi. Ta preskus je treba opraviti, kadar preverjanje strukturne formule nedvomno pokaže, da snov ne more reagirati eksotermično z vnetljivim materialom. Pred opravljanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o možnih eksplozivnih lastnostih snovi. Ta preskus se ne uporablja za trdne snovi, pline, eksplozivne ali zelo lahko vnetljive snovi, ali organske perokside. Tega preskusa ni treba narediti, kadar so rezultati za preskusno snov iz preskusa ZN za oksidativne tekoče snovi (1) že na voljo.

1.2 DEFINICIJE IN ENOTE Povprečni čas dvigovanja tlaka je povprečje izmerjenega časa za mešanico v preskusu, da bi se zagotovil dvig tlak s 695 kPa na 2070 kPa nad zračnim tlakom.

1.3 REFERENČNA SNOV Potrebna je 65 % (m/m) vodna dušikova kislina (analitske stopnje) kot referenčna snov. Če izvajalec preskusa predvideva, da bi se rezultati tega preskusa lahko uporabili za druge namene, je lahko ustrezno tudi preskušanje z dodatnimi referenčnimi snovmi.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Tekoča snov, ki jo je treba preskusiti, se zmeša v razmerju 1 proti 1 glede na maso, z vlaknato celulozo in vlije v tlačno posodo. Če med mešanjem ali polnjenjem pride do samovžiga, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Če samovžig ne nastane, se opravi preskus v celoti. Mešanica se segreje v tlačni posodi, določi se povprečni čas, potreben za dvig tlaka s 690 kPa na 2070 kPa nad zračnim tlakom. To se primerja s povprečnim časom dviga tlaka za mešanico 1: 1 referenčne snovi/referenčnih snovi in celuloze.

1.5 KRITERIJI KAKOVOSTI V seriji petih poskusov na eni snovi se rezultati ne smejo razlikovati za več kakor 30 % od aritmetične sredine. Rezultate, ki se razlikujejo za več kakor 30 % od aritmetične sredine, je treba zavreči, izboljšati postopek mešanja in polnjenja in ponoviti preskušanje.

1.6 OPIS METODE

1.6

1.6.1 Priprava

1.6.1

1.6.1.1 Vnetljiva snov Posušena vlaknata celuloza z dolžino vlaken med 50 in 250 μm in povprečni premerom 25 μm se uporablja kot vnetljivi material. Suši se 4 ure do konstantne teže v plasti, ki je debela največ 25 mm, pri 105 oC in se hrani v eksikatorju, s snovjo za sušenje, dokler se ne ohladi in dokler ni potrebna za uporabo. Vsebnost vode v posušeni celulozi mora biti manjša kakor 0,5 % na suho maso. Če je potrebno, se mora čas sušenja podaljšati, da bi se to doseglo. Med preskusom je treba ves čas uporabljati isto šaržo celuloze.

1.6.1.2 Naprava

1.6.1.2

1.6.1.2.1 Tlačna posoda Potrebna je tlačna posoda. Posoda je sestavljena iz cilindrične jeklene tlačne posode, dolžine 89 mm z zunanjim premerom 60 mm (glej sliko 1). Dve ravni držali se strojno pritrdita na nasprotnih straneh (zmanjšujeta prerez posode na 50 mm), da jo je lažje držati pri namestitvi sprožilnega mehanizma in oddušnega ventila. Posoda, ki ima izvrtino premera 20 mm, ima na obeh straneh do globine 19 mm vrezane navoje, ki ustrezajo 1' britanske standardne cevi (BSP) ali metrično enakovredni cevi. Zračni ventil v obliki stranske ročice se privije v ukrivljeni sprednji del tlačne posode 35 mm od enega konca in pod kotom 90o glede na strojno obdelani ravnini. Za to je izvrtana 12 mm globoka izvrtina z navoji za privijanje 1/2 BSP (ali metrično enakovrednega) navoja na koncu stranske ročice. Če je potrebno, pritrdimo za zatesnitev proti uhajanju plina inertno tesnilo. Stranska ročica sega 55 mm za ohišje tlačne posode in ima izvrtino 6 mm. Konec stranske ročice ima izrezane navoje za pritrditev naprave za spreminjanje pritiska z opno. Uporabimo lahko katero koli napravo za merjenje tlaka, pod pogojem, da nanjo ne vplivajo vroči plini ali razpadli produkti in da se lahko odziva na stopnje dviga tlaka 690–2070 kPa v manj kakor 5 ms. Konec tlačne posode, ki je najbolj oddaljen od stranske ročice, se zapre s sprožilnim mehanizmom, ki je opremljen z dvema elektrodama, od katerih je ena izolirana od ohišja mehanizma, druga pa ne. Drugi konec tlačne posode je zaprt z okroglo razpočno ploščo (tlak preboja približno 2200 kPa), ki jo drži na mestu vijak z 20 mm izvrtino. Če je potrebno, pritrdimo za zatesnitev proti uhajanju plina inertno tesnilo. Podporno podnožje (slika 2) drži sklop v pravilnem položaju med uporabo. Ponavadi se sestoji iz osnovne plošče iz mehkega jekla velikosti 235 mm × 184 mm × 6 mm, na katero je pritrjen po dolžini 185 mm profil dimenzij kvadrata 70 mm × 70 mm × 4 mm. Iz kvadratnega profila se izrežeta po dolžini dve nasprotni stranici, tako da nastane nad njima 86 mm dolg podest, ki ima dve nogi z ravnima stranicama. Konca teh ravnih stranic sta odrezana pod kotom 60 o na horizontalno ravnino in privarjena na osnovno ploščo. Utor, ki je 22 mm širok in 46 mm globok, je strojno vrezan v eno stran gornjega konca podlage, da se vanj uleže stranska ročica, kadar potisnemo sklop s tlačno posodo navzdol, najprej konec s sprožilnim mehanizmom, v podpornik podesta. Na spodnjo zunanjo prednjo stran kvadratnega profila je privarjen kos jekla, širine 30 mm in debeline 6 mm, ki deluje kakor distančnik. Dva 7 mm palčna vijaka, privita na nasprotni strani, pomagata držati tlačno posodo trdno na mestu. 12 mm široki trakovi iz 6 mm debelega jekla, privarjeni na stranske dele, ob robu podlage kvadratnega profila, podpirata tlačno posodo s spodnje strani.

1.6.1.2.2 Sistem vžiga Sistem vžiga je sestavljen iz 25 cm dolge žice iz niklja in kroma s premerom 0,6 mm in uporom 3,85 ohm/m. Žica se zvije s palico premera 5 mm v obliko tuljave in se pritrdi na elektrodo sprožilnega mehanizma. Tuljava mora imeti eno od oblik, prikazanih na sliki 3. Razdalja med dnom posode in spodnjim delom tuljave vžiga mora znašati 20 mm. Če elektrodi nista nastavljivi, je treba izolirati konca žice za vžig med tuljavo in dnom posode s keramičnim obročem. Žico segreva neprekinjeno tokovno napajanje, ki lahko zagotovi moč najmanj 10 amperov.

1.6.2 Potek preskušanja Naprava, ki se sestoji iz zračnega ventila in sistema segrevanja, vendar brez nameščene okrogle razpočne plošče, je podprta s koncem s koncem, kjer je sprožilni mehanizem, obrnjenim navzdol. 2,5 g tekočine, ki jo je treba preskusiti, se zmeša z 2,5 g posušene celuloze v stekleni čaši in uporabimo stekleno paličico za mešanje. Zaradi varnosti je treba mešanje opraviti z varnostnim ščitom med izvajalcem preskusa in mešanico. Če se mešanica vname med mešanjem ali polnjenjem, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Mešanica se dodaja v majhnih odmerkih po kapljicah v tlačno posodo, prepričati se je treba, da se mešanica nabira okoli tuljave vžiga in je z njo v dobrem stiku. Pomembno je, da se tuljava ne deformira med postopkom pakiranja, ker lahko to povzroči zmotne rezultate. Namesti se razpočna plošča in tesno privije vijak, ki jo drži na njenem mestu. Napolnjeno posodo prenesemo na sprožilno podporno podnožje, z okroglo razpočno ploščo obrnjeno navzgor, nameščena mora biti v ustrezni oklepni dimni omarici ali sprožilni celici. Tokovno napajanje se priključi na zunanje priključne letve sprožilnega mehanizma in uporabi moč 10 A. Čas med začetkom mešanje in vključitvijo močnostnega napajanja ne sme presegati 10 minut. Signal, ki ga oddaja zračni ventil za tlak, se zabeleži z ustreznim sistemom, ki omogoča hkrati vrednotenje in oblikovanje stalnega zapisa dobljenega časovnega tlačnega profila (npr. začasen zapisovalnik skupaj z zapisovalnikom grafa). Mešanica se segreva, dokler se okrogla razpočna plošča ne razpoči ali dokler ne mine vsaj 60 s. Če razpočna plošča poči, je treba pustiti mešanico, da se ohladi, preden se naprava skrbno razstavi in pri tem upoštevati varnostne ukrepe zaradi podtlaka, ki lahko nastane. Izvede se 5 poskusov s preskusno snovjo in z referenčno snovjo/snovmi. Čas, potreben za dvig tlaka s 690 kPa na 2070 kPa nad zračni tlak, se zabeleži. Izračuna se povprečni čas dviga tlaka. V nekaterih primerih lahko snovi sprožijo dvig tlaka (previsok ali prenizek tlak) zaradi kemijskih reakcij, ki niso značilne za oksidativne lastnosti snovi. V takšnih primerih bo morda potrebno preskus ponoviti z inertno snovjo, npr. z diatomejsko zemljo (kieselguhr) namesto celuloze za pojasnitev vrste reakcije.

2. PODATKI Časi dviga tlaka za preskusno snov in referenčno snov/snovi. Časi dviga tlaka za preskuse z inertno snovjo, če se opravljajo.

2.

2.1 Tabela 1 Primer rezultatov

OBRAVNAVANJE REZULTATOV Izračunajo se povprečni časi dviga tlaka za preskusno snov in referenčno snov/snovi. Izračuna se povprečni čas dviga tlaka za preskuse z inertno snovjo (če se opravljajo). Nekateri primeri rezultatov so prikazani v Tabeli 1. Snov Povprečni čas dviga tlaka za mešanico s celulozo 1:1 (ms) Amonijev dikromat, nasičena vodna raztopina 20800 Kalcijev nitrat, nasičena vodna raztopina 6700 Železov nitrat, nasičena vodna raztopina 4133 Litijev perklorat, nasičena vodna raztopina 1686 Magnezijev perklorat, nasičena vodna raztopina 777 Nikljev nitrat, nasičena vodna raztopina 6250 Dušikova kislina, 65 % 4767 Perklorova kislina, 50 % 121 Perklorova kislina, 55 % 59 Kalijev nitrat, 30 % vodna raztopina 26690 Srebrov nitrat, nasičena vodna raztopina Natrijev klorat, 40 % vodna raztopina 2555 Natrijev nitrat, 45 % vodna raztopina 4133 Inertna snov Vodna celuloza

3. POROČILO

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:

vrsto, sestavo, čistost, itd. preskušane snovi,

koncentracijo preskusne snovi,

postopek sušenja uporabljene celuloze,

vsebnost vode uporabljene celuloze,

rezultate meritev,

rezultate preskusov z inertno snovjo, če so bili izvedeni,

izračunane povprečne čase dviga tlaka,

vsa odstopanja od te metode in razloge zanje,

vse dodatne informacije ali pripombe, ki so pomembne za razlago rezultatov.

3.2 RAZLAGA REZULTATOV Rezultati preskusa se ocenijo na podlagi tega; Tekočo snov je treba obravnavati, kot da je oksidant, kadar: Da bi se izognili napačnim pozitivnim rezultatom, je treba po potrebi pri razlagi rezultatov upoštevati tudi rezultate, dobljene pri preskušanju snovi z inertnim materialom.

3.2

(a) ali se mešanica preskušane snovi in celuloze spontano vname in

(b) primerjave povprečnega časa, ki je potreben, da tlak naraste s 690 kPa na 2070 kPa s povprečnim časom za referenčno snov/snovi.

(a) se mešanica 1:1, glede na maso, snovi in celuloze spontano vname, ali

(b) ima mešanica 1:1, glede na maso, snovi in celuloze, manjši ali enak povprečni čas dviga tlaka, kot je povprečni čas dviga tlaka mešanice 1:1, glede na maso, 65 % (m/m) vodne dušikove kisline in celuloze.

4.(1) VIRI Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Opomba: Uporabi se lahko kateri koli od obeh načrtov.

4.(1)

Slika 1 Tlačna posoda

(A) Ohišje tlačne posode (B) Vijak za utrditev okrogle razpočne plošče (C) Sprožilni mehanizem (D) Tesnilo iz mehkega svinca (E) Okrogla razpočna plošča (F) Stranska ročica (G) Glava zračnega ventila (H) Podložka (J) Izolirana elektroda (K) Neizolirana elektroda (L) Izolacija (M) Jekleni stožec (N) Utor za prilagajanje podložke

Slika 2 Podporni podest

Slika 3 Sistem vžiga

(A) Tuljava vžiga (B) Izolacija (C) Elektrodi (D) Sprožilni mehanizem

Dodatek Dodatne tehnične podrobnosti se lahko poiščejo na primer v naslednjih standardih.

1. Kapilarne metode

1.

1.1 Naprave za merjenje tališča s tekočinsko kopeljo ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2 Naprave za merjenje tališča s kovinskim blokom DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point

2. Ogrevalne mizice

2.

2.1 Koflerjeva ogrevalna plošča ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2 Talilni mikroskop DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3 Metoda z meniskusom (poliamidi) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du point de fusion méthode du ménisque

3. Metode za določanje zmrzišča BS 4633 Method for the determination of crystallising point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Termična analiza

4.

4.1 Diferenčna termična analiza ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2 Diferečna dinamična kalorimetrija ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Določanje točke tečenja NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point

Dodatek Dodatne tehnične podrobnosti se lahko poiščejo na primer v naslednjih standardih:

1.1.1 Ebulioskop Naprave za merjenje tališča s tekočinsko kopeljo ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Destilacijski proces (vreliščno območje) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation:determination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Diferenčna termična analiza in diferenčna dinamična kalorimetrija ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

Dodatek Glede dodatnih tehničnih podrobnosti so lahko v pomoč na primer naslednji standardi:

1. Vzgonske metode

1.

1.1 Hidrometer DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2 Hidrostatska tehtnica

1.2 Za trdne snovi

ISO 1183 A metode: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density

Za tekoče snovi

ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3 Metoda s potopljenim telesom DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. Piknometrske metode

2.

2.1 Za tekoče snovi ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 °C DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 . 10-6 m2 s-1 at 15 °C) DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 . 10-6 m2 s-1 at 20 °C, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 °C) DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary – stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

2.2 Za trdne snovi ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method DIN 19683 Determination of the density of soils

3. Piknometer s primerjanjem zraka DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

Dodatek 1 Ocenjevalna metoda

UVOD

Izračunane vrednosti parnega tlaka se lahko uporabijo:

za izbiro primerne preskusne metode,

za pridobitev ocene ali mejne vrednosti v primerih, kadar preskusne metode ni mogoče uporabiti zaradi tehničnih razlogov (in tudi kadar je parni tlak zelo nizek),

v pomoč pri določanju primerov, pri katerih je opustitev merjenja upravičena, ker je verjetno, da je parni tlak pri sobni temperaturi < 10-5 Pa.

OCENJEVALNA METODA

Parni tlak tekočin in trdnih snovi se lahko oceni z uporabo prilagojene Watsonove korelacije (a). Edini potrebni s preskusom pridobljeni podatek je normalno vrelišče. Metoda je uporabna za območje tlaka od 105 Pa do 10 -5 Pa. Podrobne informacije o metodi so navedene v Priročniku metod za ocenjevanje kemijskih lastnosti (b).

RAČUNSKI POSTOPEK

V skladu z (b) se parni tlak izračuna na naslednji način: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb pri čemer je: T = izbrana temperatura Tb = normalno vrelišče Pvp = parni tlak pri temperaturi T ΔHvb = izparilna toplota ΔZb = faktor stisljivosti (ocenjen na 0,97) m = empirični faktor, odvisen od agregatnega stanja pri izbrani temperaturi Nadalje Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb pri čemer je KF empirični faktor, ki upošteva polarnost snovi. V viru (b) so navedeni faktorji KF za več spojin. Precej pogosto so na voljo podatki o vrelišču pri znižanem tlaku. V skladu z (b) se pri takih primerih parni tlak izračuna na naslednji način: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 pri čemer je T1 vrelišče pri znižanem tlaku P1.

POROČILO

Pri uporabi ocenjevalne metode, poročilo vključuje izčrpno dokumentacijo izračuna.

LITERATURA

(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, 398.

(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Dodatek 2

Slika 1 Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po dinamični metodi

1 = Termočlen 2 = Vakuumski pufrski volumen 3 = Merilnik tlaka 4 = Vakuum 5 = Merilna točka 6 = Grelni element, približno 150 W

Slika 2a Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po statični metodi (z uporabo manometra z U-cevko)

1. Preskusna snov 2. Parna faza 3. Visokovakuumski ventil 4. U-cevka (pomožni manometer) 5. Manometer 6. Temperaturna kopel 7. Naprava za merjenje temperature 8. Vod do vakuumske črpalke 9. Zračenje

Slika 2b Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po statični metodi (z uporabo indikatorja tlaka)

1. Preskusna snov 2. Parna faza 3. Visokovakuumski ventil 4. Merilnik tlaka 5. Indikator tlaka 6. Temperaturna kopel 7. Naprava za merjenje temperature

Slika 3 Izoteniskop (glej vir 7)

1. Vod do sistema za kontrolo in merjenje tlaka 2. Cev z zunanjim premerom 8 mm 3. Suhi dušik v tlačnem sistemu 4. Para vzorca 5. Majhna konica 6. Tekoči vzorec

Slika 4 Aparatura za določanje krivulje parnega tlaka po metodi s parnotlačno tehtnico

1. Preskusna snov 2. Parna faza s curkom pare 3. Uparjalna peč z vrtljivim dovodom 3a. Pokrov peči z odprtino 4. Ogrevanje (hlajenje) peči 5. Merjenje temperature vzorca 6. Hladilna posoda 7. Zaslon 8. Hladilna palica za hladilno posodo 9. Skodelica tehtnice 10. Mikrotehtnica 11. Povezava z zapisovalnikom 12. Vod do vakuumske črpalke

Slika 5 Primer aparature za uparjanje pri nizkem tlaku z efuzijsko celico z volumnom 8 cm3

1 Povezava z vakuumom 2 Luknje za platinski uporovni termometer ali sisteme za merjenje in nadzorovanje temperature (2) 3 Pokrov vatuumske posode 4 O-tesnilo 5 Aluminijasta vakuumska posoda 6 Naprava za pritrjevanje in odstranjevanje efuzijskih celic 7 Navojni pokrov 8 Krilne matice (6) 9 Vijaki (6) 10 Efuzijske celice iz nerjavečega jekla 11 Grelni vložki (6)

Slika 6a Primer pretočnega sistema za določanje parnega tlaka z metodo nasičenega plina

oddušnik razdelilnik 1 = Regulator pretoka 2 = Toplotni izmenjevalnik 3 = Igelni ventili 4 = Senzor relativne vlažnosti 5 = Saturacijske kolone 6 = PTFE spojke 7 = Merilnik pretoka 8 = Past (absorbent) 9 = Oljna past 10 = Kalcinirana cevka za ustvarjanje mehurčkov

Slika 6b Primer sistema za določanje parnega tlaka z metodo nasičenega plina, pri katerem je za saturacijsko kolono postavjena kapilara

1. Merilnik toplotnega pretoka 2. Manometer 3. Termostatirana komora 4. Termostatirana tuljava za nosilni plin 5. Termometer (Pt 100) 6. Posoda za nasičenje plina 7. Kapilara 8. Absorpcijske posode 9. Plinomer 10. Ohlajena past

Slika 7 Primer postavitve preskusa za rotorsko metodo

Aparatura za parni tlak A. Vrteči rotorski senzor B. Celica za vzorec C. Termostat D. Vakuumska cev (turbo črpalka) E. Zračni termostat

Slika 8 Primer vrtečega rotorskega merilnika

1. Kroglica 2. Odzračen cevni podaljšek 6 3. Trajni magnet (2) 4. Tuljava (2) za vertikalno stabilizacijo 5. Vzbujevalna tuljava (4) 6. Vezna prirobnica

Dodatek

Slika 1 Metoda z izpiranjem kolone z recirkulacijsko črpalko

Atmosfersko uravnoteženje Merilnik pretoka Mikrokolona Termostatirana cirkulacijska črpalka Recirkulacijska črpalka Dvosmerni ventil za vzorčenje

Slika 2 Značilna mikrokolona

(Vse dimenzije so v milimetrih) (Priključek za spojko iz brušenega stekla) Predkolona Notranjost 5 Zunanjost 19 Čep iz steklene volne Dvosmerni petelinček

Slika 3 Značilna mikrokolona

(Vse dimenzije so v milimetrih) Priključek za spojko iz brušenega stekla Predkolona Notranjost 5 Zunanjost 19 Petelinček

Slika 4 Metoda z izpiranjem kolone z nivojsko posodo

1 = Nivojska posoda (npr. 2,5 litrska steklenica) 2 = Kolona (glej sliko 3) 3 = Zbiralnik frakcij 4 = Termostat 5 = Teflonska cev 6 = Spojka iz brušenega stekla 7 = Dovod vode (med termostatom in kolono, notranji premer: približno 8 mm)

Dodatek 1 Računske/ocenjevalne metode

UVOD

Splošni uvod v računske metode, podatki in primeri so na voljo v Priročniku metod za ocenjevanje kemijskih lastnosti (a). Izračunane vrednosti Pow se lahko uporabijo:

za izbiro primerne preskusne metode (območje metode stresanja bučke: log Pow : –2 do 4, območje HPLC: log Pow: 0 do 6),

za izbiro ustreznih pogojev preskusa (npr. referenčne snovi za postopke HPLC, volumsko razmerje n-oktanol/voda za metodo stresanja bučke),

kot notranje laboratorijsko preverjanje za odkrivanje možnih napak preskusa,

za določitev ocene vrednosti Pow, kadar preskusnih metod ni mogoče uporabiti zaradi tehničnih razlogov.

OCENJEVALNA METODA Predhodna ocena porazdelitvenega koeficienta

Vrednost porazdelitvenega koeficienta se lahko oceni na podlagi topnosti preskusne snovi v čistih topilih:Za to: Pocena = nasičenje cn-oktanolnasičenje cvoda

RAČUNSKE METODE Princip računskih metod

Vse računske metode temeljijo na formalni fragmentaciji molekule na ustrezne podstrukture, za katere so znane zanesljive vrednosti povečanja log Pow. Vrednost log Pow cele molekule se nato izračuna kot vsota ustreznih vrednosti za njene fragmente, kateri se prišteje vsota členov korekcije za intramolekularne interakcije. Na voljo so seznami konstant fragmentov in členov korekcije (b)(c)(d)(e). Nekateri se redno dopolnjujejo (b).

Merila kakovosti

Na splošno se zanesljivost računske metode manjša z večjo kompleksnostjo preučevane snovi. Pri enostavnih molekulah z majhno molsko maso in eno ali dvema funkcionalnima skupinama se lahko pričakuje odstopanje za 0,1 do 0,3 enote log Pow med rezultati različnih metod fragmentacije in izmerjeno vrednostjo. Pri bolj kompleksnih molekulah je območje napake lahko večje. To je odvisno od zanesljivosti in razpoložljivosti konstant fragmentov ter od zmožnosti prepoznavanja intramolekularnih interakcij (npr. vodikove vezi) in pravilne uporabe členov korekcije (manj težavno z računalniško programsko opremo CLOGP-3) (b). Pri snoveh, ki se lahko ionizirajo, je pomembno, da se pravilno upošteva naboj ali stopnja ionizacije.

Računski postopki

Hanschova p-metoda

Izvirna konstanta hidrofobnih substituentov, π, ki jo je vpeljal Fujira et al. (f), je opredeljena z: πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) pri čemer je Pow (PhX) porazdelitveni koeficient aromatskega derivata in Pow (PhH) porazdelitveni koeficient izhodne spojine (npr. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Glede na svojo opredelitev je π-metoda uporabna predvsem za aromatsko substitucijo. Pripravljene so bile tabele π-vrednosti za veliko število substituentov (b)(c)(d). Uporabljajo se za izračunavanje log Pow za aromatske molekule ali podstrukture.

Rekkerjeva metoda

Po Rekkerju (g) se vrednost log Pow izračuna na naslednji način: log Pow=Σi ai fi+Σj (členi interakcije) kjer fi predstavlja konstante za različne fragmente molekule in ai pogostnost njihovega pojavljanja v preiskovani molekuli. Členi korekcije se lahko izrazijo kot skupni zmnožek ene same konstante Cm (tako imenovane magične konstante). Konstante fragmentov fi in Cm so bile določene na podlagi seznama 1054 vrednosti Pow, dobljenih s poskusi (825 spojin), z uporabo multiple regresijske analize (c)(h). Členi interakcije se določijo v skladu z določenimi pravili, opisanimi v literaturi (e)(h)(i).

Hansch-Leova metoda

Po Hanschu in Leu (c) se vrednost log Pow izračuna po enačbi: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj kjer fi predstavlja konstante različnih fragmentov molekule, Fj člene korekcije ter ai in bj ustrezne pogostnosti pojavljanja. Z metodo poskusa in napake ter z izpeljavo iz vrednosti Pow, dobljenih s poskusi, sta bila sestavljena seznam vrednosti za atome in skupine ter seznam členov korekcije Fj (tako imenovanih faktorjev). Členi korekcije so bili razvrščeni v več različnih razredov (a)(c). Upoštevanje vseh pravil in členov korekcije je sorazmerno zapleteno in dolgotrajno. Razviti so bili programski paketi (b).

Kombinirana metoda

Izračunavanje log Pow kompleksnih molekul se lahko znatno izboljša, če se molekula razdeli na večje podstrukture, za katere so na voljo zanesljive vrednosti log Pow, bodisi iz tabel (b)(c) bodisi iz lastnih meritev. Taki fragmenti (npr. heterocikli, antrakinon, azobenzen) se nato lahko kombinirajo s Hanschovimi p-vrednostmi ali Rekkerjevimi ali Leovimi konstantami fragmentov.

Opombe

(i) Računske metode se lahko za delno ali popolnoma ionizirane snovi uporabijo le, kadar je mogoče upoštevati potrebne korekcijske faktorje;

(ii) če se lahko predpostavlja, da so intramolekularne vodikove vezi, je treba prišteti ustrezne člene korekcije (pribl. +0,6 do +1,0 enot log Pow) (a). Znaki prisotnosti takih vezi se lahko pridobijo iz stereo modelov ali spektroskopskih podatkov o molekuli;

(iii) če je možnih več tavtomernih oblik, mora izračun temeljiti na najbolj verjetni obliki;

(iv) pozorno je treba spremljati spremembe seznamov konstant fragmentov.

Poročilo

Kadar se uporabijo računske/ocenjevalne metode, se v poročilo o preskusu, če je možno, vključijo naslednje informacije:

opis snovi (zmes, nečistote itd.),

znaki kakršne koli možne intramolekularne vodikove vezi, disociacije, naboja in vseh drugih neobičajnih učinkov (npr. tavtomerija),

opis računske metode,

identifikacija podatkovne baze ali vir,

posebnosti izbire fragmentov,

izčrpno dokumentacijo izračuna.

LITERATURA

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. – Chill. Ther. 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Dodatek 2 Priporočene referenčne snovi za metodo HPLC

Št. Referenčna snov log Pow PKa 1 2-Butanon 0,3 2 4-Acetilpiridin 0,5 3 Anilin 0,9 4 Acetanilid 1,0 5 Benzilakohol 1,1 6 p-Metoksifenol 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoksiocetna kislina 1,4 pKa = 3,12 8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-Dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 Benzonitril 1,6 11 Fenilacetonitril 1,6 12 4-Metílbenzil alkohol 1,6 13 Acetofenon 1,7 14 2-Nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 3-Nitrobenzojska kislina 1,8 pKa = 3,47 16 4-Kloroanilin 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenzen 1,9 18 Cimetov alkohol 1,9 19 Benzojska kislina 1,9 pKa = 4,19 20 p-Krezol 1,9 pKa = 10,17 21 Cinamska kislina 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anizol 2,1 23 Metilbenzoat 2,1 24 Benzen 2,1 25 3-Metílbenzojska kislina 2,4 pKa = 4,27 26 4-Klorofenol 2,4 pKa = 9,1 27 Trikloroetilen 2,4 28 Atrazin 2,6 29 Etillbenzoat 2,6 30 2,6-Diklorobenzonitril 2,6 31 3-Klombenzojska kislina 2,7 pKa = 3,82 32 Toluen 2,7 33 1 -Naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-Dichloroaniline 2,8 35 Chlorobenzene 2,8 36 Allyl-phenylether 2,9 37 Bromobenzen 3,0 38 Etílbenzen 3,2 39 Benzofenon 3,2 40 4-Fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 41 Timol 3,3 42 1,4-Diklorobenzen 3,4 43 Difenilamin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftalen 3,6 45 Fenilbenzoat 3,6 46 Izopropilbenzen 3,7 47 2,4.6-Triklorofenol 3,7 pKa = 6 48 Bifenil 4,0 49 Benzilbenzoat 4,0 50 2,4-Dinitro-6-.sek-butilfenol 4,1 51 1,2,4-Triklorobenzen 4,2 52 Dodekanojska kislina 4,2 53 Difenileter 4,2 54 n-Butylbenzene 4,5 55 Fenantren 4,5 56 Fluoroanten 4,7 57 Dibenzil 4,8 58 2,6-Difenilpiridin 4,9 59 Trifenilamin 5,7 60 DDT 6,2 Druge referenčne snoví za majhne vrednosti log Pow 1 Nikotinska kislina -0,07

Dodatek

Slika Kalup in pripomočki za pripravo kupčka

(Vse dimenzije so v milimetrih} Dolžina kalupa: 250 mm Material: aluminij

Dodatek

Slika Aparatura

Dodatek

Primer specifikacije materiala za preskus toplotne občutljivosti (glej DIN 1623) (1)(2)(3)

Cev: Specifikacija materiala št. 1.0336.505 g Šobna plošča: Specifikacija materiala št. 1.4873 Navojni obroč in matica: Specifikacija materiala št. 1.3817

Slika 1 Aparatura za toplotno občutljivost

(vse dimenzije so v milimetrih) Sl. 1a Jeklena cev in dodatki (1) cev (1a) zunanja prirobnica (2) navojni obroč; navoj z majhnim trenjem (3) šobna plošča, a = 2,0 ali 6,0 mm (4) matica, b = 10 mm (5) prirobljena površina (6) 2 površini za ključ št. 41 Sl. 1b Grelna in zaščitna naprava (7) 2 površini za ključ št. 36 (8) škatla, odporna proti drobcem (9) 2 podporni palici za cev (10) sestavljena cev (11) položaj zadnjega gorilnika; drugi gorilniki so vidni (12) šoba za vžigalni plamen

Slika 2 Preskus toplotne občutljivosti

(primeri fragmentacije) Ni eksplozije Ni eksplozije Eksplozija Eksplozija Eksplozija Eksplozija

Slika 3 Umeritev hitrosti segrevanja pri preskusu toplotne občutljivosti

Temperatura (°C) Čas (s) Krivulja temperatura/čas, dobljena s segrevanjem dibutilftalata (27 cm5) v zaprti (šobna plošča 1,5 mm) cevi ob pretoku propana 3,2 litra/minuto. Temperatura se meri s termočlenom nikelj-krom s premerom 1 mm v ovoju iz nerjavečega jekla, nameščenim centralno, 43 mm pod robom cevi. V območju med 135 in 285 °C mora biti hitrost segrevanja med 185 in 215 K/minuto.

Slika 4 Aparatura za udarni preskus

(vse dimenzije so v milimetrih) (1) osnovna plošča, 450 × 450 × 60 (2) jeklen blok, 230 × 250 × 200 (3) nakovalo, 100 (premer) × 70 (4) stebriček (5) osrednji prečni nosilec (6) 2 vodili (7) nazobčana tračnica (8) graduirana lestvica (9) udarno kladivo (udarna utež) (10) naprava za pritrjevanje in sproščanje (11) centrirna plošča (12) vmesno nakovalo (zamenljivo). 26 (premer) × 26 (13) centrirni obroč z odprtinicami (14) udarna priprava Sl. 4a Udarno kladivo, od spredaj in od strani, splošna skica Sl. 4b Udarno kladivo, spodnji del

Nadaljevanje

Sl. 4d Udarna priprava za tekoče snovi Sl. 4c Udarna priprava za prašnate in pastozne snovi (1) jeklena valja (2) vodilni obroč za jeklena valja (3) centrirni obroč z odprtinicami (a) vzdolžni prerez (b) prečni prerez (4) gumijast obroč (5) tekoča snov (40 mm3) (6) prostor brez tekočine Sl. 4e Kladivo (udarna utež 5 kg) (1) zatič za obešanje (2) kazalec višine (3) vodilni žleb (4) valjasta udarna glava (5) priprava za zaustavitev odboja

Slika 5 Aparatura za občutljivost za trenje

Sl. 5a Torna aparatura; naris in tloris (1) jeklena osnovna plošča (2) premični drsnik (3) porcelanasta ploščica 25 × 25 × 5 mm, pritrjena na drsnik (4) nepremični porcelanast valjček, 10 (premer) × 15 mm (5) vzorec, približno 10 mm3 (6) držalo za valjček (7) obremenitvena ročica (8) protiutež (9) stikalo (10) kolesce za nastavitev drsnika na začetni položaj (11) smer elektromotorja S1.5b Začetni položaj valjčka na vzorcu

Dodatek

Slika Kalup in pripomočki za pripravo kupčka

(Vse dimenzije so v milimetrih)

Priloga Primeri drugih metod za določanje povprečnega števila molekulske mase (Mn) za polimere

Gelska permeacijska kromatografija (GPC) je priljubljena metoda za določanje Mn, zlasti kadar je na razpolago niz standardov, katerih struktura je primerljiva s strukturo polimera. Vendar pa v primeru, kadar naletimo pri uporabi metode GPC na izvedbene težave ali kadar lahko pričakujemo, da snov ne bo izpolnila regularnega Mn kriterija (in ki ga je potrebno potrditi), so na razpolago druge metode, kot so:

1.1.11.21.31.4

Uporaba koligativnih lastnosti Ebulioskopija/krioskopija vključuje meritev zvišanja vrelišča (ebulioskopija) ali znižanja strdišča (krioskopija) topila ob dodajanju polimera. Metoda se zanaša na dejstvo, da je učinek raztopljenega polimera na točki vrelišča/strdišča tekočine odvisen od molekulske mase polimera (1) (2). Nanos: Mn < 20000. Nižanje pritiska hlapov vključuje meritev pritiska hlapov izbrane referenčne tekočine pred in po dodajanju znanih količin polimera (1) (2). Nanos: Mn < 20000 (teoretično; v praksi gre za mejno vrednost). Membranska osmometrija se zanaša na osmozo, t.j. naravno nagnjenost raztapljajočih se molekul, da predrejo skozi polprepustno membrano iz razredčila v koncentrirano raztopino, da bi se doseglo ravnovesje. V preskusu je razredčena raztopina na nični koncentraciji, medtem ko koncentrirana raztopina vsebuje polimer. Učinek prehajanja topila skozi membrano povzroča diferencial pritiska, ki je odvisen od koncentracije in molekulske mase polimera (1) (3) (4). Nanos: Mn med 20000–200000. Osmometrija v hlapni fazi vključuje primerjavo stopnje hlapenja čistega raztopljenega aerosola na najmanj tri aerosole, ki vsebujejo polimer na različnih koncentracijah (1) (5) (6). Nanos: Mn < 20000.

2. Analiza končnih skupin Da bi uporabili to metodo, sta potrebna tako celotna struktura polimera in narava verige, ki zaključuje končne skupine (ta se mora razlikovati od glavnega ogrodja po, na primer, NMR ali titriranju/derivatizaciji). Z določitvijo molekulske koncentracije končnih skupin, prisotnih na polimeru, lahko pridemo do vrednosti molekulske mase (7) (8) (9). Nanos: Mn do 50000 (z naraščajočo zanesljivostjo).

3.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)

Literatura Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25–52. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139–2146.

Priloga Smernice za korekcijo vsebnosti nizke molekulske mase pri prisotnosti netopnega polimera

Kadar je v vzorcu prisoten netopen polimer, lahko to povzroči izgubo mase v teku GPC analize. Netopen polimer se lahko nepovratno ohrani na koloni ali filtru vzorca, medtem ko raztopni delež vzorca predre skozi kolono. V primeru, kadar je mogoče porast refrakcijskega indeksa (dn/dc) polimera oceniti ali izmeriti, lahko ocenimo maso vzorca, izgubljeno na koloni. V tem primeru, lahko opravimo korekcijo z uporabo zunanjega kalibriranja s standardnimi materiali znane koncentracije in dn/dc, da bi kalibrirali odziv refraktometra. V naslednjem primeru je uporabljen standard poli(metil metakrilat) (pMMA). Pri zunanjem kalibriranju za analizo akrilnih polimerov, z GPC analiziramo pMMA standard znane koncentracije v tetrahidrofuranu, dobljene podatke pa uporabimo, da poiščemo konstanto na refraktometru, v skladu z enačbo: K = R/(C × V × dn/dc) kjer je K konstanta refraktometra (v mikrovoltsekundah/ml), R odziv pMMA standarda (v mikrovoltsekundah), C koncentracija pMMA standarda (v mg/ml), V injekcijski volumen (v ml) in dn/dc porast refrakcijskega indeksa za pMMA v tetrahidrofuranu (v ml/mg) Naslednji podatki so značilni za pMMA standard: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg Dobljeno K vrednost 3,05 × 1011 nato uporabimo za izračun odziva teoretičnega detektorja, če je 100 % vbrizganega polimera eluirano skozi detektor.

DEL B METODE ZA DOLOČANJE TOKSIČNOSTI IN DRUGIH UČINKOV NA ZDRAVJE

SPLOŠNI UVOD A.

OPREDELITEV PRESKUSNE SNOVI Pred začetkom katere koli študije toksičnosti je treba poznati sestavo preskusne snovi, vključno z glavnimi nečistotami in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi, ki vključujejo tudi stabilnost. Fizikalno-kemijske lastnosti preskusne snovi zagotavljajo pomembne informacije za izbiro načina vnosa, načrtovanje posamezne študije ter za rokovanje in skladiščenje preskusne snovi. Pred začetkom študije je treba razviti analitično metodo za kvalitativno in kvantitativno določitev preskusne snovi (vključno z glavnimi nečistotami, kjer je mogoče) v sredstvu za odmerjanje in biološkem materialu. Poročilo o preskusu naj vključuje vse informacije v zvezi z identifikacijo, fizikalno-kemijskimi lastnostmi, čistostjo in obnašanjem preskusne snovi.

VARSTVO ŽIVALI Pri preskušanju toksičnosti sta bistvenega pomena izvajanje stroge kontrole nad okoljskimi razmerami in uporaba primernih tehnik za varstvo živali.

(i) Nastanitveni pogoji Okoljske razmere v preskuševalnih živalskih prostorih ali ogradah morajo biti primerne za preskusno vrsto. Za podgane, miši in morske prašičke so primerne razmere sobna temperatura 22 oC ± 3 oC z relativno vlažnostjo od 30 % do 70 %; za kunce naj bi bila temperatura 20 ± 3 oC z relativno vlažnostjo od 30 do 70 %. Nekatere preskusne tehnike so še posebno občutljive za temperaturne učinke in v takih primerih so podrobnosti o ustreznih razmerah vključene v opis preskusne metode. Pri vseh raziskavah toksičnih učinkov je treba temperaturo in vlažnost spremljati, zabeležiti in vključiti v končno poročilo o študiji. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Podrobnosti o vzorcu osvetlitve je treba zabeležiti in vključiti v končno poročilo o študiji. Razen, če metoda določa drugače, se lahko živali nastanijo v kletke posamično ali v majhnih skupinah istega spola; pri skupinski nastanitvi je v kletki lahko največ pet živali. Pomembno je, da je v poročilih o poskusih na živalih navedena vrsta uporabljene nastanitve v kletkah in število nastanjenih živali v vsaki kletki med izpostavljenostjo kemikaliji in tudi v vsakem poznejšem obdobju opazovanja.

(ii) Prehranjevalni pogoji Hrana naj izpolnjuje vse prehranjevalne zahteve preskusne živalske vrste. Če se preskusne snovi dajejo živalim z njihovo hrano, lahko interakcija med snovjo in sestavino hrane zmanjša hranilno vrednost. Možnost take reakcije je treba upoštevati pri razlagi rezultatov preskusa. Konvencionalna laboratorijska hrana se lahko uporablja z neomejenimi količinami pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne snovi, če se ta snov daje s hrano. Kontaminanti v hrani, ki lahko vplivajo na toksičnost, ne smejo biti v koncentracijah, ki lahko povzročijo motnje.

ALTERNATIVNO PRESKUŠANJE Evropska unija je zavezana k spodbujanju razvoja in preverjanja alternativnih tehnik, ki lahko zagotavljajo enako raven informacij kot trenutni živalski preskusi, vendar uporabljajo manjše število živali, povzročajo manj trpljenja ali se povsem izognejo uporabi živali. Ko bodo takšne metode na razpolago, se bodo morale upoštevati, kjer je mogoče, za opredelitev nevarnosti ter posledično razvrstitev in označitev glede na njihovo dejansko nevarnost.

OCENJEVANJE IN INTERPRETACIJA Ker je treba pri ocenjevanju in interpretaciji preskusov upoštevati omejitve, znotraj katerih se lahko rezultati živalskih študij in študij in vitro neposredno ekstrapolirajo na človeka, se lahko dokazi o škodljivih učinkih za človeka, če so na razpolago, uporabijo za potrditev rezultatov preskusa.

SKLICEVANJE NA LITERATURO Večina teh metod je bila razvita v okviru programa OECD – smernice za preskušanje in jih je treba izvajati v skladu z načeli dobre laboratorijske prakse, da bi bilo kar najbolje zagotovljeno medsebojno priznavanje podatkov. Dodatne informacije se lahko najdejo v napotilih, navedenih v smernicah za preskušanje OECD, in drugi ustrezni literaturi.

B.1 bis. AKUTNA ORALNA TOKSIČNOST – POSTOPEK S TOČNO DOLOČENIM ODMERKOM

B.1 bis.

1. METODA Ta preskusna metoda ustreza OECD TV 420 (2001)

1.

1.1 UVOD Tradicionalne metode za ocenjevanje akutne toksičnosti upoštevajo pogin živali kot končno točko. Leta 1984 je Britansko društvo za toksikologijo predlagalo nov pristop k preskušanju akutne toksičnosti na podlagi dajanja serije točno določenih odmerkov (1). Ta pristop se je izognil uporabi pogina živali kot končne točke in se namesto tega oprl na opazovanje jasnih znakov toksičnosti na eni seriji velikosti točno določenih odmerkov. Po študijah v Združenem kraljestvu (2) in mednarodnih (3) validacijskih študijah in vivo se je sprejel postopek kot metoda za preskušanje v letu 1992. Kasneje so se statistične lastnosti Postopka s točnim odmerkom ovrednotile z uporabo matematičnih modelov v seriji študij (4)(5)(6). Tako študije in vivo kot študije na modelih so pokazale, da je postopek ponovljiv, da se zanj uporablja manj živali in da povzroča manj trpljenja kakor tradicionalne metode, ter da je z njim mogoče razvrstiti snovi na podoben način kot z drugimi metodami preskušanja akutne toksičnosti. Navodila za izbiro najustreznejše metode preskušanja za dani namen se lahko poiščejo v Dokumentu s smernicami in navodili za preskušanje akutne oralne toksičnosti (7). Ta dokument z navodili vsebuje tudi dodatne informacije o izvajanju in razlagi metode preskušanja B.1 bis. Princip metode je, da se v glavni študiji uporabljajo le zmerno toksični odmerki in se je treba izogibati dajanju odmerkov, za katere se pričakuje, da so smrtni. Prav tako se ne sme dajati odmerkov, za katere je znano, da povzročajo vidno bolečino in trpljenje živali zaradi jedkega ali močno dražečega delovanja. Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo ali kažejo znake hudega in dolgotrajnega trpljenja, se usmrtijo na human način in se upoštevajo pri razlagi rezultatov preskusa na enak način kot živali, ki so poginile med preskusom. Kriterije za sprejem odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, ter napotke za prepoznavanje napovedljive ali neizbežne smrti obravnava poseben Dokument s smernicami (8). Z metodo pridobimo informacije o nevarnih lastnostih in nam omogoča uvrstitev in razvrstitev snovi v skladu z Globalno usklajenim sistemom (GHS) za razvrščanje kemikalij, ki povzročajo akutno toksičnost (9). Laboratorij za preskušanje mora upoštevati vse razpoložljive informacije o preskusni snovi pred opravljanjem študije. Takšne informacije bodo vključevale vrsto in kemijsko sestavo snovi; njene fizikalno-kemijske lastnosti; rezultate katerih koli drugih preskusov toksičnosti na snovi, in vitro ali in vivo; toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh ter pričakovano uporabo/uporabe snovi. Te informacije so potrebne, da vsem, ki jih to zadeva, zagotovijo, da je preskus pomemben za zaščito zdravja ljudi in da bo v pomoč pri izbiri ustreznega začetnega odmerka.

1.2 DEFINICIJE Akutna oralna toksičnost: nanaša se na tiste škodljive učinke, ki sledijo dajanju enega odmerka snovi ali dajanju več odmerkov v 24 urah. Kasnejša smrt: pomeni, da žival ne pogine ali da ne kaže znakov, da bo poginila, v 48 urah, vendar pogine kasneje med 14-dnevnim obdobjem opazovanja. Odmerek: je količina dane preskusne snovi. Odmerek je izražen kot masa preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (npr. mg/kg). Očitna toksičnost: je splošen izraz, ki opisuje jasne znake toksičnosti po dajanju preskusne snovi (glej (3) na primer), takšne, da se pojavijo pri naslednjem najvišjem točno določenem odmerku hude bolečine in trajne znake hude stiske, stanje umiranja (kriteriji so navedeni v Dokumentu s smernicami za humane končne točke (8)), ali pa, če je mogoče pričakovati smrtnost pri večini živali. GHS: Globalno usklajeni sistem razvrščanja kemijskih snovi in mešanic. Skupna aktivnost OECD (zdravje ljudi in okolje), Odbora ZN strokovnjakov za prevoz nevarnega blaga (fizikalno-kemijske lastnosti) in ILO (poročanje o nevarnih snovem) in koordinirana med organizacijami s Programom za pravilno ravnanje s kemikalijami (IOMC). Neizbežna smrt: ko se pričakuje umirajoče stanje ali smrt pred naslednjim planiranim časom opazovanja. Značilni znaki tega stanja pri glodalcih lahko vključujejo krče, bočni položaj, poležavanje in tremor. (Glej Dokument s smernicami z navodili za humane končne točke (8) za podrobne podatke). LD50(srednji smrtni odmerek): je statistično ugotovljen enkraten odmerek snovi, za katerega se lahko pričakuje, da bo povzročil smrt pri 50 odstotkih živali, kadar se jim da po oralni poti. Vrednost LD50 se izrazi z maso preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (mg/kg). Mejni odmerek: nanaša se na odmerek na zgornji omejitvi preskušanja (2000 ali 5000 mg/kg). Umirajoče stanje: stanje umiranja ali nezmožnosti preživeti, kljub tretiranju. (Glej Dokument s smernicami humane končne točke (8) za več podrobnih podatkov). Pričakovana smrt: prisotnost kliničnih znakov, ki kažejo na smrt ob znanem času v prihodnosti pred načrtovanim zaključkom eksperimenta, na primer: živali niso sposobne doseči vode ali hrane. (Glej Dokument s smernicami z navodili za humane končne točke (8) za več podrobnih podatkov).

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Skupini živali istega spola se dajejo odmerki postopoma, z uporabo točno določenih odmerkov 5, 50, 300 in 2000 mg/kg (izjemoma se lahko uporabi dodaten točno določen odmerek 5000 mg/kg, glej oddelek 1.6.2). Začetna velikost odmerka se izbere na podlagi opazovalne študije kot odmerek, pri katerem se pričakuje, da se bodo pokazali nekateri znaki toksičnosti, ne da bi povzročil resne toksične posledice ali smrtnost. Klinični znaki in stanja, povezana z bolečino, trpljenjem in neizbežno smrtjo, so natančno napisana v posebnem OECD Dokument s smernicami (8). Nadaljnje skupine živali lahko dobivajo višje ali nižje točno določene odmerke, odvisno od prisotnosti ali odsotnosti znakov toksičnosti ali smrtnosti. Ta postopek se nadaljuje, dokler se ne ugotovi odmerka, ki povzroči očitno toksičnost ali več kot eno smrt, ali takrat, ko pri najvišjem odmerku ni videti nobenih učinkov, ali kadar nastopijo smrti pri najnižjem odmerku.

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Izbira živalskih vrst Najbolj cenjena vrsta glodalca je podgana, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodalcev. Običajno se uporabljajo samice (7). To je zato, ker v literaturi poročila o običajnih LD50 preskusih kažejo, da je v občutljivosti med spoloma le malo razlik, vendar so v tistih primerih, kjer se razlike opažajo, samice na splošno neznatno bolj občutljive (10). Če pa iz poznavanja toksikoloških in toksikokinetičnih lastnosti strukturno sorodnih kemikalij izhaja, da je verjetno, da so samci bolj občutljivi, je treba uporabiti ta spol. Kadar se preskus opravlja na samcih, je treba imeti za to ustrezno obrazložitev. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Samice morajo biti nuliparne in ne smejo biti breje. Živali morajo biti na začetku odmerjanja stare od 8 do 12 tednov, njihova teža pa se mora gibati v intervalu ± 20 % povprečne teže katerih koli živali, ki so predhodno prejemale odmerek.

1.4.2 Pogoji bivanja in hranjenja Temperatura eksperimentalnega prostora za živali mora znašati 22 oC (± 3 oC). Čeprav mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev mora biti umetna, v zaporedju 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporabijo običajne predpisane laboratorijske vrste hranjenja z neomejeno količino pitne vode. Živali se lahko razporedijo v kletke po skupinah glede na odmerek, vendar število živali v vsaki kletki ne sme vplivati na neovirano opazovanje vsake živali.

1.4.3 Priprava živali Živali se izberejo naključno, označijo se zato, da je možna individualna identifikacija in se zaprejo v kletke najmanj 5 dni pred začetkom odmerjanja, da se lahko prilagodijo laboratorijskim razmeram.

1.4.4 Priprava odmerkov Na splošno je treba preskusne snovi dajati v konstantnem volumnu v območju odmerkov, ki jih je treba preskusiti s spreminjanjem koncentracije odmerjenega pripravka. Kadar je treba preskusiti tekoč končni produkt ali mešanico, pa je uporaba nerazredčene preskusne snovi, npr. pri konstantni koncentraciji, morda ustreznejša za naknadno oceno tveganja navedene snovi, in jo nekateri regulatorni organi zahtevajo. Maksimalni volumen odmerka se v nobenem primeru ne sme preseči. Maksimalni volumen tekočine, ki se jo lahko da naenkrat, je odvisen od velikosti preskusne živali. Pri glodalcih volumen običajno ne bi smel presegati 1 ml/100 g telesne teže, pri vodnih raztopinah pa se lahko upošteva 2 ml/100 g telesne teže. Glede na formulacijo pripravka za odmerjanje je priporočena, kadar koli je to mogoče, uporaba vodne raztopine/suspenzije/emulzije v olju (npr. v koruznem olju), sledi, po preferenčnem vrstnem redu, raztopina/suspenzija/emulzija v olju (npr. koruznem olju) in nato po možnosti raztopina v drugih nosilcih. Za nosilce, ki niso voda, je treba poznati toksikološke lastnosti nosilca. Odmerke je treba pripraviti tik pred dajanjem, razen kadar je znana stabilnost pripravka za obdobje, v katerem bo uporabljen, in je znano, da je sprejemljiva.

1.5 POSTOPEK

1.5

1.5.1 Dajanje odmerkov Preskusna snov se daje v enem odmerku z gavažo z uporabo želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. V neobičajnih razmerah, ko enkraten odmerek ni mogoč, lahko odmerek dajemo v manjših frakcijah v obdobju, ki ne presega 24 ur. Živali se morajo pred odmerjanjem postiti (npr. podgani je treba odtegniti hrano čez noč, vode pa ne; miš ne sme dobiti hrane 3 do 4 ure prej, vodo pa lahko). Po obdobju postenja je treba živali stehtati in jim dati preskusno snov. Po dajanju preskusne snovi se lahko odtegne hrana podganam za nadaljnje 3–4 ure ali mišim za 1–2 uri. Kadar se odmerek daje v frakcijah ves čas, je možno, da bo potrebno oskrbovati živali s hrano in vodo, odvisno od trajanja časovnega obdobja.

1.5.2 Opazovalna študija Namen opazovalne študije je omogočanje izbire ustreznega začetnega odmerka za glavno študijo. Preskusna snov se daje posameznim živalim v zaporedju v skladu s tabelo poteka v Dodatku 1. Opazovalna študija se zaključi, ko se lahko sprejme odločitev o začetnem odmerku za glavno študijo (ali, če se opazi smrt pri najnižjem, točno določenem odmerku). Začetni odmerek za opazovalno študijo se izbere izmed velikosti točno določenega odmerka 5, 50, 300 in 2000 mg/kg kot odmerek, za katerega se pričakuje, da bo povzročil očitno toksičnost na podlagi, kadar je to mogoče, dokazov iz podatkov in vivo in in vitro za isto kemikalijo in za strukturno sorodne kemikalije. Če takšnih informacij ni, bo začetni odmerek 300 mg/kg. Med odmerjanjem za vsako žival bo dovoljeno obdobje najmanj 24 ur. Vse živali je treba opazovati najmanj 14 dni. Izjemoma in le tedaj, kadar je to upravičeno zaradi posebnih regulatornih potreb, se lahko upošteva dodatna večja velikost točno določenega odmerka 5000 mg/kg (glej Dodatek 3). Zaradi skrbi za zaščito živali je preskušanje živali v območjih kategorije GHS 5 (2000-5000 mg/kg) nezaželeno in ga je treba upoštevati le, kadar obstaja velika verjetnost, da imajo rezultati takšnega preskušanja neposreden pomen za zaščito zdravja ljudi ali živali ali za okolje. Kadar žival, preskušana v opazovalni študiji z najnižjo velikostjo točno določenega odmerka (5 mg/kg) pogine, je običajen postopek tak, da se študija zaključi in snov razvrsti v kategorijo GHS 1 (kot je prikazano v Dodatku 1). Če pa je potrebna nadaljnja potrditev razvrščanja, se lahko izvede neobvezen nadomestni postopek na naslednji način. Drugi živali se odmeri 5 mg/kg. Če druga žival pogine, se bo kategorija GHS 1 potrdila in študija se bo nemudoma zaključila. Če druga žival preživi, se bo dajal odmerek 5 mg/kg največ trem dodatnim živalim. Ker bo nevarnost smrtnosti velika, je treba tem živalim dajati odmerek na zaporeden način, da se zaščiti zdravje živali. Časovni interval med odmerjanjem vsaki živali bi moral biti dovolj dolg, da se ugotovi verjetnost, da bo predhodna žival preživela. Če se zgodi druga smrt, se bo zaporedje odmerjanja nemudoma končalo in odmerjanja za nadaljnje živali ne bo. Zaradi druge smrti (ne glede na število živali, preskušanih v času zaključka) se uvrsti v izid A (2 smrti ali več), upošteva se pravilo o razvrstitvi iz Dodatka 2 za 5 mg/kg točno določenega odmerka (kategorija 1, če sta smrti 2 ali če jih je več, ali kategorija 2, če je več kot 1 smrt). Dodatek 4 poleg tega daje napotke o razvrstitvi v sistem EU, dokler se ne začne izvajati novi GHS sistem.

1.5.3 Glavna študija

1.5.3

1.5.3.1 Število živali in velikosti odmerkov Ukrepe, ki jih je treba izvesti po preskušanju z začetno velikostjo odmerka, prikazujejo tabele poteka v Dodatku 2. Potreben bo eden od treh ukrepov; ustavitev preskušanja in uvrstitev v ustrezen razred razvrstitve nevarnih snovi, preskus z večjim točno določenim odmerkom ali preskus z manjšim točno določenim odmerkom. Za zaščito živali pa se velikost odmerka, ki je povzročil smrt v opazovalni študiji, ne bo ponovila v glavni študiji (glej Dodatek 2). Izkušnje kažejo, da je najverjetnejši izid z začetno velikostjo odmerka tak, da se snov lahko razvrsti in nadaljnje preskušanje ne bo potrebno. Običajno se uporabi skupina petih živali istega spola za vsako preiskovano velikost odmerka. Med petimi živalmi je ena iz opazovalne študije, ki prejema odmerke izbrane velikosti skupaj s štirimi dodatnimi živalmi (razen, kar ni običajno, če velikost odmerka, uporabljenega v glavni študiji, ni bila vključena v opazovalni študiji). Časovni interval med odmerjanjem vsake velikosti je točno opredeljen z nastopom, trajanjem in resnostjo toksičnih znakov. Tretiranje živali z naslednjim odmerkom je treba prestaviti na kasneje, dokler ni gotovo, da so živali, ki so predhodno dobile odmerek, preživele. Priporočeno je po potrebi obdobje 3 do 4 dni med odmerjanjem vsake velikosti odmerka za upoštevanje opazovanja zapoznele toksičnosti. Časovni interval se lahko ustrezno prilagodi, npr. v primeru brezuspešnega odziva. Kadar se upošteva zgornji točno določeni odmerek 5000 mg/kg, je treba izpeljati postopek, opisan v Dodatku 3 (glej tudi oddelek 1.6.2).

1.5.3.2 Mejni preskus Mejni preskus se uporablja predvsem v primerih, kadar ima izvajalec preskusa informacije, ki kažejo, da bo preskusni material verjetno netoksičen oziroma bo njegova toksičnost le nad regulatornimi mejnimi odmerki. Informacije o toksičnosti preskusnega materiala se lahko pridobi na podlagi znanja o podobnih preskusnih spojinah ali podobnih preskusnih mešanicah ali produktih, ob upoštevanju vrste in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko pomembne. V tistih primerih, kjer je le malo ali nič informacij o njegovi toksičnosti, ali kadar se pričakuje, da bo preskusni material toksičen, je treba opraviti glavni preskus. Uporaba običajnega postopka, začetni odmerek opazovalne študije 2000 mg/kg (ali izjemoma 5000 mg/kg), čemur sledi odmerjanje za naslednje 4 živali s to velikostjo odmerka, se upošteva kot mejni preskus za to navodilo.

1.6 OPAZOVANJA Živali se opazujejo posamezno po odmerjanju najmanj enkrat v prvih 30 minutah, periodično v prvih 24 urah, s posebno pozornostjo v prvih 4 urah in nato 14 dni vsak dan, razen kadar jih je treba odstraniti iz študije in humano usmrtiti, če je njihovo zdravje ogroženo ali ko so najdene poginule. Trajanja opazovanja ni treba strogo določiti. Opredeliti ga je treba na podlagi toksičnih reakcij, časa nastopa in trajanja obdobja okrevanja ter ga je zato mogoče podaljšati, kadar je to potrebno. Obdobja, ko se pojavijo znaki toksičnosti in ko izginejo, so pomembna, zlasti če obstaja možnost, da bodo toksični znaki zapozneli (11). Vsa opazovanja se sistematsko zabeležijo, za vsako žival se vodijo posamezne kartoteke. Dodatna opazovanja bodo potrebna, če živali še vedno kažejo znake toksičnosti. Opazovanja morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, in tudi na dihalih, v obtoku, na avtonomnih in centralnih živčnih sistemih ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vzorcu vedenja. Pozornost je treba posvetiti opazovanjem trezorjev, krčem, slinjenju, driski, otrplosti, spanju in komi. Treba je upoštevati principe in kriterije, povzete v Dokumentu s smernicami za humane končne točke (8). Živali, najdene v umirajočem stanju, in živali, ki kažejo hudo bolečino in trajne znake resne stiske, je treba humano usmrtiti. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti kar se da natančno.

1.6

1.6.1 Telesna teža Posamezne teže živali je treba ugotoviti tik pred dajanjem preskusne snovi in najmanj enkrat na teden po tem. Treba je izračunati in zabeležiti spremembe teže. Na koncu preskusa se preživele živali stehtajo in nato humano usmrtijo.

1.6.2 Patologija Za vse preskusne živali (vključno s tistimi, ki poginejo med preskušanjem ali se odstranijo iz študije zaradi ogroženega zdravja živali) je treba opraviti popolno obdukcijo. Vse natančne patološke spremembe je treba zabeležiti za vsako žival. Mikroskopski pregled organov živali, ki so preživele 24 ali več ur po začetnem odmerjanju, se prav tako lahko upošteva, ker lahko da koristne informacije.

2. PODATKI Zagotoviti je treba podatke za vsako posamezno žival. Nadalje je treba vse podatke prikazati v obliki preglednice, kjer je za vsako preskusno skupino prikazano število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo znake toksičnosti, število živali, najdenih poginulih med preskusom ali usmrčenih iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek toksičnih učinkov in reverzibilnost ter ugotovitve obdukcije.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno:

Preskusna snov:

fizikalno stanje, čistost in, kjer je pomembno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomernostjo),

identifikacijske podatke, vključno s številko CAS.

Nosilec (če je primerno):

utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda.

Preskusne živali:

uporabljena vrsta/sev,

mikrobiološko stanje živali, kadar je znano,

število, starost in spol živali (vključno, kjer je primerno, utemeljitev uporabe samcev namesto samic),

vir, pogoji vzdrževanja, vrsta hrane, itd.

Pogoji preskusa:

podatki o formulaciji preskusne snovi, vključno s podatki o fizikalni obliki snovi, ki jo dajemo,

podatki o formulaciji preskusne snovi, vključno z volumni odmerjanja in časom odmerjanja,

podatki o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto hrane/vir, vir vode),

utemeljitev za izbiro začetnega odmerka.

Rezultati:

preglednica odzivnih podatkov in velikost odmerka za vsako žival (npr. živali, ki kažejo znake toksičnosti, vključno s smrtnostjo, vrsto, resnostjo in trajanjem učinkov),

preglednica telesne teže in sprememb telesne teže,

teže posameznih živali na dan odmerjanja in v tedenskih intervalih po tem ter čas smrti ali usmrtitve,

datum in čas smrti, če nastopi pred načrtovano usmrtitvijo,

časovni potek nastopa znakov toksičnosti in ali so bili reverzibilni za vsako žival,

ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so na voljo.

Razprava in razlaga rezultatov.

Zaključki.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)

LITERATURA British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85–92. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469–482. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315–323. Human Exptl. Toxicol. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology . 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

B.1 tris. AKUTNA ORALNA TOKSIČNOST – METODA RAZREDOV AKUTNE TOKSIČNOSTI

B.1 tris.

1. METODA Ta preskusna metoda ustreza OECD TG 423 (2001)

1.

1.1 UVOD Metoda razredov akutne toksičnosti (1), prikazana v tem preskusu, je postopen postopek z uporabo treh živali enega spola za vsak korak. Odvisno od smrtnosti in/ali umirajočega stanja živali so lahko potrebni 2–4 koraki za omogočanje presoje o akutni toksičnosti preskusne snovi. Ta postopek je ponovljiv, zanj se uporablja zelo malo živali in omogoča razvrstitev snovi na podoben način kot z drugimi metodami preskušanja akutne toksičnosti. Metoda razredov akutne toksičnosti temelji na biometričnih vrednotenjih (2) (3) (4) (5) s točno določenimi odmerki, primerno ločenimi med seboj, da se omogoči uvrščanje snovi za razvrstitev in za ugotavljanje nevarnosti. Metoda, kakor je bila prejeta leta 1996, je bila obširno validirana in vivo v primerjavi s podatki za LD50, dobljenimi iz literature, tako nacionalne (6) kakor tudi mednarodne (7). Navodila za izbiro najustreznejše preskusne metode za dani namen se lahko poiščejo v Dokumentu s smernicami za preskušanje akutne oralne toksičnosti (8). Ta dokument s smernicami vsebuje tudi dodatne informacije o postopku in razlagi metode preskušanja B.1 tris. Preskusnih snovi, v odmerkih, za katere je znano, da povzročajo vidno bolečino in hude motnje pri živalih zaradi jedkega ali izrazito dražilnega delovanja, ni treba dajati. Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo ali kažejo znake hudih in trajnih okvar, se usmrti na human način in se jih upošteva pri razlagi rezultatov preskusa na enak način, kot živali, ki so poginile med preskusom. Kriterije za sprejem odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, ter napotke za prepoznavanje napovedljive ali neizbežne smrti obravnava poseben Dokument s smernicami (9). Metoda uporablja predhodno določene odmerke, rezultati pa omogočajo razvrstitev snovi in uvrstitev v skladu z Globalno usklajenim sistemom za razvrščanje kemikalij, ki povzročajo akutno toksičnost (10). V principu metoda ni namenjena omogočanju izračuna točnega LD50, vendar upošteva določitev opredeljenih razponov izpostavitve, kjer se pričakuje smrtnost, ker je smrt dela živali še vedno glavna končna točka tega preskusa. Ta metoda upošteva določitev vrednosti LD50 le, kadar iz najmanj 2 odmerkov sledi smrtnost, višja kakor 0 % in nižja kakor 100 %. Uporaba izbire predhodno določenih odmerkov, ne glede na preskusno snov, z razvrstitvijo, ki je izrecno povezana s številom živali, opazovanih v različnih stanjih, izboljšuje možnost za doslednost in ponovljivost poročanja med laboratoriji. Laboratorij preskušanja mora upoštevati vse razpoložljive informacije o preskusni snovi pred začetkom opravljanja študije. Takšne informacije bodo vključevale vrsto in kemijsko sestavo snovi; njene fizikalno-kemijske lastnosti; rezultat katerih koli drugih preskusov toksičnosti na snovi, in vitro ali in vivo; toksikološke podatke o strukturno sorodnih ter pričakovano uporabo/uporabe snovi. Te informacije so potrebne, da vse, ki jih to zadeva, zagotovijo, da je preskus pomemben za zaščito zdravja ljudi in da bo v pomoč pri izbiri najustreznejšega začetnega odmerka.

1.2 DEFINICIJE Akutna oralna toksičnost: nanaša se na tiste škodljive učinke, ki se pokažejo po dajanju enega odmerka snovi ali več odmerkov, danih v 24 urah. Kasnejša smrt: pomeni, da žival ne pogine ali da ne kaže znakov, da bo poginila, v 48 urah, vendar pogine kasneje med 14 dnevnim obdobjem opazovanja. Odmerek: je količina dane preskusne snovi. Odmerek je izražen kot masa preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (npr. mg/kg). GHS: Sistem globalno usklajene razvrstitve za kemijske snovi in mešanice. Skupna aktivnost OECD (zdravje ljudi in okolje), Odbor ZN strokovnjakov za prevoz nevarnega blaga (fizikalno-kemijske lastnosti) in ILO (sporočanje o nevarnosti) ter koordinirana med organizacijami s programom za pravilno ravnanje s kemikalijami (IOMC). Neizbežna smrt: ko se pričakuje umirajoče stanje ali smrt pred naslednjim planiranim časom opazovanja. Značilni znaki tega stanja pri glodalcih lahko vključujejo krče, bočni položaj, poležavanje in tremor. (Glej Dokument s smernicami z napotki za humane mejne cilje (9) za več podrobnih podatkov). LD50 (srednji smrtni odmerek): je statistično ugotovljen enkraten odmerek snovi, za katerega se lahko pričakuje, da bo povzročil smrt pri 50 odstotkih živali, kadar se jim da oralno. Vrednost LD50 je izražena z maso preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (mg/kg). Mejni odmerek: nanaša se na odmerek na zgornji omejitvi pri preskušanju (2000 ali 5000 mg/kg). Umirajoče stanje: stanje umiranja ali nezmožnosti preživeti kljub tretiranju. (Glej Dokument s smernicami humane končne točke (9) za več podrobnih podatkov). Pričakovana smrt: prisotnost kliničnih znakov, ki kažejo na smrt ob znanem času v prihodnosti pred načrtovanim zaključkom eksperimenta, na primer: nezmožnost živali, da bi dosegle vodo ali hrano. (Glej Priročnik napotki za humane končne točke (9) za več podrobnih podatkov).

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Princip preskusa je tak, da temelji na postopnosti z uporabo minimalnega števila živali za vsak korak, za omogočanje uvrstitve se pridobi dovolj informacij o akutni toksičnosti preskusne snovi. Snov se daje oralno skupini eksperimentalnih v enem od predhodno opredeljenih odmerkov. Snov se testira z uporabo postopka po korakih, za vsak korak se uporabi tri živali istega spola, običajno ženskega. Prisotnost ali odsotnost smrtnosti živali, povezane s spojino, ki so prejemale odmerek na enem koraku, bo določila naslednji korak, npr.: Podrobnosti preskusnega postopka so opisane v Dodatku 1. Metoda bo omogočila presojo glede uvrstitve preskusne snovi v enega v seriji razredov toksičnosti, opredeljenih s točno določenimi smrtnimi vrednostmi LD50.

nadaljnje preskušanje ni potrebno,

odmerjanje za tri dodatne živali, z enakim odmerkom,

odmerjanje za tri dodatne živali, z naslednjo večjo ali naslednjo manjšo velikostjo odmerka.

1.4 OPIS METODE

1.4

1.4.1 Izbira živalskih vrst Najbolj cenjena vrsta glodalca je podgana, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodalcev. Običajno se uporabljajo samice (9), to pa zato, ker pregledi običajnih LD50 preskusov v literaturi kažejo, da je le malo razlik v občutljivosti med spoloma, vendar so v tistih primerih, kjer se opažajo razlike, samice v splošnem neznatno bolj občutljive (11). Če pa iz poznavanja toksikoloških in toksikokinetičnih lastnosti strukturno sorodnih kemikalij izhaja, da je verjetno, da bodo samci bolj občutljivi, tedaj je treba uporabiti ta spol. Kadar poteka preskušanje na samcih, je treba imeti za to ustrezno obrazložitev. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Samice morajo biti nuliparne in ne smejo biti breje. Živali morajo biti na začetku odmerjanja stare 8 do 12 tednov, njihova teža pa se mora gibati v intervalu ± 20 % povprečne teže katerih koli živali, ki so predhodno prejemale odmerek.

1.4.2 Pogoji bivanja in hranjenja Temperatura prostora za preskuse z živalmi mora znašati 22 oC (± 3 oC). Čeprav mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev mora biti umetna v zaporedju 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporabijo običajne predpisane laboratorijska vrste hranjenja z neomejeno količino pitne vode. Živali se lahko razporedijo v kletke po skupinah glede na odmerek, vendar število živali v vsaki kletki ne sme vplivati na neovirano opazovanje vsake živali.

1.4.4 Priprava odmerkov Na splošno je treba preskusne snovi dajati v konstantnem volumnu v razponu odmerkov, ki jih je treba preskusiti s spreminjanjem koncentracije pripravka odmerjanja. Kadar se namerava preskusiti tekoč končni produkt ali mešanico, je uporaba nerazredčene preskusne snovi, npr. pri konstantni koncentraciji, morda ustreznejša za naknadno oceno tveganja navedene snovi, in jo nekateri regulatorni organi zahtevajo. Maksimalni volumen odmerka se v nobenem primeru ne sme prekoračiti. Maksimalni volumen tekočine, ki se jo lahko da živali naenkrat, je odvisen od velikosti preskusne živali. Pri glodalcih volumen običajno ne sme presegati 1 ml/100g telesne teže, pri vodnih raztopinah pa lahko upoštevamo 2 ml/100 g telesne teže. Glede na formulacijo preparata odmerjanja je priporočena uporaba vodne raztopine/suspenzije/emulzije, kjer koli je to možno, sledi po preferenčnem vrstnem redu raztopina/suspenzija/emulzija v olju (npr. koruzno olje) in nato po možnosti raztopina v drugih nosilcih. Za nosilce, ki niso voda, je treba poznati toksikološke lastnosti nosilca. Odmerke je treba pripraviti tik pred dajanjem, razen kadar je znana stabilnost pripravka za obdobje, v katerem bo uporabljen, in je znano, da je sprejemljiva.

1.5 POSTOPEK

1.5

1.5.1 Dajanje odmerkov Preskusna snov se daje v enem odmerku z gavažo z uporabo želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. V neobičajnih razmerah, ko enojni odmerek ni mogoč, lahko odmerek dajemo v manjših frakcijah v obdobju, ki ne presega 24 ur. Živali se morajo pred odmerjanjem postiti (npr. podgani je treba odtegniti hrano čez noč, vode pa ne; miš ne sme dobiti hrane 3 do 4 ure prej, vodo pa lahko). Po obdobju postenja je treba živali stehtati in jim dati preskusno snov. Po dajanju preskusne snovi se lahko odtegne hrano podganam za nadaljnje 3–4 ure ali mišim za 1–2 uri. Kadar se odmerek daje v frakcijah ves čas, je možno, da bo potrebno oskrbovati živali s hrano in vodo, odvisno od trajanja časovnega obdobja.

1.5.2 Število živali in velikost odmerkov Za vsak korak so potrebne 3 živali. Velikost odmerka, ki ga bo treba uporabiti kot začetni odmerek, se izbere izmed štirih stalnih velikosti, 5, 50, 300 in 2000 mg/kg telesne teže. Začetna velikost odmerka bi morala biti tista, ki bo najverjetneje povzročila smrtnost nekaterih živali odmerjanja. Tabele poteka v Dodatku 1 opisujejo postopek, ki ga je treba izvesti za vsakega od začetnih odmerkov. Dodatek 4 daje poleg tega navodila za uvrstitev v sistem EU, dokler se ne bo izvajal novi GHS sistem. Kadar je iz razpoložljivih informacije razvidno, da smrtnost pri največji velikosti (2000 mg/kg telesne teže) ni verjetna, je treba opraviti mejni preskus. Kadar o snovi, ki jo je treba preskusiti, ni nobenih informacij, je priporočeno zaradi zdravja živali uporabiti začetni odmerek 30 mg/kg telesne teže. Časovni interval med skupinami tretiranja je točno določen z nastopom, trajanjem in resnostjo toksičnih znakov. Tretiranje živali z naslednjim odmerkom je treba prestaviti na kasnejši čas, dokler ni gotovo, da bodo živali, ki so prej prejemale odmerek, preživele. Izjemoma, in le kadar to opravičujejo posebne regulatorne zahteve, se lahko upošteva uporaba dodatne večje velikosti odmerka 5000 mg/kg telesne teže (glej Dodatek 2). Zaradi skrbi za zaščito zdravja živali je preskušanje živali v območjih kategorije GHS 5 (2000–5000 mg/kg) nezaželeno in ga je treba upoštevati le, kadar obstaja velika verjetnost, da bi rezultati takšnega preskusa imeli neposreden pomen za zaščito zdravja ljudi ali živali ali za okolje.

1.5.3 Mejni preskus Mejni preskus se uporablja predvsem v primerih, kadar ima izvajalec preskusa informacije, ki kažejo, da bo preskusni material verjetno netoksičen oziroma bo njegova toksičnost le nad regulatornimi mejnimi odmerki. Informacije o toksičnosti preskusnega materiala se lahko pridobijo na podlagi znanja o podobnih preskusnih spojinah ali podobnih preskusnih mešanicah ali produktih, ob upoštevanju vrste in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko pomembne. V tistih primerih, kjer je le malo ali nič informacij o njegovi toksičnosti, ali kadar se pričakuje, da bo preskusni material toksičen, je treba opraviti glavni preskus. Mejni preskus z eno velikostjo odmerka 2000 mg/kg telesne teže se lahko opravi s šestimi živalmi (tri živali na en korak). Izjemoma se lahko opravi mejni preskus z eno velikostjo odmerka 5000 mg/kg s tremi živalmi (glej Dodatek 2). Če nastane smrtnost, povezana s preskusno snovjo, bo morda potrebno izvesti nadaljnje preskušanje z naslednjo nižjo velikostjo.

1.6 OPAZOVANJA Živali se opazujejo posamezno po odmerjanju najmanj enkrat v prvih 30 minutah, periodično v prvih 24 urah, s posebno pozornostjo v prvih 4 urah in nato 14 dni vsak dan, razen kadar jih je treba odstraniti iz študije in humano usmrtiti zaradi ogroženega zdravja ali ko so najdene poginule. Trajanja opazovanja ni treba strogo določiti. Opredeliti ga je treba na podlagi toksičnih reakcij, časa nastopa in trajanja okrevanja ter ga je zato mogoče podaljšati, kadar je to potrebno. Obdobja, ko se pojavijo znaki toksičnosti in ko izginejo, so pomembna, zlasti če obstaja težnja, da bodo toksični znaki zapozneli (12). Vsa opazovanja se sistematsko zabeležijo, za vsako žival se vodijo posamezne kartoteke. Dodatna opazovanja bodo potrebna, če živali še vedno kažejo znake toksičnosti. Opazovanja morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, in tudi na dihalih, v obtoku, na avtonomnih in centralnih živčnih sistemih ter somatomotorični aktivnosti in vedenjskem vzorcu. Pozornost je treba posvetiti opazovanjem tremorjev, krčem, slinjenju, driski, otrplosti, spanju in komi. Treba je upoštevati principe in kriterije, povzete v Dokumentu s smernicami z napotki za humane končne točke (9). Živali, najdene v umirajočem stanju, in živali, ki kažejo hudo bolečino in trajne znake hudih okvar, je treba humano usmrtiti. Kadar živali usmrtimo zaradi humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti kar se da natančno.

1.6

1.6.1 Telesna teža Posamezne teže živali je treba določiti tik pred dajanjem preskusne snovi in najmanj enkrat na teden po tem. Treba je izračunati in zabeležiti spremembe teže. Na koncu preskusa se preživele živali stehtajo in humano usmrtijo.

1.6.2 Patologija Za vse preskusne živali (vključno s tistimi, ki poginejo med preskusom ali se odstranijo iz študije zaradi zaščite zdravja živali) je treba opraviti popolno obdukcijo. Vse natančne patološke spremembe je treba zabeležiti za vsako žival. Mikroskopski pregled organov, ki kažejo resne patološke znake, pri živalih, ki so preživele 24 ali več ur po začetnem odmerjanju se prav tako lahko upošteva, ker lahko da koristne informacije.

3. POROČANJE

3.

3.1 Poročilo o preskusu Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno:

Preskusna snov:

fizikalno stanje, čistost in kjer je pomembno fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo),

identifikacijski podatki, vključno s številko CAS.

Nosilec (če je primerno):

utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda.

Preskusne živali:

uporabljena vrsta/sev,

mikrobiološko stanje živali, kadar je znano,

število, starost in spol živali (vključno, kjer je primerno, utemeljitev za uporabo samcev namesto samic),

vir, pogoji vzdrževanja, vrsta hrane, itd.

Pogoji preskusa:

podatki o formulaciji preskusne snovi, vključno s podatki o fizikalni obliki snovi, ki se daje,

podatki o dajanju preskusne snovi, vključno z volumni odmerjanja in časom odmerjanja,

podatki o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto prehranjevanja/vir, vir vode),

utemeljitev za izbiro začetnega odmerka.

Rezultati:

tabelarni prikaz odzivnih podatkov in velikost odmerka za vsako žival (npr. živali, ki kažejo znake toksičnosti, vključno s smrtnostjo; vrsto, resnost in trajanje učinkov),

tabelarni prikaz telesne teže in sprememb telesne teže,

teže posameznih živali na dan odmerjanja in v tedenskih intervalih po tem ter čas smrti ali usmrtitve,

datum in čas smrti, če nastopi pred načrtovano usmrtitvijo,

časovni potek nastopa znakov toksičnosti in ali so bili le–ti reverzibilni za vsako žival,

ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so na voljo.

Razprava in razlaga rezultatov.

Zaključki.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)

LITERATURA Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86 Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610 Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134 Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

B.2 AKUTNA STRUPENOST (PRI VDIHAVANJU)

B.2

1. METODA

1.

1.1 UVOD Koristno je imeti predhodne informacije o porazdelitvi velikosti delcev, parnem tlaku, tališču, vrelišču, plamenišču in eksplozivnosti (če je primerno) snovi. Glej tudi Splošni uvod, del B(A).

1.2 OPREDELITVE Glej Splošni uvod dela B (B).

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Več skupin poskusnih živali se za določeno obdobje izpostavi preskusni snovi v stopnjevanih koncentracijah, pri čemer se uporabi ena koncentracija na skupino. Nato se opazujejo učinki in smrtnost. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa tudi na preživelih živalih. Živali, ki kažejo hude in dolgotrajne znake stresa in bolečine, bo morda treba humano usmrtiti. Odmerjanja preskusnih snovi na način, za katerega je znano, da povzroča izrazito bolečino in stres zaradi jedkih ali hudih dražilnih lastnosti, ni treba izvesti.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6

1.6.1 Priprave Najmanj pet dni pred začetkom preskusa se živali nastanijo v preskusnih pogojih nastanitve in hranjenja. Pred preskusom se zdrave mlade živali naključno izberejo in dodelijo potrebnemu številu skupin. Živali ni treba izpostaviti simulirani izpostavljenosti, razen če tako določa vrsta uporabljene aparature za izpostavljanje. Trdne preskusne snovi bo morda treba mikronizirati, da bo velikost delcev ustrezna. Po potrebi se preskusni snovi lahko doda ustrezni nosilec, da se lažje doseže primerna koncentracija preskusne snovi v zraku, vendar je treba nato uporabiti kontrolno skupino za ta nosilec. Če se za lažje odmerjanje uporabi nosilec ali drugi dodatki, mora biti dokazano, da ne povzročajo strupenih učinkov. Če je primerno, se lahko uporabijo podatki preteklih študij.

1.6.2 Preskusni pogoji

1.6.2

1.6.2.1 Poskusne živali Razen v primeru kontraindikacij, je podgana najprimernejša vrsta. Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve. Ob začetku preskusa pri nobenem spolu območje nihanja mase uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % ustrezne srednje vrednosti.

1.6.2.2 Število in spol Za vsako koncentracijo se uporabi najmanj 10 glodavcev (pet samic in pet samcev). Samice morajo biti nulipare in nebreje. Opomba: Pri preskusih akutne strupenosti na živalih iz sistematskih skupin, višjih od glodavcev, je treba razmisliti o uporabi manjšega števila živali. Odmerke je treba skrbno izbrati in treba si je čim bolj prizadevati, da se ne presežejo zmerno strupeni odmerki. Pri takih preskusih se je treba izogibati dajanju smrtnih odmerkov preskusne snovi.

1.6.2.3 Koncentracije izpostavljenosti Teh mora biti dovolj, najmanj tri, in biti morajo v primernih intervalih koncentracij, da pri preskusnih skupinah povzročijo niz različnih strupenih učinkov in stopenj umrljivosti. Podatki morajo zadoščati za izdelavo krivulje smrtnosti v odvisnosti od koncentracije in, kadar je mogoče, omogočiti sprejemljivo določitev LC50.

1.6.2.4 Mejni preskus Če pri štiriurni izpostavitvi petih moških ali petih ženskih testnih živali 20 mg na liter plina ali 5 mg na liter aerosola ali delcev (ali če to ni mogoče zaradi fizičnih ali kemičnih lastnosti, vključno z eksplozivnimi lastnostmi testne snovi, maksimalne dosegljive koncentracije) v 14 dneh ne pride do smrtnosti zaradi sestavin, nadaljnje preskušanje ni potrebno.

1.6.2.5 Čas izpostavljenosti Obdobje izpostavljenosti mora trajati štiri ure.

1.6.2.6 Oprema Preskušanje na živalih se izvaja z opremo za vdihavanje, ki je zasnovana tako, da vzdržuje dinamični pretok zraka z najmanj 12 zamenjavami zraka na uro, da se zagotovita zadostna vsebnost kisika in enakomerna porazdelitev izpostavitvenega ozračja. Če se uporabi komora, mora biti zasnovana tako, da preskusne živali niso prenatrpane in so kar najbolj izpostavljene preskusni snovi z vdihavanjem. Splošno pravilo zagotavljanja stabilnosti ozračja v komori je, da skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % volumna preskusne komore. Lahko se uporabi nazooralno izpostavljanje, izpostavljanje samo glave ali izpostavljanje celega telesa v posamični komori; prva dva načina omogočata, da se sprejem preskusne snovi po drugih poteh čim bolj zmanjša.

1.6.2.7 Obdobje opazovanja Obdobje opazovanja mora trajati najmanj 14 dni. Vendar trajanje obdobja opazovanja ne sme biti strogo določeno. Določeno mora biti na podlagi reakcij na strupenost, hitrosti njihovega pojavljanja in dolžine obdobja okrevanja; kadar se zdi potrebno, se lahko podaljša. Čas pojava in izginotja znakov strupenosti ter čas smrti sta pomembna, zlasti če se kaže težnja časovnega zamika smrti.

1.6.3 Postopek Tik pred izpostavitvijo se živali stehtajo, nato se v za to določeni aparaturi izpostavijo preskusni koncentraciji za štiri ure, potem ko se je v komori vzpostavilo ravnovesje koncentracije. Čas uravnovešanja mora biti kratek. Med preskusom je treba vzdrževati temperaturo 22 ± 3 oC. V idealnih razmerah bi bilo treba relativno vlažnost vzdrževati med 30 in 70 %, vendar to v nekaterih primerih (npr. preskusi z nekaterimi aerosoli) ni izvedljivo. Vzdrževanje rahlega podtlaka v komori (< 5 mm vode) bo preprečilo uhajanje preskusne snovi v okolico. Med izpostavljenostjo se živalim ne dajeta ne hrana ne voda. Treba je uporabiti primerne sisteme za ustvarjanje in spremljanje preskusne atmosfere. Sistem mora zagotoviti, da se čim hitreje dosežejo stabilni pogoji izpostavljenosti. Komora mora biti zasnovana in upravljana tako, da se ohranja homogena porazdelitev preskusne atmosfere v njej. Meriti ali spremljati je treba: Med izpostavitvijo in po njej se izvaja sistematično opazovanje in zapisovanje opažanj; za vsako žival je treba voditi svojo evidenco. Prvi dan morajo biti opazovanja pogosta. Najmanj enkrat na vsak delavnik je treba izvesti temeljit klinični pregled, druga opazovanja pa se izvajajo vsak dan, z ustreznimi ukrepi za zmanjševanje izgube živali v študiji, npr. z obdukcijo ali ohladitvijo poginulih živali in osamitvijo ali žrtvovanjem šibkih ali umirajočih živali. Opazovati je treba spremembe na koži in kožuhu, očeh, sluznici, dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju ter somatomotorični aktivnosti in vedenjskem vzorcu. S posebno pozornostjo je treba opazovati dihanje, tremor, krče, slinjenje, diarejo, letargijo, spanje in komo. Čas smrti je treba zapisati čim bolj natančno. Maso posameznih živali je treba določati vsak teden po izpostavljenosti in ob smrti. Na živalih, ki poginejo med preskusom, in tistih, preživelih ob koncu preskusa, se opravi obdukcija, pri kateri se posebna pozornost posveti vsem spremembam v zgornjem in spodnjem predelu dihalne poti. Zapisati je treba vse makroskopske patološke spremembe. Kadar je tako navedeno, je treba vzeti vzorec tkiva za histopatološko preiskavo.

1.6.3

(a) pretok zraka (neprekinjeno);

(b) dejansko koncentracijo preskusne snovi, merjeno v območju dihanja najmanj trikrat med izpostavitvijo (pri nekaterih atmosferah, npr. aerosolih v velikih koncentracijah, bo morda potrebno polj pogosto spremljanje). V obdobju izpostavljenosti se koncentracija ne sme spreminjati za več kot ± 15 % srednje vrednosti. Vendar je lahko pri nekaterih aerosolih taka stopnja nadzora nedosegljiva in je zato sprejemljiv večji razpon. Pri aerosolih je treba izvajati analizo velikosti delcev, tako pogosto kot je potrebno (najmanj enkrat na preskusno skupino).

2. PODATKI Podatke je treba povzeti v tabeli, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa, čas smrti posameznih živali, število živali, ki kažejo druge znake strupenosti, opis strupenih učinkov in izsledke obdukcije. Spremembe v masi je treba izračunati in zapisati, kadar preskusna žival preživi več kakor en dan. Živali, ki se humano usmrtijo zaradi s snovjo povezanih stresa in bolečine, se zapišejo kot s snovjo povezane smrti. LC50 je treba določiti s pomočjo priznane metode. Vrednotenje podatkov mora vključevati morebitno razmerje, med izpostavljenostjo živali preskusni snovi ter incidenco in resnostjo vseh nepravilnosti, vključno z vedenjskimi in kliničnimi nepravilnostmi, hujšimi poškodbami, spremembami v telesni masi, smrtnostj in kakršnimi koli drugimi strupenimi učinki.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije: Podatki o izpostavitvi Ti morajo biti zbrani v tabeli in prikazani s srednjimi vrednostmi in mero variabilnosti (npr. standardna deviacija) ter po možnosti vključevati:

vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, prehrana itd.,

preskusni pogoji: opis aparature za izpostavljanje vključno z načrtom, vrsto, merami, virom zraka, sistemom za proizvajanje aerosolov, metodo za klimatiziranje zraka in metodo namestitve živali v preskusni komori, če je bila uporabljena. Opisati je treba opremo za merjenje temperature, vlažnosti ter koncentracije in porazdelitve velikosti delcev aerosolov.

3.1

(a) pretok zraka skozi opremo za vdihavanje;

(b) temperaturo in vlažnost zraka;

(d) vrsto nosilca, če je bil uporabljen;

(e) dejanske koncentracije v preskusnem območju dihanja;

(f) srednji aerodinamični masni premer (mmad) in geometrijsko standardno deviacijo (GSD);

(g) čas uravnovešanja koncentracije;

(h) obdobje izpostavljenosti;

tabelarni prikaz podatkov o odzivu po spolu in ravni izpostavljenosti (tj. število živali, ki so poginile ali bile usmrčene med preskusom; število živali, ki kažejo znake strupenosti; število izpostavljenih živali),

čas smrti med izpostavitvijo ali po njej, razlogi in merila za humano usmrtitev živali,

vsa opažanja,

vrednost LC50 za vsak spol, določena ob koncu obdobja opazovanja (z navedeno metodo izračunavanja),

95 % interval zaupanja za LC50 (kadar je to mogoče),

krivulja odmerek/smrtnost in naklon (kadar to omogoča metoda določanja),

izsledki obdukcije,

kakršni koli izsledki histopatoloških preiskav,

razprava o rezultatih (posebno pozornost je treba posvetiti morebitnemu učinku humanih usmrtitev med preskusom na izračunano vrednost LC50),

razlaga rezultatov.

3.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B (D).

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B (E).

B.3 AKUTNA STRUPENOST (V STIKU S KOŽO)

B.3

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B (A).

1.2 OPREDELITVE Glej Splošni uvod dela B (B).

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Preskusna snov se nanese na kožo v stopnjevanih odmerkih več skupinam poskusnih živali, pri čemer se uporabi en odmerek na skupino. Nato se opazujejo učinki in smrtnost. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa tudi na preživelih živalih. Živali, ki kažejo hude in dolgotrajne znake stresa in bolečine, bo morda treba humano usmrtiti. Odmerjanja preskusnih snovi na način, za katerega je znano, da povzroča izrazito bolečino in stres zaradi jedkih ali dražilnih lastnosti, ni treba izvesti.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6

1.6.1 Priprave Najmanj pet dni pred začetkom preskusa se živali nastanijo v preskusnih kletkah v preskusnih pogojih nastanitve in hranjenja. Pred preskusom se zdrave mlade odrasle živali naključno izberejo in dodelijo tretiranim skupinam. Približno 24 ur pred preskusom je treba živalim s hrbtnega dela trupa s striženjem ali britjem odstraniti dlako. Med striženjem ali britjem dlake je treba paziti, da se koža ne odrgne, kar bi lahko spremenilo njeno prepustnost. Za nanos preskusne snovi je treba pripraviti najmanj 10 % telesne površine. Pri preskušanju trdnih snovi, ki se po potrebi lahko uprašijo, je treba preskusno snov dovolj navlažiti z vodo ali, kadar je potrebno, ustreznim nosilcem, da se zagotovi dober stik s kožo. Pri uporabi nosilca je treba upoštevati njegov vpliv na prodiranje preskusne snovi skozi kožo. Tekoče preskusne snovi se običajno uporabljajo nerazredčene.

1.6.2 Preskusni pogoji

1.6.2

1.6.2.1 Poskusne živali Uporabi se lahko odrasla podgana ali kunec. Uporabijo se lahko tudi druge vrste, vendar je treba njihovo uporabo utemeljiti. Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve. Ob začetku preskusa pri nobenem spolu območje nihanja mase uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % ustrezne srednje vrednosti.

1.6.2.2 Število in spol Na vsako velikost odmerka se uporabi najmanj 5 živali. Vse morajo biti istega spola. Če se uporabijo samice, morajo biti nulipare in nebreje. Kadar so na voljo informacije, da je eden od spolov izrazito občutljivejši, je treba snov odmeriti živalim tega spola. Opomba: Pri preskusih akutne strupenosti na živalih iz sistematskih skupin, višjih od glodavcev, je treba razmisliti o uporabi manjšega števila živali. Odmerke je treba skrbno izbrati in treba si je čim bolj prizadevati, da se ne presežejo zmerno strupeni odmerki. Pri takih preskusih se je treba izogibati dajanju smrtnih odmerkov preskusne snovi.

1.6.2.3 Velikost odmerkov Teh mora biti dovolj, najmanj tri, in biti morajo v primernih intervalih koncentracij, da pri preskusnih skupinah povzročijo niz različnih strupenih učinkov in stopenj umrljivosti. Pri določanju velikosti odmerkov je treba upoštevati vse dražilne ali jedke učinke. Podatki morajo zadoščati za izdelavo krivulje odmerek/odziv in, kadar je mogoče, omogočiti sprejemljivo določitev LD50.

1.6.2.4 Mejni preskus Lahko se izvede mejni preskus pri eni velikosti odmerka najmanj 2000 mg/kg telesne mase na skupini 5 samcev in 5 samic po spodaj opisanem postopku. Če se pojavi smrtnost, povezana s snovjo, bo morda potrebna popolna študija.

1.6.2.5 Obdobje opazovanja Obdobje opazovanja mora trajati najmanj 14 dni. Vendar trajanje opazovanja ne sme biti strogo določeno. Določeno mora biti na podlagi reakcij na strupenost, hitrosti njihovega pojavljanja in dolžine obdobja okrevanja; kadar se zdi potrebno, se lahko podaljša. Čas pojava in izginotja znakov strupenosti, njihovo trajanje ter čas smrti so pomembni, zlasti če se kaže težnja časovnega zamika smrti.

1.6.3 Postopek Vsaka žival mora biti v svoji kletki. Preskusno snov je treba enakomerno nanesti na območje, ki predstavlja približno 10 % skupne telesne površine. Pri zelo strupenih snoveh je lahko površina nanosa manjša, vendar mora biti čim več površine pokrite s čim tanjšo in enakomerno plastjo. Snov mora ostati v stiku s kožo celo 24-urno obdobje izpostavljenosti, kar se zagotovi s poroznim gaznim povojem in nedražilnim obližem. Preskusna površina mora biti dodatno ustrezno pokrita, da gazni povoj in preskusna snov ostaneta na istem mestu in se živalim prepreči zaužitje preskusne snovi. Za preprečitev zaužitja se lahko uporabijo pripomočki za omejevanje gibanja, vendar popolna imobilizacija ni priporočena metoda. Ob koncu obdobja izpostavljenosti se ostanek preskusne snovi odstrani, kadar je to izvedljivo, z vodo ali kako drugo ustrezno metodo čiščenja kože. Opazovanja se beležijo sistematično in sproti. Za vsako žival je treba voditi svojo evidenco. Prvi dan morajo biti opazovanja pogosta. Najmanj enkrat na vsak delavnik je treba izvesti temeljit klinični pregled, druga opazovanja pa se izvajajo vsak dan, z ustreznimi ukrepi za zmanjševanje izgube živali v študiji, npr. z obdukcijo ali ohladitvijo poginulih živali in osamitvijo ali žrtvovanjem šibkih ali umirajočih živali. Opazovati je treba spremembe na kožuhu, tretirani koži, očeh in sluznici ter tudi v dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju, somatomotorični aktivnosti in vedenjskem vzorcu. S posebno pozornostjo je treba opazovati tremor, krče, slinjenje, diarejo, letargijo, spanje in komo. Čas smrti je treba zapisati kolikor je mogoče natančno. Na živalih, ki poginejo med preskušanjem, in tistih, preživelih ob koncu preskusa, se opravi obdukcija. Zapisati je treba vse makroskopske patološke spremembe. Kadar je tako navedeno, je treba vzeti vzorec tkiva za histopatološko preiskavo.

1.6.3 Ocena strupenosti pri drugem spolu

Po zaključku študije na enem spolu, se snov odmeri najmanj eni skupini 5 živali drugega spola, da se ugotovi, ali so živali tega spola izrazito občutljivejše za preskusno snov. V posameznih primerih je upravičena uporaba manjšega števila živali. Kadar so na voljo zadovoljive informacije, ki kažejo, da so živali preskušenega spola izrazito občutljivejše, preskušanje živali drugega spola ni potrebno.

2. PODATKI Podatke je treba povzeti v tabeli, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa, čas smrti posameznih živali, število živali, ki kažejo druge znake strupenosti, opis strupenih učinkov in izsledke obdukcije. Maso posameznih živali je treba določiti in zapisati tik pred nanašanjem preskusne snovi, vsak teden po tem ter ob smrti; spremembe v masi je treba izračunati in zapisati, kadar preskusna žival preživi več kakor en dan. Živali, ki se humano usmrtijo zaradi s snovjo povezanih stresa in bolečine, se zapišejo kot s snovjo povezane smrti. LD50 je treba določiti s pomočjo priznane metode. Vrednotenje podatkov mora vključevati vrednotenje morebitnih razmerij med izpostavljenostjo živali preskusni snovi ter incidenco in resnostjo vseh nepravilnosti, vključno z vedenjskimi in kliničnimi nepravilnostmi, hujšimi poškodbami, spremembami v telesni masi, smrtnostjo in kakršnimi koli drugimi strupenimi učinki.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, prehrana itd.,

preskusni pogoji (vključno z metodo čiščenja kože in vrsto povoja: okluzivni ali neokluzivni),

velikost odmerkov (z nosilcem, če se uporablja, in koncentracijami),

spol živali, ki so prejele preskusno snov,

tabelarni prikaz podatkov o odzivu po spolu in velikosti odmerka (tj. število živali, ki so poginile ali so bile usmrčene med preskusom; število živali, ki kažejo znake strupenosti; število izpostavljenih živali),

čas smrti po odmerjanju, razlogi in merila za humano usmrtitev živali,

vsa opažanja,

vrednost LD50 za spol, na katerem je bila opravljena popolna študija, določena po 14 dneh z navedeno metodo določanja,

95 % interval zaupanja za LD50 (kadar je to mogoče),

krivulja odmerek/smrtnost in naklon, kadar to omogoča metoda določanja,

izsledki obdukcije,

kakršni koli izsledki histopatoloških preiskav,

rezultati kakršnih koli preskusov na drugem spolu,

razprava o rezultatih (posebno pozornost je treba posvetiti morebitnemu učinku humanih usmrtitev živali med preskusom na izračunano vrednost LD50),

razlaga rezultatov.

3.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B (D).

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B (E).

B.4 AKUTNA TOKSIČNOST: DERMALNA DRAŽILNOST/JEDKOST

B.4

1. METODA Ta metoda ustreza OECD TG 404 (2002).

1.

1.1 UVOD Pri pripravi te dopolnjene metode je veljala posebna pozornost možnim izboljšavam v zvezi s skrbjo za zdravje živali in vrednotenje vseh obstoječih informacij o preskusni snovi, da bi se izognili nepotrebnemu preskušanju na laboratorijskih živalih. Ta metoda vključuje priporočilo, da je treba pred začetkom opravljanja preskusa za dražilnost/jedkost snovi in vivo opraviti analizo tehtnosti dokazov na podlagi pomembnih obstoječih podatkov. Kadar ni na voljo dovolj podatkov, se lahko pridobijo z uporabo zaporednega preskušanja (1). Strategija preskušanja vključuje opravljanje validiranih in sprejetih in vitro preskusov in je podana kot dodatek k tej metodi. Kjer je to ustrezno, je poleg tega priporočena zaporedna aplikacija treh preskusnih obližev na živali v začetnem preskusu in vivo namesto sočasne. Za znanstveno zanesljivost in zdravje živali je koristno, da se preskušanje in vivo ne začne opravljati, dokler se niso ocenili vsi razpoložljivi podatki, pomembni za možno dermalno dražilnost/jedkost snovi z analizo tehtnosti dokazov. Takšni podatki bodo vključevali dokaze obstoječih študij na ljudeh in/ali laboratorijskih živalih, dokaze o dražilnosti/jedkosti ene ali več strukturno sorodnih snovi ali mešanic takšnih snovi, podatke, ki bodo dokazovali močno kislost ali alkalnost snovi (2)(3), in rezultate iz validiranih in sprejetih in vitro ali ex vivo preskusov (4)(5)(5a). Ta analiza bi morala zmanjšati potrebo po in vivo preskušanju dermalne jedkosti/dražilnosti snovi, za katere obstaja že dovolj dokazov iz drugih študij glede navedenih dveh končnih točk. Bolj upoštevana strategija zaporednega preskušanja, ki vključuje opravljanje validiranih in sprejetih in vitro ali ex vivo preskusov za jedkost/dražilnost, je vključena kot dodatek k tej metodi. To strategijo so razvili in soglasno priporočili udeleženci OECD delavnice (6) in se je sprejela kot priporočena strategija preskušanja v Globalno usklajenem sistemu za razvrstitev kemijskih snovi (GHS) (7). Priporočeno se je ravnati po tej strategiji preskušanja pred opravljanjem preskušanja in vivo. Za nove snovi je priporočen postopen način preskušanja za pridobivanje znanstveno zanesljivih podatkov o jedkosti/dražilnosti snovi. Za obstoječe snovi, za katere ni dovolj podatkov, je treba uporabiti to strategijo za zapolnitev vrzeli manjkajočih podatkov. Uporabo drugačne strategije preskušanja ali postopka ali odločitev, da se ne bo uporabil način preskušanja po korakih, je treba upravičiti. Če določitev jedkosti ali dražilnosti ni mogoča na podlagi analize tehtnosti dokazov, skladne s strategijo zaporednega preskušanja, je treba upoštevati preskus in vivo (glej Dodatek).

1.2 DEFINICIJE Dermalna dražilnost: je nastanek reverzibilne poškodbe kože, ki sledi uporabi preskusne snovi, trajajoči do 4 ure. Dermalna jedkost: je nastanek ireverzibilne poškodbe kože, in sicer vidne nekroze skozi epidermisa in v dermis, ki sledi uporabi preskusne snovi, trajajoči do 4 ure. Za jedke reakcije so značilni čiri, krvavitve, krvave kraste in na koncu štirinajstdnevnih opazovanj sprememba barve zaradi pobledele kože, celi predeli plešavosti in brazgotine. Treba je upoštevati histopatologijo za vrednotenje sumljivih lezij.

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Snov, ki jo je treba preskusiti, se nanese na kožo preskusne živali v enkratnem odmerku; netretirane površine kože preskusne živali služijo za kontrolo. Stopnja dražilnosti/jedkosti se odčita in zabeleži v določenih intervalih in nadalje opiše, da se zagotovi celovito vrednotenje reverzibilnosti ali ireverzibilnosti opaženih učinkov. Živali, ki kažejo trajne znake hudega trpljenja in/ali bolečine v kateri koli fazi preskusa je treba humano usmrtiti in snov skladno s tem oceniti. Kriterije za sprejem odločitve o humani usmrtitvi umirajočih in hudo trpečih živali je mogoče najti v sklicu (8).

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Priprava za preskus in vivo

1.4.1

1.4.1.1 Izbira živalskih vrst Kunec beličnik je najbolj zaželena laboratorijska žival in uporabljajo se zdravi mladi odrasli kunci. Za uporabo drugih vrst je potrebna obrazložitev.

1.4.1.2 Priprava živali Približno 24 ur pred preskusom je treba odstraniti kožuh s skrbnim striženjem na hrbtnem delu trupa živali. Paziti je treba, da se ne odrgne koža in uporabiti le živali z zdravo, nepoškodovano kožo. Nekateri kunčji sevi imajo goste zaplate dlak, ki so bolj izrazite v nekaterih obdobjih med letom. Takšni predeli goste rasti dlak se ne smejo uporabiti kot preskusni predeli.

1.4.1.3 Pogoji bivanja in hranjenja Živali morajo imeti vsaka svoj prostor. Temperatura prostora za preskuse z živalmi mora znašati za kunce 20 oC (± 3 oC). Čeprav mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev mora biti umetna v zaporedju 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporabijo običajne predpisane laboratorijske vrste hrane z neomejeno količino pitne vode.

1.4.2 Preskusni postopek

1.4.2

1.4.2.1 Aplikacija preskusne snovi Preskusno snov je treba nanesti na del površine kože (približno 6 cm) in pokriti z obližem iz gaze, ki se pritrdi z nedražilnim trakom. Kadar neposredna aplikacija ni mogoče (npr. tekoče snovi ali nekatere kašnate zmesi), je treba preskusno snov najprej nanesti na obliž iz gaze, ki se nato uporabi na koži. Obliž mora biti v ohlapnem stiku s kožo, pritrjen z ustrezno napol zapiralno obvezo med trajanjem izpostavitve. Če se preskusna snov nanese na obliž, jo je treba pritrditi na kožo na takšen način, da je stik dober in snov enakomerno razporejena po koži. Treba je preprečiti živali dostop do obliža in zaužitje ali vdihavanje preskusne snovi. Tekoče preskusne snovi se navadno uporabljajo nerazredčene. Kadar se preskušajo trdne snovi (ki se jih lahko zdrobi, če je to po presoji potrebno), je treba preskusno snov navlažiti z zelo majhno količino vode (ali, kadar je potrebno, z drugim ustreznim nosilcem), ki zadostuje za zagotavljanje dobrega stika s kožo. Kadar se uporabljajo drugi nosilci in ne voda, mora biti možen vpliv nosilca na dražilnost kože zaradi preskusne snovi minimalen, če sploh kateri. Na koncu obdobja izpostavljenosti, ki traja običajno 4 ure, je treba odstraniti preostalo preskusno snov, kjer je to izvedljivo, z uporabo vode ali ustreznega topila, ne da bi se spremenil obstoječi odziv ali integriteta epidermisa.

1.4.2.2 Velikost odmerka Odmerek 0,5 ml tekoče snovi ali 0,5 g trdne snovi ali kašnate zmesi se nanese na preskusni predel.

1.4.2.3 Začetni preskus (dermalni preskus dražilnosti/jedkosti in vivo z uporabo ene živali) Močno je priporočeno, da se preskus in vivo na začetku izvede z uporabo ene živali, zlasti kadar se za snov domneva, da je potencialno jedka. To je v skladu s strategijo zaporednega preskušanja (glej Dodatek 1). Kadar se za snov na podlagi analize tehtnosti dokazov presodi, da je jedka, ni potrebno nadaljnje preskušanje na živalih. Za večino snovi, za katere se domneva, da so jedke, nadaljnje preskušanje in vivo običajno ni potrebno. Kadar se kljub temu zdi potrebno zagotoviti dodatne podatke zaradi pomanjkljivih dokazov, se lahko izvede preskušanje na živalih z uporabo naslednjega pristopa: Na žival se zaporedoma nanesejo do trije preskusni obliži. Prvi obliž se odstrani po treh minutah. Če ni opazna nobena resna reakcija kože, se nanese drugi obliž in se odstrani po eni uri. Če kažejo opazovanja v tej fazi, da se na human način lahko dopusti podaljšanje izpostavljenosti na štiri ure, se nanese tretji obliž in se odstrani po štirih urah, odziv pa se razvrsti po stopnjah. Če se opazi jedek učinek po kateri koli izmed teh treh zaporednih izpostavitev, se preskus nemudoma zaključi. Če se jedek učinek ne opazi po tem, ko se odstrani zadnji obliž, se žival opazuje 14 dni, razen kadar se jedkost razvije v zgodnejši časovni točki. Kadar se ne pričakuje, da bo preskusna snov povzročila jedkost, a bi lahko bila dražilna, je treba nanesti le en obliž na eno žival za štiri ure.

1.4.2.4 Potrditveni preskus (dermalni preskus dražilnosti in vivo z dodatnimi živalmi) Če se jedek učinek ne opazi v začetnem preskusu, je treba dražilni ali negativni odziv potrditi z uporabo do dveh dodatnih živali, s po enim obližem za vsako, v obdobju izpostavitve štirih ur. Če se v začetnem preskusu opazi dražilen učinek, se potrditveni preskus lahko naredi na zaporeden način ali s sočasno izpostavitvijo dveh dodatnih živali. Izjemoma, ko se začetni preskus ne izvaja, se lahko dve ali tri živali tretira le z enim obližem, ki se odstrani po štirih urah. Kadar se uporabljata dve živali, ni potrebno nadaljnje preskušanje, če obe kažeta enak odziv. V nasprotnem primeru se preskusi tudi tretja žival. Možno je, da bo treba oceniti dvomljive odzive z uporabo dodatnih živali.

1.4.2.5 Obdobje opazovanja Obdobje opazovanja mora trajati dovolj dolgo, da se lahko v celoti ovrednoti reverzibilnost opaženih učinkov. Preskus je treba zaključiti ob katerem koli času, kadar kaže žival trajajoče znake hude bolečine ali okvar. Za določitev reverzibilnosti učinkov je treba živali opazovati 14 dni po odstranitvi obližev. Če se opazi reverzibilnost pred potekom 14 dni, je treba v tistem času preskus zaključiti.

1.4.2.6 Klinična opazovanja in razvrstitev reakcij kože v stopnje Vse živali je treba pregledati, ali imajo znake rdečine in edemov, ter odzive zabeležiti po 60 minutah in nato po 24, 48 in 72 urah po odstranitvi obliža. Za začetne preskuse na eni živali se pregleda tudi preskusni predel takoj za tem, ko se obliž odstrani. Dermalne reakcije se razvrstijo v stopnje in zabeležijo v skladu s stopnjami iz tabele spodaj. Če nastane poškodba kože, ki je ni mogoče opredeliti kot dražilnost ali jedkost po 72 urah, bodo morda potrebna opazovanja do štirinajstega dne za opredelitev reverzibilnosti učinkov. Poleg opazovanja dražilnosti je treba v celoti zapisati in zabeležiti vse lokalne toksične učinke, kakor npr. tanjšanje kože in vse sistemske nasprotne učinke (npr. učinke na klinične znake toksičnosti in telesno težo). Za razjasnitev dvomljivih odzivov je treba opraviti histopatološki pregled. Razvrščanje kožnih odzivov je nujno subjektivno. Da bi pospešili usklajevanje pri razvrščanju kožnih odzivov in nudili pomoč preskuševalnim laboratorijem ter vsem sodelujočim pri oblikovanju in razlagi rezultatov opazovanj, mora biti osebje, ki izvaja ta opazovanja, ustrezno usposobljeno, da obvlada uporabljeni sistem določanja stopnje (glej tabelo spodaj). Pri tem bi lahko bil v pomoč ilustriran priročnik za določanje stopnje dermalne dražilnosti in drugih poškodb (9).

2. PODATKI

2.

2.1 OBDELAVA REZULTATOV Rezultati študije se morajo povzeti v obliki preglednice v končnem poročilu o preskusu in morajo zajemati vse postavke s seznama v oddelku 3.1.

2.2 VREDNOTENJE REZULTATOV Rezultate dermalne dražilnosti je treba vrednotiti v povezavi z vrsto in resnostjo lezij ter njihovo reverzibilnostjo ali pomanjkanjem reverzibilnosti. Posamezni rezultati ne predstavljajo absolutnega standarda za dražilne lastnosti materiala, ker se vrednotijo tudi drugi učinki preskusnega materiala. Namesto tega je treba razumeti posamezne rezultate kot referenčne vrednosti, ki jih je treba ovrednotiti v zvezi z vsemi drugimi opazovanji iz študije. Reverzibilnost dermalnih lezij je treba upoštevati pri oceni dražilnih odzivov. Kadar so odzivi, kakor npr. plešavost, hiperkeratoza, hiperplazija in luščenje vidni do konca 14-dnevnega obdobja opazovanja, se preskusna snov obravnava kot dražilna.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno:

Obrazložitev za preskušanje in vivo: analiza tehtnosti dokazov iz prej obstoječih preskusnih podatkov, vključno z rezultati strategije zaporednega preskušanja:

opis pomembnih podatkov, ki so na voljo pred preskušanjem,

podatki, pridobljeni v vsaki fazi strategije preskušanja,

opis opravljenih in vitro preskusov, vključno s podrobnimi podatki o postopkih, rezultati, dobljeni s preskusnimi/referenčnimi snovmi,

analiza tehtnosti dokazov za opravljanje študije in vivo.

Preskusna snov:

identifikacijski podatki (npr. številka CAS; vir, čistost, znane nečistoče, številka skupine),

fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr.: pH hlapnost, topnost, stabilnost),

če gre za mešanico, sestava in relativni odstotek sestavin.

Nosilec:

identifikacija, koncentracija (kjer je ustrezno), uporabljeni volumen,

obrazložitev upravičenosti izbire nosilca.

Preskusne živali:

uporabljena vrsta/sev, obrazložitev uporabe živali, če to ni kunec beličnik,

število živali istega spola,

teže posameznih živali na začetku in na zaključku preskusa,

starost na začetku študije,

vir živali, pogoji bivanja, vrsta hranjenja, itd.

Pogoji preskusa:

tehnika priprave predela za obliž,

podrobni podatki o uporabljenih materialih za obliže in tehnika dela z obliži,

podrobni podatki o pripravi preskusne snovi, aplikaciji in odstranitvi.

Rezultati:

preglednica doseženih rezultatov odziva na dražilnost/jedkost za vsako žival na vseh izmerjenih časovnih točkah,

opis vseh opaženih lezij,

pripovedni opis vrste in stopnje opažene dražilnosti ali jedkosti in katere koli histopatološke ugotovitve,

opis drugih nasprotnih, lokalnih (npr. tanjšanje kože) in sistemskih učinkov poleg derrmalne dražilnosti in jedkosti.

Razprava o rezultatih.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(5a)(6)(7)(8)(9)

LITERATURA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720. ECETOC (1990) Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm). EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Available from OECD Secretariat upon request].

Tabela I Nastanek rdečine in krast Tvorba kožnih oteklin UVRŠČANJE KOŽNIH REAKCIJ V STOPNJE

Rdečine ni … 0 Neznatna rdečina (komajda opazna) … 1 Zelo razločna rdečina … 2 Rdečina od zmerne do resne … 3 Resna rdečina (goveja rdečina) in nastanek krast ovirata razvrstitev rdečine … 4 Največ možnih: 4 Kožnih oteklin ni … 0 Neznatna kožna oteklina (komajda opazna) … 1 Rahla oteklina (robovi predela dobro vidni, ker so izbočeni) … 2 Zmerna kožna oteklina (izbočena približno 1 mm) … 3 Resna kožna oteklina (izbočena več kakor 1 mm in razširjena izven predela izpostavitve) … 4 Največ možnih: 4 Za razjasnitev dvomljivih odzivov se lahko opravi histopatološki pregled.

B.5 AKUTNA TOKSIČNOST: OČESNA DRAŽILNOST/JEDKOST

B.5

1. METODA Ta metoda ustreza OECD TG 405 (2002).

1.

1.1 UVOD Pri pripravi te dopolnjene metode je veljala posebna pozornost možnim izboljšavam z vrednotenjem vseh obstoječih informacij o preskusni snovi, da bi se izognili nepotrebnemu preskušanju na laboratorijskih živalih zaradi skrbi za zdravje živali. Ta metoda vključuje priporočilo, da je treba pred začetkom opravljanja opisanega preskusa in vivo za akutno očesno dražilnost/jedkost opraviti analizo tehtnosti dokazov (1) na podlagi ustreznih obstoječih podatkov. Kadar ni na voljo dovolj podatkov, je priporočeno, da se pridobijo z uporabo zaporednega preskušanja (2)(3). Strategija preskušanja vključuje opravljanje validiranih in sprejetih in vitro preskusov in je dana kot dodatek k tej metodi preskušanja. Poleg tega je priporočena uporaba in vivo preskusa dermalne dražilnosti/jedkosti, da se predvidi očesna jedkost pred upoštevanjem očesnega preskusa in vivo. Za znanstveno zanesljivost in zdravje živali je koristno, da se preskušanje in vivo ne začne opravljati, dokler se niso ocenili vsi razpoložljivi podatki, pomembni za možno očesno dražilnost/jedkost snovi z analizo tehtnosti dokazov. Takšni podatki bodo vključevali dokaze iz obstoječih študij na ljudeh in/ali laboratorijskih živalih o dražilnosti/jedkosti ene ali več strukturno sorodnih snovi ali mešanic takšnih snovi, podatke, ki bodo dokazovali močno kislost ali alkalnost snovi (4)(5), in rezultate validiranih in sprejetih in vitro ali ex vivo preskusov za kožno jedkost in dražilnost (6)(6a). Mogoče je, da so se te študije opravile na podlagi analize tehtnosti dokazov ali pa iz nje sledile. Za nekatere snovi lahko takšna analiza nakaže potrebo po in vivo študijah potenciala očesne jedkosti/dražilnosti snovi. V takšnih primerih bi bilo bolje pred upoštevanjem uporabe očesnega preskusa in vivo najprej opraviti in vivo študijo kožnih učinkih snovi in jih oceniti v skladu z metodo preskušanja B.4 (7). Uporaba analize tehtnostnih dokazov in strategija zaporednega preskušanja bi morali zmanjšati potrebo po in vivo preskušanju za očesno jedkost/dražilnost snovi, za katere obstaja že dovolj dokazov iz drugih študij. Če z uporabo strategije zaporednega preskušanja ni mogoče določiti potenciala očesne jedkosti ali dražilnosti niti po opravljeni in vivo študiji dermalne jedkosti in dražilnosti, se lahko opravi invivo preskus očesne jedkosti/dražilnosti. Bolj upoštevana strategija zaporednega preskušanja, ki vključuje opravljanje validiranih invitro ali ex vivo preskusov za jedkost/dražilnost, je vključena v dodatku k tej metodi preskušanja. To strategijo so razvili in soglasno priporočili udeleženci OECD delavnice (8) in se je sprejela kot priporočena strategija preskušanja v Globalno usklajenem sistemu za razvrstitev kemijskih snovi (GHS) (9). Priporočeno se je ravnati po tej strategiji preskušanja pred opravljanjem preskušanja in vivo. Za nove snovi je priporočen postopen način preskušanja za pridobivanje znanstveno zanesljivih podatkov o jedkosti/dražilnosti snovi. Za obstoječe snovi, za katere ni dovolj podatkov o kožni in očesni jedkosti/dražilnosti, je treba uporabiti to strategijo za zapolnitev vrzeli manjkajočih podatkov. Uporabo drugačne strategije preskušanja ali postopka ali odločitev, da se ne bo uporabil način postopni preskušanja, je treba obrazložiti.

1.2 DEFINICIJE Očesna dražilnost: je nastanek sprememb na očesu, ki sledijo aplikaciji preskusne snovi na sprednjo površino očesa in ki so v celoti reverzibilne v 21 dneh aplikacije. Očesna jedkost: je nastanek poškodbe tkiva v očesu ali resnega fizičnega poslabšanja vida, ki sledi aplikaciji preskusne snovi na sprednjo površino očesa in ki ni v celoti reverzibilna v 21 dneh aplikacije.

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Snov, ki jo je treba preskusiti, se nanese v enkratnem odmerku na eno od očes eksperimentalne živali; netretirano oko služi za kontrolo. Stopnja očesne dražilnosti/jedkosti se oceni s seštevanjem lezij na očesni veznici, roženici in šarenici, v točno določenih intervalih. Drugi učinki na oko in nasprotni sistemski učinki se prav tako opišejo, da se zagotovi celovito vrednotenje učinkov. Študija mora trajati dovolj dolgo, da se oceni reverzibilnost ali ireverzibilnost učinkov. Živali, ki kažejo trajne znake hudega trpljenja in/ali bolečine v kateri koli fazi preskusa, je treba humano usmrtiti in snov skladno s tem oceniti. Kriterije za sprejem odločitve o humani usmrtitvi umirajočih in hudo trpečih živali je mogoče najti v sklicu (10).

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Priprava za preskus in vivo

1.4.1

1.4.1.1 Izbira živalske vrste Kunec beličnik je najbolj zaželena laboratorijska žival in uporabljajo se zdrave mlade odrasle živali. Za uporabo drugih sevov ali vrst je potrebna obrazložitev.

1.4.1.2 Priprava živali Obe očesi vsake eksperimentalne živali, do nadaljnjega izbrane za preskušanje, je treba pregledati v 24 urah, preden se preskušanje začne. Živali, ki kažejo očesno dražilnost, očesne napake ali že prej nastalo poškodbo roženice, se ne smejo uporabiti.

1.4.2 Preskusni postopek

1.4.2

1.4.2.1 Aplikacija preskusne snovi Preskusno snov je treba dati v mešiček veznice enega očesa vsake živali, potem ko se nežno potegne spodnja veka stran od zrkla. Veke se nato nežno držijo skupaj približno 1 sekundo, da se prepreči izguba materiala. Drugo oko, ki ostane netretirano, služi za kontrolo.

1.4.2.2 Izpiranje Oči preskusnih živali se ne smejo umivati najmanj 24 ur po vkapanju preskusne snovi, z izjemo trdnih snovi (glej oddelek 1.4.2.3.2) in v primeru takojšnjih jedkih ali dražilnih učinkov. Po 24 urah se lahko uporabi izpiranje, če se meni, da je to ustrezno. Uporaba satelitske skupine živali za raziskovanje vpliva izpiranja ni priporočena, razen če je znanstveno upravičena. Če je satelitska skupina potrebna, je treba uporabiti dva kunca. Pogoje izpiranja je treba skrbno dokumentirati, npr. čas izpiranja; sestavo in temperaturo raztopine za izpiranje; trajanje, volumen in hitrost aplikacije.

1.4.2.3 Velikost odmerka

1.4.2.3

1.4.2.3.1 Preskušanje tekočih snovi Za preskušanje tekočih snovi se uporablja odmerek 0,1 ml. Razpršila pod pritiskom se ne smejo uporabljati za vkapanje snovi neposredno v oko. Tekoče razpršilo je treba iztisniti in zbrati v posodo pred vkapanjem 0,1 ml v oko.

1.4.2.3.2 Preskušanje trdnih snovi Pri preskušanju trdnih snovi, kašnatih zmesi in zdrobljenih snovi, mora imeti uporabljena količina volumen 0,1 ml ali težo, ki ni večja kakor 100 mg. Preskusni material je treba zdrobiti v fin prah. Volumen trdnega materiala je treba izmeriti po rahlem zgoščevanju, npr. z rahlim potrkavanjem na merilno posodo. Če fiziološki mehanizmi niso odstranili iz očesa preskusne živali trdno preskusno snov na prvi časovni točki opazovanja eno uro po tretiranju, se lahko oko izplakne z raztopino vode in soli ali destilirano vodo.

1.4.2.3.3 Preskušanje razpršil Priporočeno je, da se vsa utekočinjena razpršila in razpršila pod pritiskom zberejo v posodo pred vkapanjem v oko. Izjema so snovi v posodah za razpršila pod pritiskom, ki jih ni mogoče zbrati zaradi izhlapevanja. V takšnih primerih je treba držati oko odprto in nanesti preskusno snov v oko enostavnim z vbrizgom, ki traja približno eno sekundo, z razdalje 10 cm neposredno pred očesom. Ta razdalja se lahko spreminja v odvisnosti od pritiska razpršila in njegove vsebine. Paziti je treba, da se oko ne poškoduje zaradi pritiska razpršila. V ustreznih primerih bo mogoče potrebno oceniti potencial za nastanek mehanske poškodbe očesa zaradi moči razpršila. Oceno odmerka iz razpršila je mogoče dobiti z naslednjim preskusom: snov se razprši na tehtalni papir skozi odprtino velikosti kunčjega očesa, ki je nameščena neposredno pred papir. Porast teže papirja se uporabi za približno določitev količine, razpršene v oko. Za hlapljive snovi je mogoče odmerek oceniti s tehtanjem v zbirni posodi pred in po odstranitvi preskusnega material.

1.4.2.4 Začetni preskus (In vivo preskus očesne dražilnosti/jedkosti z uporabo ene živali) Kot je opredeljeno v strategiji zaporednega preskušanja (glej Dodatek 1), je zelo priporočeno, da se preskus in vivo na začetku izvede z uporabo ene živali. Če rezultati tega preskusa kažejo, da je snov jedka ali resno dražilna za oči z uporabo opisanega postopka, se nadaljnje preskušanje za očesno dražilnost ne opravi..

1.4.2.5 Lokalni anestetiki Lokalni anestetiki se uporabljajo v odvisnosti od primera. Če analiza tehtnosti dokazov kaže, da snov lahko povzroči bolečino, ali če začetno preskušanje pokaže, da bo nastala boleča reakcija, se lokalni anestetik lahko uporabi pred vkapanjem preskusne snovi. Vrsto, koncentracijo in odmerek lokalnega anestetika je treba skrbno izbrati, da se zagotovi, da razlike pri reagiranju na preskusno snov ne bodo posledica njegove uporabe. Na podoben način je treba anestezirati kontrolno oko.

1.4.2.6 Potrditveni preskus (In vivo preskus dražilnosti z dodatnimi živalmi) Če se jedek učinek ne opazi v začetnem preskusu, je treba dražilni ali negativni odziv potrditi z uporabo do dveh dodatnih živali. Če se v začetnem preskusu opazi resen dražilen učinek, ki kaže, da je možen močan (ireverzibilen) učinek pri potrditvenem preskušanju, je priporočeno, da se potrditveni preskus izvede na zaporeden način na eni živali namesto s sočasno izpostavitvijo dveh dodatnih živali. Če druga žival razkrije jedke ali resne dražilne učinke, se preskus ne nadaljuje. Mogoče bodo potrebne dodatne živali za potrditev šibkih ali zmernih dražilnih odzivov.

1.4.2.7 Obdobje opazovanja Trajanje obdobja opazovanja mora biti dovolj dolgo, da se lahko v celoti ovrednoti obseg in reverzibilnost opaženih učinkov. Preskus je treba zaključiti ob katerem koli času, kadar kaže žival trajajoče znake hude bolečine ali trpljenja (9). Za določitev reverzibilnosti učinkov je običajno treba živali opazovati 21 dni po nanašanju preskusne snovi. Če se opazi reverzibilnost pred 21 dnem, je treba takrat preskus zaključiti.

1.4.2.7

1.4.2.7.1 Klinična opazovanja in uvrstitev očesnih reakcij v stopnje Oči je treba pregledati po 1, 24, 48 in 72 urah po aplikaciji preskusne snovi. Živali se lahko preskušajo le toliko časa, kolikor je potrebno za pridobitev dokončnih informacij. Živali, ki trajno kažejo hude bolečine in trpljenje, je treba nemudoma humano usmrtiti in v skladu s tem oceniti snov. Usmrtiti je treba živali z naslednjimi očesnimi lezijami po vkapanju: perforacija roženice ali značilno gnojenje roženice vključno s stafilomom; kri v sprednjem delu očesa; stopnja 4 motnosti roženice, ki ne popusti 48 ur; odsotnost svetlobnega refleksa (odziv šarenice stopnje 2), ki traja 72 ur; gnojenje veznične vrečke; nekroza veznične membrane ali žmurke; ali odstopanje. To pa zaradi tega, ker te lezije na splošno niso reverzibilne. Živali, pri katerih se ne razvijejo očesne lezije, se lahko usmrti ne prej kot 3 dni po instilaciji. Živali z blagimi do zmernimi lezijami je treba opazovati dokler lezije ne izginejo ali 21 dni, ko se raziskava zaključi. Opazovanja se izvajajo po 7, 14 in 21 dneh, da se določi stanje lezij ter njihova reverzibilnost ali ireverzibilnost. Pri vsaki preiskavi je treba zabeležiti stopnjo očesne reakcije (veznice, roženice in šarenice) (tabela 1). Navesti je treba tudi katere koli druge poškodbe očesa (npr. površinski keratitis/panus, obarvanost) ali neželene sistemske učinke. Za lažji pregled reakcij se lahko uporablja binokularna lupa, ročni oftalmoskop, biomikroskop ali drug ustrezen pripomoček. Po evidentiranju rezultatov opazovanja po 24 urah se lahko pregled oči nadaljuje s pomočjo fluoresceina. Določanje stopnje očesnih odzivov/reakcij je nujno subjektivno. Da bi pospešili usklajevanje pri določanju stopnje očesnih odzivov in nudili pomoč preskuševalnim laboratorijem ter vsem sodelujočim pri oblikovanju in razlagi rezultatov opazovanj, mora biti osebje, ki izvaja ta opazovanja, ustrezno usposobljeno, da obvlada uporabljeni sistem določanja stopnje.

2. PODATKI

2.

2.2 VREDNOTENJE REZULTATOV Rezultate očesne dražilnosti je treba oceniti v zvezi z vrsto in resnostjo lezij ter njihovo reverzibilnostjo ali pomanjkljivostjo reverzibilnosti. Posamezni rezultati ne predstavljajo absolutnega standarda za dražilne lastnosti materiala, ker se ocenjujejo tudi drugi učinki preskusnega materiala. Namesto tega je treba obravnavati posamezne rezultate kot referenčne vrednosti in so pomembni le, če jih potrjuje popoln opis in vrednotenje vseh opazovanj.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:

Obrazložitev za preskušanje in vivo: analiza tehtnosti dokazov prej obstoječih podatkov, vključno z rezultati strategije zaporednega preskušanja:

opis pomembnih podatkov, ki so na voljo pred preskušanjem,

podatki, pridobljeni v vsaki fazi strategije preskušanja,

opis opravljenih in vitro preskusov, vključno s podrobnimi podatki o postopkih, rezultati, dobljenimi s preskusnimi/referenčnimi snovmi,

opis dražilnih kožnih reakcij in vivo/opravljena korozijska raziskava vključno z dobljenimi rezultati,

analiza tehtnosti dokazov za opravljanje študije in vivo.

Preskusna snov:

identifikacijski podatki (npr. številka CAS; vir, čistost, znane nečistoče, številka skupine),

fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr.: pH hlapnost, topnost, stabilnost),

če gre za mešanico, sestava in relativni odstotek sestavin,

če se uporabi lokalni anestetik, identifikacija, čistost, vrsta, odmerek in možen medsebojni vpliv s preskusno snovjo.

Nosilec:

identifikacija, koncentracija (kjer je ustrezno), uporabljeni volumen,

obrazložitev upravičenosti izbire nosilca.

Preskusne živali:

uporabljena vrsta/sev, obrazložitev za uporabo živali, če to ni kunec beličnik,

starost vsake živali na začetku študije,

število živali istega spola v preskusni in kontrolni skupini (če je potrebno),

teže posameznih živali na začetku in na zaključku preskusa,

vir, pogoji bivanja, vrsta hrana, itd.

Rezultati:

opis metode, uporabljene za merjenje rezultatov dražilnosti na vsaki časovni točki opazovanja (npr. poševna ročna svetilka, biomikroskop, fluorescin),

preglednica s podatki o dražilnem/jedkem odzivu za vsako žival na vsaki časovni točki opazovanja do odstranitve vsake živali iz preskusa,

narativni opis stopnje in narave opisane dražilnosti ali korozije,

pripovedni opis stopnje in vrste opaženih lezij v očesu (npr. vaskularizacije, tvorbe krp, zlepkov, madežev),

opis neočesnih lokalnih in sistemskih nasprotnih učinkov in histopatoloških ugotovitev, če so.

Razprava o rezultatih.

3.2 RAZLAGA REZULTATOV Sklepanje o veljavnosti rezultatov študij očesne dražilnosti na laboratorijskih živalih za ljudi je veljavno le v omejeni meri. V mnogih primerih je kunec beličnik bolj občutljiv na očesne dražilne snovi ali jedke snovi kakor ljudje. Pri razlagi podatkov je treba paziti, da se izključi dražilnost, ki je posledica sekundarne infekcije.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(6a)(7)(8)(9)(10)

LITERATURA Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159–164. Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabela I RAZVRŠČANJE OČESNIH LEZIJ V STOPNJE

Roženica

Motnost: stopnja gostote (odčitati jo je treba na najbolj gostem gostejšem predelu) Ni gnojenja ali motnosti … 0 Razpršene ali obširne površine motnosti (ki niso rahla motnost običajnega leska, delci šarenice jasno vidni) 1 Prosojna površina razločna brez težav; delci šarenice rahlo zatemnjeni … 2 Spodnja površina: delci šarenica se ne razločijo; velikost zenice se komajda razloči … 3 Motna roženica: šarenica se ne razloči zaradi motnosti … 4 Največ možnih: 4 OPOMBE

Šarenica

Normalna … 0 Opazno poglobljene gube, naval krvi, otekanje, zmerna hiperemija okoli roženice; ali injekcija; šarenica reagira na svetlobo (počasna reakcija se upošteva kot učinek) … 1 Krvavitev, resno propadanje ali odsotnost reakcije na svetlobo … 2 Največ možnih: 2

Očesne veznice

Rdečina (nanaša se na veznice vek in nabrekle veznice, z izjemo roženice in šarenice) normalna … 0 Nekaj krvnih žil je hiperemičnih (injicirano) … 1 Razpršena, škrlatna barva; posamezne žile niso zlahka razločne … 2 Razširjena goveja rdečina … 3 Največ možnih: 3

Kemoterapija

Otekanje (nanaša se na veke in/ali žmurke) Normalno … 0 Nekoliko otečeno nad normalnim … 1 Očitno otečeno, z delnim zavihanjem vek navzven … 2 Otečeno, z napol zaprtimi vekami … 3 Otečeno, z več kakor napol zaprtimi vekami … 4 Največ možnih: 4

B.6 SENZIBILIZACIJA KOŽE

B.6

1. METODA

1.

1.1 UVOD Opombe: Občutljivost preskusov in njihova sposobnost, da odkrijejo morebitne senzibilizatorje človeške kože, veljata za pomembni v sistemu razvrščanja toksičnosti v zvezi z javnim zdravjem. Ni ene same preskusne metode, ki bi lahko ustrezno opredelila vse snovi s potencialom za senzibilizacijo človeške kože in bila hkrati uporabna za vse snovi. Pri izbiri preskusa je treba upoštevati dejavnike, kakršne so fizikalne lastnosti snovi, vključno z njeno sposobnostjo penetracije v kožo. Razviti sta bili dve vrsti preskusov na morskih prašičkih: pomožni preskusi, pri katerih se alergično stanje potencira z raztopitvijo ali suspendiranjem preskusne snovi v kompletnem Freundovem adjuvantu (KFA), in preskusi, pri katerih se adjuvant ne uporablja. Pomožni preskusi so običajno natančnejši pri napovedovanju verjetnega senzibilizacijskega učinka neke snovi na človeško kožo od tistih metod, ki ne uporabljajo kompletnega Freundovega adjuvanta, in so zato primernejši. Med pomožnimi preskusi se pogosto uporablja maksimizacijski preskus na morskih prašičkih (Gpmt). Čeprav se za odkrivanje potenciala snovi, da povzroči senzibilizacijo kože, lahko uporabijo mnoge druge metode, se Gpmt šteje za najboljši pomožni preskus. Za mnoge razrede kemikalij se preskusi, ki ne uporabljajo adjuvanta (med katerimi se največ uporablja Buehlerjev preskus), štejejo za manj občutljive. V nekaterih primerih lahko obstajajo utemeljeni razlogi za izbiro Buehlerjevega preskusa, ki namesto intradermalne injekcije, uporabljene v preskusu maksimizacije na morskih prašičkih, vključuje lokalno nanašanje. Če se uporabi Buehlerjev preskus, mora biti ta izbira znanstveno utemeljena. V tej metodi sta opisana maksimizacij ski preskus na morskih prašičkih in Buehlerjev preskus. Uporabijo se lahko druge metode, če so dobro validirane in znanstveno utemeljene. Če je rezultat priznanega predhodnega preskusa pozitiven, se lahko preskusna snov šteje za možnega povzročitelja senzibilizacij e in ni potrebna izvedba dodatnega preskusa na morskih prašičkih. Če pa je rezultat takšnega preskusa negativen, je treba izvesti preskus na morskih prašičkih v skladu s postopkom, opisanim v tej preskusni metodi. Glej tudi del B splošnega uvoda.

1.2 OPREDELITVE POJMOV Senzibilizacija kože: (alergijski kontaktni dermatitis) je imunološko pogojena kožna reakcija na neko snov. Pri človeku so značilne reakcije lahko srbenje, eritem, edem, papule, mehurji, gnojni mehurčki ali kombinacija teh reakcij. Pri drugih vrstah so reakcije lahko različne ter sta lahko vidna zgolj eritem in edem. Indukcijska izpostavljenost: eksperimentalna izpostavljenost subjekta preskusni snovi za povzročitev hipersenzibilnega stanja. Indukcijsko obdobje: najmanj enotedensko obdobje po indukcijski izpostavljenosti, v katerem se lahko razvije hipersenzibilno stanje. Provokacij ska izpostavljenost: eksperimentalna izpostavljenost predhodno tretiranega subjekta preskusni snovi, izvedena po indukcijskem obdobju, da bi se ugotovilo, če subjekt reagira hipersenzibilno.

1.3 REFERENČNE SNOVI Vsakih šest mesecev je treba oceniti senzibilnost in zanesljivost uporabljene eksperimentalne tehnike z uporabo snovi, za katere se ve, da povzročajo blago do zmerno senzibilizacijo kože. Če je preskus pravilno izveden, se lahko v pomožnem preskusu za blage/zmerne senzibilizatorje pričakuje vsaj 30 % reakcija in vsaj 15 % v neadjuvantnem preskusu. Prednostno se uporabljajo naslednje snovi. Števila CAS Števila Einecs Imena Einecs Splošna imena 101-86-0 202-983-3 α-heksilcinamaldehid α -heksilcinamaldehid 149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (merkaptobenzotiazol) kaptaks 94-09-7 202-303-5 benzokain nordkain Uporabijo se lahko druge kontrolne snovi, ki izpolnjujejo zgoraj navedena merila, če to upravičujejo okoliščine.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Na začetku so preskusne živali izpostavljene preskusni snovi z intradermalnimi injekcijami in/ali epidermalnim nanosom (indukcijska izpostavljenost). Po 10- do 14-dnevnem počivalnem obdobju (indukcijsko obdobje), v katerem se lahko razvije imunska reakcija, so živali izpostavljene provokacijskemu odmerku. Obseg in stopnja kožne reakcije na provokacijsko izpostavljenost pri preskusnih živalih se primerja z reakcijo, opaženo pri živalih kontrolne skupine, pri katerih med indukcijo posnemajo tretiranje in ki jih provokacij sko izpostavijo.

1.5 OPIS PRESKUSNIH METOD Če je odstranitev preskusne snovi nujna, se to doseže z uporabo vode ali ustreznega topila, ne da bi se spremenila obstoječa reakcija ali okrnil epidermis.

1.5

1.5.1 Maksimizacijski preskus na morskih prašičkih (GPMT)

1.5.1

1.5.1.1 Priprave Zdravi mladi odrasli albino morski prašički so najmanj 5 dni pred preskusom aklimatizirani na razmere v laboratoriju. Pred preskusom so živali naključno razdeljene v skupine, ki bodo tretirane. Glede na preskusno metodo, ki je uporabljena, se dlaka lahko odvzame s striženjem, britjem ali kemično depilacijo. Pri tem je treba paziti, da koža ostane nepoškodovana. Živali je treba pred začetkom in na koncu preskusa stehtati.

1.5.1.2 Preskusni pogoji

1.5.1.2

1.5.1.2.1 Preskusne živali Uporabljajo se albino morski prašički tistih sevov, ki se običajno uporabljajo v laboratorijih.

1.5.1.2.2 Število in spol Uporabijo se lahko živali moškega in/ali ženskega spola. Samice morskih prašičkov morajo biti nuliparne in ne breje. Skupina, ki bo tretirana, mora biti sestavljena iz najmanj 10, kontrolna skupina pa iz najmanj 5 živali. Če je prva skupina obsegala manj kakor 20 primerkov in druga manj kakor 10 ter ni mogoče sklepati, da je preskusna snov senzibilizator, se močno priporoča nadaljnje preskušanje na najmanj 20 preskusnih in 10 kontrolnih živali.

1.5.1.2.3 Velikost odmerkov Koncentracija preskusne snovi, uporabljene za vsako indukcijsko izpostavljenost, naj bo sistemsko dobro tolerirana in naj ustreza najvišjemu odmerku, ki lahko povzroči blago do zmerno draženje kože. Koncentracija, ki se uporabi za provokacijsko izpostavljenost, naj ustreza najvišjemu odmerku, ki ne povzroči draženja. Če je potrebno, se lahko ustrezne koncentracije določijo s pilotno študijo, izvedeno na dveh ali treh živalih. V ta namen je priporočljiva uporaba živali, ki so bile tretirane s kompletnim Freundovim adjuvantom (KFA).

1.5.1.3 Postopek

1.5.1.3

1.5.1.3.1 Indukcija Dan 0 – tretirana skupina V ramenske dele, s katerih so bile odstranjene dlake, se vbrizgajo trije pari intradermalnih injekcij volumna 0,1 ml, in sicer vsaka injekcija iz para na svoji strani sredinske črte. Injekcija 1: zmes 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina Injekcija 2: preskusna snov v ustreznem nosilcu pri izbrani koncentraciji Injekcija 3: preskusna snov pri izbrani koncentraciji, formulirana v zmesi 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina V injekciji 3 so v vodi topne snovi raztopljene v vodni fazi, preden se zmešajo s KFA. Lipotopne ali netopne snovi so suspendirane v KFA, preden so kombinirane z vodno fazo. Končna koncentracija preskusne snovi mora biti enaka tisti, ki je bila uporabljena v injekciji 2. Injekciji 1 in 2 se vbrizgata ena poleg druge in čim bliže glavi, medtem ko se injekcija 3 vbrizga proti repnemu delu preskusnega območja. Dan 0 – kontrolna skupina Na ista območja kakor pri tretiranih živali se dajo tri serije dveh intradermalnih injekcij volumna 0,1 ml. Injekcija 1: zmes 1:1 (v/v) KF A/voda ali fiziološka raztopina Injekcija 2: nerazredčeno sredstvo Injekcija 3: 50 % m/v formulacija nosilca v zmesi 1:1 (v/v) KF A/voda ali fiziološka raztopina. Dan 5–7 – tretirana skupina in kontrolna skupina Približno štiriindvajset ur pred lokalnim indukcijskim nanosom, če snov ni senzibilizator kože, je preskusno območje po striženju na kratko in/ali britju tretirano z 0,5 ml 10 % natrijevega lauril sulfata v vazelinu zato, da bi bilo povzročeno lokalno draženje. Dan 6–8 – tretirana skupina S preskusnega območja se spet odstranijo dlake. Filtrirni papir (2 × 4 cm), povsem impregniran s preskusno snovjo v ustreznem nosilcu, se nanese na preskusno območje in je z okluzivnim povojem v stiku s kožo 48 ur. Izbira nosilca mora biti utemeljena. Trde snovi so fino uprašene in inkorporirane v ustrezni nosilec. Če je primerno, se tekočine lahko nanesejo nerazredčene. Dan 6–8 – kontrolna skupina S preskusnega območja se spet odstranijo dlake. Na preskusno območje se podobno nanese zgolj nosilec, ki je z okluzivnim povojem v stiku s kožo 48 ur.

1.5.1.3.2 Provokacija Dan 20–22 – tretirana skupina in kontrolna skupina Z bokov tretiranih in kontrolnih živali se odstrani dlaka. Na en bok živali se nanese obliž ali gaza, impregnirana s preskusno snovjo in, če je primerno, se tudi na drugi bok lahko nanese obliž ali gaza, impregnirana zgolj z nosilcem. Obliži so 24 ur v stiku s kožo z okluzivnim povojem.

1.5.1.3.3 Opazovanje in ocenjevanje: tretirana skupina in kontrolna skupina Spodbuja se hitro čekiranje preskusnih in kontrolnih živali. Če je treba pojasniti rezultate, pridobljene v prvi provokaciji, je treba preučiti možnost izvedbe druge provokacije (t. j. ponovne provokacije), če je to primerno z novo kontrolno skupino, približno teden dni po prvi provokaciji. Ponovna provokacij a se lahko izvede tudi s prvotno kontrolno skupino. Vse kožne reakcije in kakršni koli nenavadni izsledki, vključno s sistemskimi reakcijami, ki so posledica indukcije in postopkov provokacij e, je treba opazovati in zabeležiti v skladu z ocenjevalno lestvico po Magnussonu/Kligmanu (glej dodatek). Za razjasnitev dvomljivih reakcij se lahko izvedejo drugi postopki, npr. histopatološka raziskava ali meritev debeline kožne gube.

približno 21 ur po odstranitvi obliža je treba provokacijsko območje očistiti ter ostriči na kratko in/ali obriti in depilirati, če je treba,

približno 3 ure pozneje (približno 48 ur od začetka provokacijskega nanosa) se opazuje in zabeleži reakcija kože glede na ocene, prikazane v dodatku,

približno 24 ur po tem opazovanju se opravi in spet zabeleži drugo opazovanje (72 ur).

1.5.2 Buehlerjev preskus

1.5.2

1.5.2.1 Priprave Zdravi mladi odrasli albino morski prašički se najmanj 5 dni pred preskusom aklimatizirajo na razmere v laboratoriju. Pred preskusom so živali naključno razdeljene v skupine, ki bodo tretirane. Glede na uporabljeno preskusno metodo se dlaka lahko odstrani s striženjem, britjem ali morda s kemično depilacijo. Pri tem je treba paziti, da koža ostane nepoškodovana. Živali je treba pred začetkom in na koncu preskusa stehtati.

1.5.2.2 Preskusni pogoji

1.5.2.2

1.5.2.2.1 Preskusne živali Uporabljajo se albino morski prašički tistih sevov, ki se običajno uporabljajo v laboratorijih.

1.5.2.2.2 Število in spol Uporabijo se lahko živali moškega in/ali ženskega spola. Samice morskih prašičkov morajo biti nuliparne in ne breje. Skupina, ki bo tretirana, mora biti sestavljena iz najmanj 20, kontrolna skupina pa iz najmanj 10 živali.

1.5.2.2.3 Velikost odmerkov Koncentracija preskusne snovi, uporabljene za vsako indukcijsko izpostavljenost, mora ustrezati najvišjemu odmerku, ki lahko povzroči blago, vendar ne čezmerno draženje kože. Koncentracija, ki se uporabi za provokacijsko izpostavljenost, mora ustrezati najvišjemu odmerku, ki še ne povzroči draženja. Če je potrebno, se lahko ustrezne koncentracije določijo s pilotno študijo, ki se opravi na dveh ali treh živalih.Pri preskusnih vodotopnih snoveh je najprimernejše, da se kot nosilec uporabi voda ali razredčena nedražilna raztopina surfaktanta. Za druge preskusne snovi so primernejše mešanice 80 % etanola in vode za indukcijo, za provokacijo pa aceton.

1.5.2.3 Postopek

1.5.2.3

1.5.2.3.1 Indukcija Dan 0 – tretirana skupina Z enega boka živali se odstrani dlaka (na kratko ostriže). Obliž, ki bo uporabljen v preskusu, je treba popolnoma impregnirati s preskusno snovjo v ustreznem nosilcu (izbira nosilca mora biti utemeljena; če je primerno, se tekočine lahko nanesejo nerazredčene). Obliž je treba nanesti na preskusno območje in ga z okluzivnim obližem ali gazo ali ustreznim povojem držati v stiku s kožo 6 ur. Obliž mora biti okluziven. Lahko se uporabi okrogla ali štirikotna vatna blazinica velikosti približno 4–6 cm2. Za zagotovitev okluzije je primerna imobilizacija z ustrezno napravo za imobilizacijo. Če se uporabi povoj, utegne biti potrebna dodatna izpostavljenost. Dan 0 – kontrolna skupina Z enega boka živali je odstranjena dlaka (na kratko ostrižena). Na preskusno območje se podobno kakor pri tretirani skupini nanese zgolj nosilec. Obliž se nanese na preskusno območje tako, da je okluzivni obliž ali gaza ali ustrezen povoj v stiku s kožo 6 ur. Če se lahko dokaže, da posnemajoča kontrolna skupina ni potrebna, se lahko uporabi netretirana kontrolna skupina. Dan 6-8 in 13–15 – tretirana in kontrolna skupina Na dan 6–8 in spet na dan 13–15 se na istem preskusnem območju (po potrebi obritem) opravi enak nanos kakor na dan 0.

1.5.2.3.2 Provokacija Dan 27–29 – tretirana in kontrolna skupina Z netretiranega boka tretiranih in kontrolnih živali se odstrani dlaka (na kratko ostrižena). Na zadnji del netretiranega boka tretiranih in kontrolnih živali se nanese okluzivni obliž ali gaza, vsebujoča ustrezno količino preskusne snovi pri najvišji koncentraciji, ki še ne povzroča draženj a. Če je primerno, se okluzivni obliž ali gaza, ki vsebuje samo nosilec, nanese tudi na sprednji netretirani bok tretiranih in tudi kontrolnih živali. Obliže ali gaze je treba z ustreznim povojem držati v stiku s kožo 6 ur.

1.5.2.3.3 Opazovanje in ocenjevanje Spodbuja se hitro čekiranje preskusnih in kontrolnih živali. Če je treba razjasniti rezultate, pridobljene v prvi provokaciji, je treba preučiti možnost za izvedbo druge provokacije (t. j. ponovne provokacije), kjer je primerno, z novo kontrolno skupino, približno teden dni po prvi provokaciji. Ponovna provokacij a se lahko izvede tudi na prvotni kontrolni skupini. Vse kožne reakcije in kakršne koli nenavadne izsledke, vključno s sistemskimi reakcijami, ki so posledica indukcije in postopkov provokacij e, je treba opazovati in zabeležiti v skladu z ocenjevalno lestvico po Magnussonu/Kligmanu (glej dodatek). Za razjasnitev dvomljivih reakcij se lahko opravijo tudi drugi postopki, npr. histopatološka raziskava ali meritev debeline kožne gube.

približno 21 ur po odstranitvi obliža je treba s provokacijskega območja odstraniti dlako,

približno 3 ure pozneje (približno 30 ur po nanosu provokacij skega obliža) se opazujejo in zabeležijo reakcije kože glede na ocene, prikazane v dodatku,

približno 24 ur po 30-urnem opazovanju (približno 54 ur po nanosu provokacijskega obliža) se kožne reakcije spet opazujejo in zabeležijo.

2. PODATKI (GPMT in Buehlerjev preskus) Vse podatke je treba povzeti v obliki tabele, ki za vsako posamezno žival prikazuje kožne reakcije pri posameznih opazovanjih.

3. POROČANJE (GPMT in Buehlerjev preskus) Če je bila pred preskusom na morskem prašičku opravljena izločilna analiza, se mora predložiti opis ali napotitev k preskusu (npr. lokalna analiza limfnih vozlov (LLNA), preskus otekanja ušesa pri miših (MEST)), vključno s podrobnimi podatki o postopku, skupaj z rezultati, ki so bili pridobljeni s preskusnimi in referenčnimi snovmi.

3. Poročilo o preskusu (GPMT in Buehlerjev preskus)

Če je mogoče, poročilo o preskusu vključuje naslednje informacije:

Poskusne živali:

sev uporabljenih morskih prašičkov,

število, starost in spol živali,

izvor, nastanitveni pogoji, hrana itd.,

teža vsake živali na začetku preskusa.

Preskusni pogoji:

tehnika priprave območja nanosa obliža,

podrobnosti o uporabljenih materialih ter tehniki priprave in nanosa obliža,

rezultat pilotne študije z izsledki o indukcijskih in provokacijskih koncentracijah, ki bodo uporabljene v preskusu,

podrobnosti o pripravi preskusne snovi, nanosu in odstranitvi,

utemeljitev izbire uporabljenega nosilca,

koncentracije nosilca in preskusne snovi, uporabljene za indukcijsko in provokacijsko izpostavljenost, ter skupna količina snovi, ki je bila nanesena za indukcijo in provokacijo.

Rezultati:

povzetek rezultatov zadnjega pregleda občutljivosti in zanesljivosti (glej 1.3), vključno z informacijami o snovi, koncentraciji in uporabljenem nosilcu,

opazovanja, opravljena na posameznih živalih, vključno s sistemom ocenjevanja,

podroben opis narave in stopnje opaženih učinkov,

kakršni koli histopatološki izsledki.

Razprava o rezultatih.

Zaključki.

4. SKLICEVANJE Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD 406.

B.7 TOKSIČNOST PRI PONAVLJAJOČIH SE ODMERKIH (28 DNI) PO ORALNI POTI

B.7

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej del B splošnega uvoda.

1.2 OPREDELITVE POJMOV Glej del B splošnega uvoda.

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Preskusna snov se daje v zaporednih dnevnih odmerkih oralno več skupinam poskusnih živali, in sicer ena velikost odmerka na skupino za obdobje 28 dni. V obdobju dajanja se živali vsak dan pozorno opazujejo zaradi znakov toksičnosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi nekropsija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se opravi nekropsija. Metoda daje večji poudarek nevrološkim učinkom kakor specifičnim ocenjevalnim parametrom in poudarja potrebo po pozornem kliničnem opazovanju živali za pridobitev čim več informacij. Cilj te metode je opredeliti kemikalije z nevrotoksičnim potencialom, kar lahko zahteva dodatno podrobno raziskavo. Poleg tega lahko metoda pokaže imunološke učinke in toksičnost razmnoževalnih organov.

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Priprave Zdrave mlade odrasle živali so naključno razdeljene v kontrolno skupino in skupino, ki bo tretirana. Kletke je treba razporediti tako, da se kar najbolj zmanjšajo morebitni učinki, ki nastanejo zaradi razporeditve kletk. Živali se jasno identificirajo in nastanijo v kletkah vsaj 5 dni pred začetkom študije, tako da se lahko prilagodijo razmeram v laboratoriju. Preskusna snov se vnese z gastrično sondo ali s hrano ali pitno vodo. Metoda oralnega vnosa je odvisna od namena študije in fizikalnih/kemijskih lastnosti snovi. Po potrebi se preskusna snov raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Priporoča se, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato pa uporabe raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem olju), kot tretja izbira pa uporaba možne raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti toksične lastnosti nosilca znane. Treba je določiti stabilnost preskusne snovi v nosilcu.

1.4.2 Preskusni pogoji

1.4.2

1.4.2.1 Preskusne živali Najprimernejša vrsta glodalcev so podgane, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodalcev. Uporabiti je treba mlade, zdrave odrasle živali sevov, ki se običajno uporabljajo v laboratorijih. Samice morajo biti nuliparne in ne breje. Odmerke je treba začeti vnašati čim prej po zaključku laktacije in vsekakor preden živali dopolnijo devet tednov. Na začetku študije mora biti sprememba teže živali minimalna in ne sme presegati ± 20 % povprečne teže za vsak spol. Če je bila pred dolgoročno študijo izvedena predhodna študija s ponavljajočim se odmerkom po oralni poti, je po možnosti v obeh študijah treba uporabiti živali istega seva in istega izvora.

1.4.2.2 Število in spol Za vsako stopnjo odmerka se mora uporabiti najmanj 10 živali (pet samic in pet samcev). Če se načrtujejo usmrtitve živali med študijo, je treba skupno število povečati za število živali, predvidenih za usmrtitev pred zaključkom študije. Poleg tega se satelitska skupina 10 živali (pet živali na spol) lahko tretira z veliko količino odmerka 28 dni in se naslednjih 14 dni opazuje za ugotavljanje reverzibilnosti, trajanja učinka ali zapoznelega nastopa toksičnih učinkov. Prav tako se uporabi satelitska skupina 10 kontrolnih živali (pet živali na spol).

1.4.2.3 Velikost odmerkov Običajno je treba uporabiti najmanj tri preskusne skupine in eno kontrolno skupino. Razen pri tretiranju s preskusno snovjo je treba z živalmi v kontrolni skupini ravnati enako kakor z živalmi preskusne skupine. Če je pri vnosu preskusne snovi uporabljen nosilec, naj enak nosilec v največji uporabljeni količini prejme tudi kontrolna skupina. Če se na podlagi ocene drugih podatkov ne pričakujejo nobeni učinki pri odmerku 1000 mg/kg telesne teže/dan, se lahko opravi mejni preskus. Če ne obstajajo ustrezni podatki, se lahko opravi študija ugotavljanja količinske meje, s katero se določijo odmerki za uporabo. Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse obstoječe podatke o toksičnosti in (toksiko-) kinetiki, ki so na razpolago za preskusno snov ali povezane snovi. Izbrati je treba največjo velikost odmerka, ki povzroči toksične učinke, vendar ne smrti ali hudega trpljenja. Nato je treba izbrati padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se določita vsak odziv, ki je pogojen z odmerkom, in koncentracija brez opaznih negativnih vplivov (NOAEL). Za določanje padajočih velikosti odmerkov je pogosto najbolje uporabiti dva- do štirikratne intervale, pogosto pa je primernejše, da se namesto zelo velikih intervalov (npr. več kakor faktor 10) med odmerki doda četrta preskusna skupina. Če se snovi dajejo s hrano ali pitno vodo, je pomembno zagotoviti, da količine potrebne preskusne snovi ne spremenijo normalnega prehranjevalnega ali vodnega ravnotežja. Če se preskusna snov daje s hrano, se lahko uporabi bodisi stalna koncentracija v hrani (ppm) bodisi stalna velikost odmerka glede na telesno težo živali; opredeliti se mora uporabljena alternativa. Če je bila snov dana z gastrično sondo, mora biti odmerek vnesen vsak dan ob približno istem času in prilagojen tako, da se ohrani stalna velikost odmerka glede na telesno težo živali. Če je bila pred dolgoročno študijo izvedena predhodna oralna študija s ponavljajočim se odmerkom, je treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano.

1.4.2.4 Mejni preskus Če preskus, izveden v skladu z opisanimi postopki za to študijo in pri velikosti odmerka, ki znaša najmanj 1000 mg/kg telesne teže/dan, ali pri vnosu s hrano ali vodo pri enakovredni koncentraciji hrane ali pitne vode (na podlagi telesne teže), ne ustvari opaznih toksičnih učinkov in če se na podlagi podatkov o strukturno povezanih snoveh toksičnost ne pričakuje, se popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov morda ne šteje za potrebno. Mejni preskus se ne uporabi samo, če človeška izpostavljenost kaže na potrebo po uporabi večjega odmerka.

1.4.2.5 Obdobje opazovanja Obdobje opazovanja naj traja 28 dni. Živali iz satelitske skupine, ki so bile izbrane za dodatna opazovanja, naj bodo nadzorovane najmanj nadaljnjih 14 dni brez kakršnega koli tretiranja, da bi odkrili zapozneli pojav, obstojnost ali izginotje toksičnih učinkov.

1.4.3 Postopek Preskusna snov se živalim daje dnevno, sedem dni na teden za obdobje 28 dni; uporaba petdnevnega režima odmerjanja na teden mora biti ustrezno utemeljena. Če se preskusna snov živalim intubira, je to treba izvesti z enkratnim odmerkom z gastrično sondo ali ustrezno intubacijsko cevko. Največji volumen tekočine, ki se lahko vnese naenkrat, je odvisen od velikosti poskusne živali. Volumen ne sme presegati 1 ml/100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri dražilnih ali korozivnih snoveh, ki pri višjih koncentracijah običajno povzročijo jasne poslabšane učinke, je treba spremenljivost preskusnih volumnov kar najbolj zmanjšati s prilagoditvijo koncentracije, da bi se tako ohranil stalni volumen pri vseh velikostih odmerkov.

1.4.3

1.4.3.1 Splošna opazovanja Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Zabeležiti je treba podatke o zdravstvenem stanju živali. Živali je treba vsaj dvakrat na dan opazovati za določitev obolevnosti in smrtnosti. Umirajoče živali ali živali, ki kažejo znake hudega trpljenja ali bolečine, je treba nemudoma po ugotovitvi tega izključiti iz študije, jih humano usmrtiti in opraviti nekropsijo. Enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem subjektu) in nato najmanj enkrat na teden je treba opraviti podrobna klinična opazovanja vseh živali. V ta namen je treba živali vzeti iz kletk, v katerih bivajo, jih zbrati v standardnem ograjenem prostoru in po možnosti vsakokrat opazovati ob istem času. Opazovanja je treba pazljivo zabeležiti, po možnosti z uporabo sistemov točkovanja, ki jih jasno določi zadevni preskusni laboratorij. Storiti je treba vse potrebno za kar največje zmanjšanje spreminjanja preskusnih pogojev in za zagotovitev, da opazovanja po možnosti opravijo opazovalci, ki s tretiranjem niso seznanjeni. Pozornost je med drugim treba posvetiti vsem spremembam na koži, dlaki, očeh, na sluznici, pojavu sekrecije in ekskrecije in posamezne aktivnosti (npr. solzenje, piloerekcija, velikost zenice, nenavaden ritem dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe obnašanja, drže in odziva na tretiranje, pa tudi pojav kloničnih ali toničnih krčev, stereotipov (npr. čezmerno negovanje, nenehno vrtenje v krogih) ali nenavadnega obnašanja (npr. samopohaba, vzvratna hoja). V četrtem tednu izpostavljenosti je treba nadaljevati ocenjevanje senzorične reaktivnosti na različne vrste dražljajev (npr. slušni, vizualni in proprioceptivni dražljaji), moči prijema in motorične aktivnosti. Dodatne podrobnosti o postopkih, ki se lahko uporabijo, so navedene v literaturi (glej del B splošnega uvoda). Funkcionalna opazovanja, predvidena za četrti teden izpostavljenosti, se lahko izpustijo, če je študija izvedena kot predhodna za nadaljnjo študijo subkroničnosti (90 dni). V tem primeru je treba funkcionalna opazovanja vključiti v to dopolnilno študijo. Po drugi strani pa se lahko podatki o funkcionalnih opazovanjih, pridobljeni med študijo s ponavljajočimi se odmerki, izkažejo za koristne pri izbiranju velikosti odmerkov za nadaljnjo študijo subkroničnosti. Izjemoma se lahko funkcionalna opazovanja opustijo tudi za skupine, ki sicer kažejo znake toksičnosti v takšnem obsegu, da bi to lahko močno oviralo izvedbo funkcionalnega preskusa.

1.4.3.2 Telesna teža in poraba hrane/vode Vse živali je treba stehtati najmanj enkrat na teden. Vsaj enkrat na teden je treba izmeriti obseg porabe hrane in vode. Če se preskusna snov daje s pitno vodo, je treba najmanj enkrat na teden izmeriti količino porabe vode.

1.4.3.3 Hematologija Na koncu preskusnega obdobja je treba opraviti naslednje hematološke preiskave: hematokrit, koncentracija hemoglobina, število eritrocitov, skupno število levkocitov in diferencialna slika levkocitov, število krvnih ploščic in čas/zmožnost koagulacije. Vzorce krvi je treba odvzeti iz določenega območja neposredno pred ali med postopkom usmrtitve živali in jih pod ustreznimi pogoji shraniti.

1.4.3.4 Klinična biokemija Klinične biokemične preiskave, katerih cilj je preučevanje glavnih toksičnih učinkov na tkiva ter zlasti ledvice in jetra, je treba opraviti na vzorcih krvi, ki so bili živalim odvzeti neposredno pred ali med postopkom njihove usmrtitve (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali usmrčene med preskusom). Priporoča se, da se živali pred odvzemom vzorcev krvi čez noč postijo. Preiskave plazme ali seruma morajo vključevati natrij, kalij, glukozo, skupni holesterol, ureo, kreatinin, skupne beljakovine in albumin, najmanj dva encima, ki sta kazalca hepatoceličnih učinkov (kot alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama-glutamil transpeptidaza in sorbitolna dehidrogenaza). Meritve dodatnih encimov (hepatskega ali drugega izvora) in žolčnih kislin včasih lahko dajo koristne informacije. Po izbiri se lahko v zadnjem tednu študije izvedejo naslednje določene preiskave urina z uporabo časovno določenega zbiranja volumna urina: videz, volumen, ozmotsko neravnovesje ali specifična teža, pH, beljakovine, glukoza in kri/krvne celice. Poleg tega se priporoča izvedba študij za preiskovanje serumskih znakov splošnih poškodb tkiva. Druge določitve, ki morajo biti izvedene, če obstaja možnost ali sum, da bodo znane lastnosti preskusne snovi vplivale na povezane metabolične profile, vključujejo kalcij, fosfat, trigliceride, posebne hormone, methemoglobin in holinesterazo. Le-ti morajo biti določeni za nekatere razrede snovi ali za posamezne primere. Na splošno je najprimernejši fleksibilni prijem, ki je odvisen od vrste in opaženega in/ali pričakovanega učinka preskusne snovi. Če so osnovni zgodovinski podatki neustrezni, je primerno, da se hematološki in klinični biokemični parametri določijo pred začetkom dajanja odmerkov.

1.4.3.5 Makroskopska nekropsija Na vseh živalih iz študije se opravi kompletna makroskopska nekropsija, ki vključuje skrbno preiskavo zunanje telesne površine, vseh odprtin, lobanjske, torakalne in trebušne votline ter njihove vsebine. Jetra, ledvice, nadledvične žleze, moda, epididimide, priželjc, vranico, možgane in srce vseh živali je treba ustrezno odstraniti s sosednjih tkiv in čim prej stehtati, da se ognemo dehidraciji. Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo: vsa tkiva z makroskopskimi poškodbami, možgane (reprezentativne regije, ki vključujejo velike možgane, male možgane in most), hrbtenjačo, trebuh, tanko in debelo črevo (vključno s Peyerjevim skupkom limfnega tkiva), jetra, ledvice, nadledvične žleze, vranico, srce, priželjc, žlezo ščitnico, trahejo in pljuča (shranjeni z napihavanjem fiksativa in nato s potopitvijo), spolne žleze, dodatne spolne organe (npr. maternico, prostato), sečni mehur, limfne vozle (po možnosti en limfni vozel na poti vnosa in en limfni vozel, ki je oddaljen od poti vnosa in pokriva sistemske učinke), periferno živčevje (ishiatični ali tibialni živec), po možnosti v neposredni bližini mišice, in del kostnega mozga (ali kot alternativa, sveže prepariran aspirat kostnega mozga). Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnega tkiva. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki se štejejo za verjetne ciljne organe glede na znane lastnosti preskusne snovi.

1.4.3.6 Histopatološka preiskava Celotno histopatološko preiskavo je treba opraviti na shranjenih organih in tkivih vseh živali v kontrolni skupini ter živalih v skupini, tretirani z visokim odmerkom. Te preiskave je treba razširiti na živali iz skupin, tretiranih z različnimi odmerki, če se v skupini, tretirani z visokim odmerkom, opazijo spremembe, ki jih je povzročilo tretiranje. Preiščejo se vse makroskopske poškodbe. Če se uporabi satelitska skupina, je treba izvesti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so bili v tretiranih skupinah opaženi učinki.

2. PODATKI Priskrbeti je treba podatke za vsako posamezno žival. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v obliki tabele, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene mrtve ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake toksičnosti, opis opaženih toksičnih učinkov, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh toksičnih učinkov, število živali, ki kažejo poškodbe, vrsto poškodb in odstotek živali, ki kažejo posamezno vrsto poškodb. Če je mogoče, je številčne rezultate treba ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode je treba izbrati med izdelavo študije.

3. POROČANJE

3. POROČILO O PRESKUSU

Če je mogoče, poročilo o preskusu vključuje naslednje informacije:

Poskusne živali:

uporabljena vrsta/sev,

število, starost in spol živali,

vir, pogoji bivanja, prehrana itn.,

teža vsake živali na začetku preskusa, v tedenskih intervalih v naslednjem obdobju in ob zaključku preskusa.

Preskusni pogoji:

utemeljitev izbire uporabljenega nosilca, če to ni voda,

utemeljitev izbire velikosti odmerka,

podrobni podatki o sestavi preskusne snovi in pripravi hrane, doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka,

podrobni podatki o dajanju preskusne snovi,

če je primerno, sprememba koncentracije snovi, vnesene s hrano ali vodo (ppm), v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan),

podrobni podatki o kvaliteti hrane in vode.

Rezultati:

telesna teža/spremembe telesne teže,

poraba hrane in, če je primerno, poraba vode,

podatki o toksičnem odzivu po spolu in velikosti odmerka, vključno z znaki toksičnosti,

narava, resnost in trajanje kliničnih opazovanj (reverzibilnih ali nereverzibilnih),

ocena senzorične aktivnosti, moči prijema in motorične aktivnosti,

hematološki preskusi z ustreznimi referenčnimi vrednostmi,

klinični biokemični preskusi z ustreznimi referenčnimi vrednostmi,

telesna teža ob usmrtitvi in podatki o teži organov,

izsledki nekropsije,

podroben opis vseh histopatoloških izsledkov,

podatki o absorpciji, če so na razpolago,

statistična obdelava rezultatov, kjer je to primerno.

Razprava o rezultatih.

Zaključki.

4. SKLICEVANJE Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD 407.

B.8 STRUPENOST (PRI VDIHAVANJU) PRI PONAVLJAJOČEM SE ODMERKU (28 DNI)

B.8

1. METODA

1.

1.2 OPREDELITVE Glej Splošni uvod dela B (B).

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Več skupin poskusnih živalih se 28 dni vsak dan za določeno obdobje izpostavi preskusni snovi v stopnjevanih koncentracijah, pri čemer se uporabi ena koncentracija na skupino. Če se za lažjo pripravo primerne koncentracije preskusne snovi v zraku uporabi nosilec, je treba uporabiti tudi kontrolno skupino za nosilec. V času dajanja odmerkov se živali vsakodnevno opazujejo zaradi odkrivanja znakov strupenosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa tudi na preživelih živalih.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6

1.6.1 Priprave Najmanj pet dni pred začetkom preskusa se živali nastanijo v preskusnih pogojih nastanitve in hranjenja. Pred preskusom se zdrave mlade živali naključno izberejo in dodelijo potrebnemu številu skupin. Kadar je potrebno, se preskusni snovi lahko doda ustrezni nosilec za lažjo pripravo primerne koncentracije snovi v zraku. Če se za lažje odmerjanje uporabi nosilec ali drugi dodatki, mora biti dokazano, da ne povzročajo strupenih učinkov. Če je primerno, se lahko uporabijo podatki preteklih študij.

1.6.2 Preskusni pogoji

1.6.2

1.6.2.1 Poskusne živali Razen v primeru kontraindikacij, je podgana najprimernejša vrsta. Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve mladih zdravih živali. Ob začetku študije območje nihanja mase uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % ustrezne srednje vrednosti.

1.6.2.2 Število in spol Za vsako preskusno skupino je treba uporabiti najmanj 10 živali (pet samic in pet samcev). Samice morajo biti nulipare in nebreje. Če se načrtujejo žrtvovanja med študijo, je treba število povečati za število živali, predvidenih za žrtvovanje pred zaključkom študije. Poleg tega se lahko satelitska skupina 10 živali (pet živali na spol) 28 dni tretira z odmerkom velike koncentracije in se naslednjih 14 dni opazuje za ugotavljanje povratnosti, obstojnosti ali zapoznelega pojava strupenih učinkov. Uporabi se tudi satelitska skupina 10 kontrolnih živali (pet živali na spol).

1.6.2.3 Koncentracija izpostavljenosti Potrebne so najmanj tri koncentracije z eno kontrolo ali, če se uporabi nosilec, s kontrolo nosilca (ki ustreza koncentraciji nosilca pri največji velikosti odmerka). Razen tretiranja s preskusno snovjo, je treba z živalmi kontrolne skupine ravnati na enak način kakor z živalmi preskusnih skupin. Največja koncentracija naj povzroči strupene učinke, vendar nič ali malo smrtnih primerov. Najmanjša koncentracija ne sme povzročiti nobenih znakov strupenosti. Če obstaja uporabna ocena izpostavljenosti človeka, jo mora najmanjša koncentracija presegati. V idealnih razmerah bi vmesna koncentracija morala povzročiti minimalne opazne strupene učinke. Če se uporabi več kot ena vmesna koncentracija, morajo biti intervali med koncentracijami taki, da povzročijo stopnjevanje strupenih učinkov. V skupinah, tretiranih z majhno in srednjo koncentracijo, ter v kontrolnih skupinah naj bi bila pogostnost smrtnih primerov majhna, da se omogoči smiselno ovrednotenje rezultatov.

1.6.2.4 Čas izpostavljenosti Dnevna izpostavljenost naj bi trajala šest ur, vendar bodo za izpolnitev posebnih zahtev morda potrebna drugačna obdobja.

1.6.2.5 Oprema Preskušanje na živalih se izvaja z opremo za vdihavanje, ki je zasnovana tako, da vzdržuje dinamični pretok zraka z najmanj 12 zamenjavami zraka na uro, da se zagotovita zadostna vsebnost kisika in enakomerna porazdelitev izpostavitvenega ozračja. Če se uporabi komora, mora biti zasnovana tako, da preskusne živali niso prenatrpane in so kar najbolj izpostavljene preskusni snovi z vdihavanjem. Splošno pravilo zagotavljanja stabilnosti ozračja v komori je, da skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % volumna preskusne komore. Lahko se uporabi nazooralno izpostavljanje, izpostavljanje samo glave ali izpostavljanje celega telesa v posamični komori; prva dva načina kar se da zmanjšata sprejem preskusne snovi po drugih poteh.

1.6.2.6 Obdobje opazovanja Poskusne živali je treba med celotnim obdobjem tretiranja in okrevanja dnevno opazovati, ali kažejo znake strupenosti. Zapisati je treba čas smrti in čas pojava ter izginotja znakov strupenosti.

1.6.3 Postopek Živali se 28 dni, pet do sedem dni na teden dnevno izpostavljajo preskusni snovi. Živali katere koli satelitske skupine, predvidene za nadaljnja opazovanja, je treba pustiti nadaljnjih 14 dni brez tretiranja, da se ugotovi povratnost ali obstojnost strupenih učinkov. Med preskusom je treba vzdrževati temperaturo 22 ± 3 oC. V idealnih razmerah bi bilo treba relativno vlažnost vzdrževati med 30 in 70 %, vendar to v nekaterih primerih (npr. preskusi z nekaterimi aerosoli) ni izvedljivo. Ohranjanje rahlega podtlaka v komori (< 5 mm vode) bo preprečilo uhajanje preskusne snovi v okolico. Med izpostavljenostjo se živalim ne dajeta ne hrana ne voda. Uporabiti je treba dinamični inhalacijski sistem z ustreznim analitskim sistemom za nadzorovanje koncentracije. Za določitev primernih koncentracij izpostavljenosti se priporoča izvedba poskusnega preskusa. Pretok zraka je treba prilagoditi tako, da se zagotovijo homogeni pogoji v celi komori za izpostavljanje. Sistem mora zagotoviti, da se čim hitreje dosežejo stabilni izpostavitveni pogoji. Meriti ali spremljati je treba: Med izpostavitvijo in po njej se izvaja sistematično opazovanje in zapisovanje opažanj; za vsako žival je treba voditi svojo evidenco. Vse živali je treba dnevno opazovati in zapisati znake strupenosti, vključno s časom njihovega pojava, stopnjo in trajanjem. Opazovati je treba spremembe na koži in kožuhu, očeh, sluznici, dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju, somatomotorični aktivnosti in vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba izmeriti maso živali. Priporoča se tudi tedenska meritev porabe hrane. Živali je treba redno opazovati, da se prepreči izguba živali zaradi kanibalizma, avtolize tkiv ali napak pri dajanju v kletke. Ob koncu študije se na vseh preživelih živalih nesatelitskih tretiranih skupin opravi obdukcija. Umirajoče živali in živali v hudem stresu ali s hudimi bolečinami se takoj ob odkritju odstranijo iz kletk ter humano usmrtijo in obducirajo. Ob koncu preskusa se na vseh živalih, vključno z živalmi kontrolne skupine, opravijo naslednje preiskave: Druge določitve, ki so lahko potrebne za izdelavo ustrezne ocene strupenosti, vključujejo kalcij, fosfor, klorid, natrij, kalij, postno glukozo, lipide, hormone, ravnovesje kislina/baza, methemoglobin, aktivnost holinesteraze. Kadar je potrebno, se za razširitev raziskave opaženih strupenih učinkov lahko uporabijo dodatne klinične biokemijske preiskave.

1.6.3

(a) pretok zraka (neprekinjeno);

(b) dejansko koncentracijo preskusne snovi, merjeno v območju dihanja. V obdobju dnevne izpostavitve se koncentracija ne sme spreminjati za več kot ± 15 % srednje vrednosti. Vendar je lahko pri nekaterih aerosolih taka stopnja nadzora nedosegljiva in je zato sprejemljiv večji razpon. Ves čas študije morajo biti koncentracije od dneva do dneva kolikor je mogoče konstantne. Pri aerosolih je treba izvesti najmanj eno analizo velikosti delcev na preskusno skupino na teden;

(i) hematološke preiskave, ki vključujejo najmanj določitev hematokrita, koncentracije hemoglobina, števila eritrocitov, skupnega in diferencialnega števila levkocitov in zmožnosti koagulacije;

(ii) klinične biokemijske preiskave krvi, ki vključujejo določanje najmanj enega parametra delovanja jeter in ledvic: serumska alanin-aminotransferaza (prej poznana kot glutamat-piruvat-transaminaza), serumska aspartat-aminotransferaza (prej poznana kot glutamat-oksaloacetat-transaminaza), sečninski dušik, albumin, kreatinin v krvi, skupni bilirubin in skupne serumske beljakovine;

1.6.3.1 Makroskopska obdukcija Na vseh živalih iz študije je treba izvesti popolno makroskopsko obdukcijo. Najmanj jetra, ledvice, nadledvične žleze, pljuča in moda je treba stehtati mokre čim prej po disekciji, da se prepreči njihova dehidracija. Organe in tkiva (dihala, jetra, ledvice, vranico, moda, nadledvične žleze, srce in vse organe, ki kažejo makroskopske poškodbe ali spremembe v velikosti) je treba shraniti v ustreznem mediju za morebitno histopatološko preiskavo v prihodnosti. Pljuča je treba odstraniti nepoškodovana, jih stehtati in tretirati z ustreznim fiksativom, da se ohrani njihova struktura.

1.6.3.2 Histopatološka preiskava Pri skupini, tretirani z veliko koncentracijo, in kontrolni(-h) skupini(-ah) je treba histopatološko preiskavo opraviti na shranjenih organih in tkivih. Pri vseh skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, je treba preiskati organe in tkiva, ki v skupini z največjim odmerkom kažejo poškodbe, ki se lahko pripišejo preskusni snovi. Živali vseh satelitskih skupin je treba histološko preiskati s posebnim poudarkom na tistih organih in tkivih, pri katerih so bili pri drugih tretiranih skupinah ugotovljeni strupeni učinki.

2. PODATKI Podatke je treba povzeti v tabeli, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa in število živali, ki kažejo posamezno vrsto poškodbe. Vse opažene rezultate je treba ovrednotiti z ustrezno statistično metodo. Uporabi se lahko katera koli priznana statistična metoda.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, prehrana itd.,

preskusni pogoji: Opis aparature za izpostavljanje, vključno z načrtom, vrsto, merami, virom zraka, sistemom za proizvajanje aerosolov, metodo klimatiziranja zraka, obdelavo izpušnega zraka in metodo namestitve živali v preskusni komori, če je bila uporabljena. Opisati je treba opremo za merjenje temperature, vlažnosti in, kadar je primerno, stabilnosti koncentracije ali porazdelitve velikosti delcev aerosolov. Podatki o izpostavitvi: Ti morajo biti zbrani v tabeli in prikazani s srednjimi vrednostmi in mero variabilnosti (npr. standardna deviacija) ter po možnosti vključevati:

3.1 pt_2

(a) pretok zraka skozi opremo za vdihavanje;

(b) temperaturo in vlažnost zraka;

(d) vrsto nosilca, če je bil uporabljen;

(e) dejanske koncentracij e v preskusnem območju dihanja;

(f) srednji aerodinamični masni premer (MMAD) in geometrijska standardna deviacija (GSD);

podatki o odzivu strupenosti po spolu in koncentraciji,

čas smrti med študijo oziroma ali so živali preživele do zaključka,

opis strupenih ali drugih učinkov; velikost odmerka brez učinkov,

čas odkritja vsakega nenormalnega znaka in njegov nadaljnji razvoj,

podatki o hrani in telesni masi,

opravljeni hematološki preskusi in rezultati,

opravljeni klinični biokemijski preskusi in rezultati,

izsledki obdukcije,

podroben opis vseh histopatoloških izsledkov,

statistična obdelava rezultatov, kadar je možno,

razprava o rezultatih,

razlaga rezultatov.

3.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B (D).

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B (E).

B.9 STRUPENOST (V STIKU S KOŽO) PRI PONAVLJAJOČEM SE ODMERKU (28 DNI)

B.9

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B (A).

1.2 OPREDELITVE Glej Splošni uvod dela B (B).

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Preskusna snov se 28 dni dnevno nanaša na kožo v stopnjevanih odmerkih več skupinam poskusnih živali, in sicer en odmerek na skupino. V obdobju dajanja odmerkov se živali vsakodnevno pozorno opazujejo zaradi odkrivanja znakov strupenosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa tudi na preživelih živalih.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6

1.6.1 Priprave Najmanj pet dni pred začetkom preskusa se živali nastanijo v preskusnih pogojih nastanitve in hranjenja. Pred preskusom se zdrave mlade živali naključno izberejo in dodelijo tretiranim in kontrolnim skupinam. Tik pred začetkom preskusa se preskusnim živalim ostriže dlaka s hrbtnega dela trupa. Dlaka se lahko tudi obrije, vendar je treba to opraviti 24 ur pred preskusom. Striženje ali britje je običajno treba ponavljati približno v tedenskih intervalih. Med striženjem ali britjem je treba paziti, da se koža ne odrgne. Za nanos preskusne snovi je treba pripraviti najmanj 10 % telesne površine. Pri določanju površine pripravljenega dela in velikosti nanosa je treba upoštevati maso živali. Pri preskušanju trdnih snovi, ki se po potrebi lahko uprašijo, je treba preskusno snov dovolj navlažiti z vodo ali, kadar je potrebno, ustreznim nosilcem, da se zagotovi dober stik s kožo. Tekoče preskusne snovi se običajno uporabljajo nerazredčene. Nanosi se opravljajo dnevno, pet do sedem dni na teden.

1.6.2 Preskusni pogoji

1.6.2

1.6.2.1 Poskusne živali Uporabijo se lahko odrasle podgane, kunci ali morski prašički. Uporabijo se lahko tudi druge vrste, vendar je treba njihovo uporabo utemeljiti. Ob začetku študije območje nihanja mase uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % ustrezne srednje vrednosti.

1.6.2.2 Število in spol Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj 10 živali (pet samic in pet samcev) z zdravo kožo. Samice morajo biti nulipare in nebreje. Če se načrtujejo žrtvovanja med študijo, je treba število povečati za število živali, predvidenih za žrtvovanje pred zaključkom študije. Poleg tega se lahko satelitska skupina 10 živali (pet živali na spol) 28 dni tretira z velikim odmerkom in se naslednjih 14 dni opazuje za ugotavljanje reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega pojava strupenih učinkov. Uporabi se tudi satelitska skupina 10 kontrolnih živali (pet živali na spol).

1.6.2.3 Velikost odmerkov Potrebne so najmanj tri velikosti odmerkov z eno kontrolo ali, če se uporabi nosilec, s kontrolo nosilca. Obdobje izpostavljenosti mora trajati najmanj šest ur dnevno. Preskusno snov je treba nanašati vsak dan ob istem času, nanose pa je treba v rednih časovnih presledkih (enkrat ali dvakrat tedensko) prilagoditi tako, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali. Razen tretiranja s preskusno snovjo, je treba z živalmi kontrolne skupine ravnati na enak način kakor z živalmi preskusne skupine. Če se za lažje odmerjanje uporabi nosilec, se živalim skupine za kontrolo nosilca odmerki dajejo na enak način kakor živalim tretirane skupine in prejeti morajo enako količino, kakor živali skupine, tretirane z največjim odmerkom. Največji odmerek naj povzroči strupene učinke, vendar nič ali malo smrtnih primerov. Najmanjši odmerek ne sme povzročiti nobenih znakov strupenosti. Če obstaja uporabna ocena izpostavljenosti človeka, jo mora najmanjši odmerek presegati. V idealnih razmerah bi vmesna velikost odmerka morala povzročiti minimalne opazne strupene učinke. Če se uporabi več kot en vmesni odmerek, morajo biti intervali med velikostmi odmerkov taki, da povzročijo stopnjevanje strupenih učinkov. V skupinah, tretiranih z majhnimi in vmesnimi odmerki, ter v kontrolni skupini mora biti pogostnost smrtnih primerov majhna, da se omogoči smiselno ovrednotenje rezultatov. Če nanos preskusne snovi povzroči hudo draženje kože, je treba koncentracije zmanjšati, zaradi česar se lahko zmanjšajo ali ne pokažejo drugi strupeni učinki pri velikih odmerkih. Če se poleg tega koža hudo poškoduje, je morda treba prekiniti študijo in začeti novo študijo z manjšimi koncentracijami.

1.6.2.4 Mejni preskus Če pri predhodni študiji z odmerkom 1000 mg/kg, ali z večjim odmerkom, ki ustreza možni izpostavljenosti človeka, kadar je ta znana, ni opaznih strupenih učinkov, nadaljnje preskušanje morda ne bo potrebno.

1.6.2.5 Obdobje opazovanja Poskusne živali je treba dnevno opazovati, ali kažejo znake strupenosti. Zapisati je treba čas smrti in čas pojava ter izginotja znakov strupenosti.

1.6.3 Postopek Vsaka žival mora biti v svoji kletki. Živali se 28 dni, v idealnih razmerah po sedem dni na teden, tretirajo s preskusno snovjo. Živali katere koli satelitske skupine, predvidene za nadaljnja opazovanja, je treba pustiti nadaljnjih 14 dni brez tretiranja, da se ugotovi povratnost ali obstojnost strupenih učinkov. Izpostavljanje mora trajati najmanj šest ur dnevno. Preskusno snov je treba enakomerno nanesti na območje, ki predstavlja približno 10 % skupne telesne površine. Pri zelo strupenih snoveh je površina nanosa lahko manjša, vendar mora biti čim več površine pokrite s čim tanjšo in enakomerno plastjo. Med izpostavljenostjo mora preskusna snov ostati v stiku s kožo, kar se zagotovi s poroznim gaznim povojem in nedražilnim obližem. Preskusna površina mora biti dodatno ustrezno pokrita, da gazni povoj in preskusna snov ostaneta na istem mestu in se živalim prepreči zaužitje preskusne snovi. Za preprečitev zaužitja se lahko uporabijo pripomočki za omejevanje gibanja, vendar popolna imobilizacija ni priporočena metoda. Lahko se uporabi tudi zaščitni ovratnik. Ob koncu obdobja izpostavljenosti se ostanek preskusne snovi odstrani, kadar je to izvedljivo, z vodo ali kako drugo ustrezno metodo čiščenja kože. Vse živali je treba dnevno opazovati in zapisati znake strupenosti, vključno s časom njihovega pojava, stopnjo in trajanjem. Opazovati je treba spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznici ter tudi v dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju, somatomotorični aktivnosti in vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba izmeriti maso živali. Priporoča se tudi tedenska meritev porabe hrane. Živali je treba redno opazovati, da se prepreči izguba živali zaradi kanibalizma, avtolize tkiv ali napak pri dajanju v kletke. Ob koncu študije se na vseh preživelih živalih nesatelitskih tretiranih skupin opravi obdukcija. Umirajoče živali in živali v hudem stresu ali s hudimi bolečinami se takoj ob odkritju odstranijo iz kletk ter humano usmrtijo in obducirajo. Ob koncu preskusa se na vseh živalih, vključno z živalmi kontrolne skupine, opravijo naslednje preiskave: Druge določitve, ki so lahko potrebne za izdelavo ustrezne ocene strupenosti, vključujejo kalcij, fosfor, klorid, natrij, kalij, postno glukozo, lipide, hormone, ravnovesje kislina/baza, methemoglobin in aktivnost holinesteraze. Kadar je potrebno, se za razširitev raziskave opaženih učinkov lahko uporabijo dodatne klinične biokemijske preiskave.

1.6.3

1. hematološke preiskave, ki vključujejo najmanj določitev hematokrita, koncentracije hemoglobina, števila eritrocitov, skupnega in diferencialnega števila levkocitov in zmožnosti koagulacije;

2. klinične biokemijske preiskave krvi, ki vključujejo določanje najmanj enega parametra delovanja jeter in ledvic: serumska alanin-aminotransferaza (prej poznana kot glutamat-piruvat-transaminaza), serumska aspartat-aminotransferaza (prej poznana kot glutamat-oksaloacetat-transaminaza), sečninski dušik, albumin, kreatinin v krvi, skupni bilirubin in skupne serumske beljakovine.

1.6.4 Makroskopska obdukcija Na vseh živalih iz študije je treba izvesti popolno makroskopsko obdukcijo. Najmanj jetra, ledvica, nadledvične žleze in moda je treba stehtati mokre čim prej po disekciji, da se prepreči njihova dehidracija. Organe in tkiva, tj. normalno in tretirano kožo, jetra, ledvica, vranico, moda, nadledvične žleze, srce in tarčne organe (to je tiste organe, ki kažejo makroskopske poškodbe ali spremembe v velikosti), je treba shraniti v ustreznem mediju za morebitno histopatološko preiskavo v prihodnosti.

1.6.5 Histopatološka preiskava Pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni skupini je treba opraviti histološko preiskavo na shranjenih organih in tkivih. Pri vseh skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, je treba preiskati organe in tkiva, ki v skupini z največjim odmerkom kažejo poškodbe, ki se lahko pripišejo preskusni snovi. Živali satelitske skupine je treba histološko preiskati s posebnim poudarkom na tistih organih in tkivih, pri katerih so bili pri drugih tretiranih skupinah ugotovljeni strupeni učinki.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU V poročilo o preskusu se, če je možno, vključijo naslednje informacije:

podatki o živalih (vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, prehrana itd.),

preskusni pogoji (vključno z vrsto povoja: okluzivni ali neokluzivni),

velikost odmerkov (vključno z nosilcem, če je bil uporabljen) in koncentracije,

velikost odmerka brez učinkov, kadar je možno,

podatki o strupenem odzivu po spolu in odmerku,

čas smrti med študijo oziroma ali so živali preživele do zaključka,

strupeni ali drugi učinki,

čas odkritja a vsakega nenormalnega znaka in njegov nadaljnji razvoj,

podatki o hrani in telesni masi,

opravljeni hematološki preskusi in rezultati,

opravljeni klinični biokemijski preskusi in rezultati,

izsledki obdukcije,

podroben opis vseh histopatoloških izsledkov,

statistična obdelava rezultatov, kadar je možno,

razprava o rezultatih,

razlaga rezultatov.

3.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B (D).

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B (E).

B.10 MUTAGENOST – PREIZKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ PRI SESALCIH IN VITRO

B.10

1. METODA Ta metoda ustreza metodi OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).

1.

1.1. UVOD Namen preizkusa kromosomskih aberacij in vitro je določiti snovi, ki povzročijo strukturne kromosomske aberacije v kultiviranih sesalskih celicah (1) (2) (3). Ločimo dva tipa strukturnih aberacij, kromosomski tip in kromatidni tip. Večina kemičnih mutagenov povzroči aberacije kromatidnega tipa, nastopajo pa tudi aberacije kromosomskega tipa. Povečanje poliploidije lahko pomeni, da kemikalija lahko povzroči numerične aberacije. Vendar ta metoda ni namenjena določanju numeričnih aberacij in se navadno ne uporablja v ta namen. Kromosomske mutacije in podobni pojavi so vzrok številnih genskih bolezni pri človeku in obstajajo tehtni dokazi, da so kromosomske mutacije in podobni pojavi, ki povzročajo spremembe v onkogenih in genih, zaviralcih rasti tumorjev, somatskih celic, povezani z nastankom raka pri človeku in poskusnih živalih. Pri preizkusu kromosomskih aberacij in vitro se lahko uporabijo kulture trajnih celičnih linij, celični sevi ali primarne celične kulture. Uporabljene celice se izberejo na podlagi zmožnosti rasti v kulturi, stabilnosti kariotipa, kromosomskega števila, raznolikosti kromosomov in pogostnosti spontanih kromosomskih aberacij. Za preizkuse, opravljene in vitro, so navadno potrebni zunanji viri aktivacije presnove. Takšen sistem aktivacije presnove ne more povsem posnemati razmer in vivo pri sesalcih. Treba je paziti, da se prepreči nastanek razmer, ki bi vodile do pozitivnih rezultatov, ki ne kažejo prave mutagenosti in so lahko posledica sprememb pH, osmolarnosti ali visoke ravni citotoksičnosti (4) (5). Ta preizkus se uporablja za iskanje možnih mutagenov in rakotvornih snovi za sesalce. Mnoge spojine, pri katerih je rezultat tega preizkusa pozitiven, so rakotvorne snovi za sesalce; vendar pa soodvisnost med tem preizkusom in rakotvornostjo ni popolna. Odvisna je od skupine nevarnosti kemikalije in vedno več je dokazov, da obstajajo rakotvorne snovi, ki jih ta preizkus ne zazna, ker je videti, da delujejo prek drugih mehanizmov in ne z neposrednim poškodovanjem DNA. Glej tudi splošni uvod dela B.

1.2 DEFINICIJE Aberacija kromatidnega tipa: strukturna poškodba kromosoma, izražena kot prelom posameznih kromatid ali prelom in združitev med kromatidama. Aberacija kromosomskega tipa: strukturna poškodba kromosoma, izražena kot prelom ali prelom in združitev obeh kromatid na istem mestu. Endoreduplikacija: proces, pri katerem se jedro po podvojitvi DNA v fazi S ne začne deliti, ampak takoj nastopi druga faza S. Nastanejo kromosomi s 4, 8, 16, ... kromatidami. Presledek: akromatska lezija, manjša od širine ene kromatide, ob zelo majhni neporavnanosti kromatid. Mitotični indeks: razmerje med številom celic v metafazi in skupnim številom celic v opazovani populaciji celic; kazalec stopnje množitve te populacije. Numerična aberacija: število kromosomov, drugačno od normalnega števila, ki je značilno za uporabljene celice. Poliploidija: večkratnik haploidnega števila kromosomov (n), razen diploidnega števila (tj. 3n, 4n in tako naprej). Strukturna aberacija: sprememba v strukturi kromosoma, ki je vidna pri mikroskopskem pregledu metafaze celične delitve v obliki delecij in fragmentov, transpozicij ali recipročnih transi okacij.

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Celične kulture se izpostavijo preizkušam snovi ob aktivaciji presnove in brez nje. Celične kulture se v poprej določenih intervalih po izpostavitvi preizkušam snovi obdelajo s snovjo za ustavitev metafaze (npr. Colcemidom® ali kolhicinom), se požanjejo in obarvajo, nato se metafazne celice mikroskopsko pregledajo, da se določi navzočnost kromosomskih aberacij.

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Priprave

1.4.1

1.4.1.1 Celice Lahko se uporabijo različne celične linije, celični sevi ali primarne celične kulture, vključno s človeškimi celicami (npr. fibroblasti kitajskega hrčka, limfociti periferne krvi človeka ali drugih sesalcev).

1.4.1.2 Gojišče in pogoji kultiviranja Pri vzdrževanju kultur naj se uporabijo ustrezna gojišča za kulture in pogoji inkubacije (posode za kulture, koncentracija CO2, temperatura in vlažnost). Trajne celične linije in sevi se redno preverjajo, ali je v njih modalno kromosomsko število stabilno in ali niso okužene z mikoplazmo; okužene celične linije in sevi naj se ne uporabljajo. Poznati je treba normalni čas celičnega ciklusa in pogoje kultiviranja.

1.4.1.3 Priprava kultur Trajne celične linije in sevi: celice se namnožijo iz založnih kultur, nasadijo v gojišče tako na gosto, da kultura ne bo dosegla konfluentne rasti, preden se požanjejo, in se inkubirajo pri 37 oC. Limfociti: celotna kri, obdelana z antikoagulantom (npr. heparinom), ali ločeni limfociti, dobljeni iz zdravih osebkov, se dodajo v gojišče, ki vsebuje mitogen (npr. fitohemaglutinin), in se inkubirajo pri 37 oC.

1.4.1.4 Aktivacija presnove Celice naj se izpostavijo preizkušam snovi ob navzočnosti in ob odsotnosti ustreznega sistema za aktivacijo presnove. Najpogosteje uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija (S9), pripravljena iz jeter glodavcev, ki so bila obdelana s sredstvi za encimsko indukcijo, kakor je Aroclorm 1254 (6) (7) (8) (9), ali z zmesjo fenobarbitona in β – naftoflavona, z dodanimi kofaktorji (10) (11) (12). Postmitohondrijska frakcija se navadno uporablja v koncentracijah 1-10 % v/v v končnem preizkusnem gojišču. Pogoji sistema za aktivacijo presnove so lahko odvisni od skupine nevarnosti preizkušane kemikalije. Včasih je primerno uporabiti več kakor eno koncentracijo postmitohondrijske frakcije. Vrsta razvojnih dosežkov, skupaj s pridobivanjem gensko spremenjenih celičnih linij, v katerih se izražajo geni za točno določene aktivirajoče encime, lahko daje možnosti za endogeno aktivacijo. Izbira uporabljenih celičnih linij naj bo znanstveno utemeljena (npr. s pomembnostjo izoencima citokrom P450 za presnovo preizkušane snovi).

1.4.1.5 Preizkušana snov/priprava Trdne preizkušane snovi naj se pred obdelavo celic raztopijo ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, se razredčijo. Tekoče preizkušane snovi se lahko dodajo neposredno v preizkusni sistem in/ali pred obdelavo razredčijo. Uporabljajo naj se sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.

1.4.2 Preizkusni pogoji

1.4.2

1.4.2.1 Topilo/nosilec Topilo/nosilec naj ne vzbuja suma, da kemično reagira s preizkusno snovjo, in naj bo združljivo s preživetjem celic in delovanjem S9. Če se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vključitev podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporoča se, da se, kadar koli je to mogoče, kot prva možnost preuči uporaba vodnega topila/nosilca. Kadar se preizkušajo v vodi nestabilne snovi, naj se uporabijo brezvodna organska topila. Voda se lahko odstrani z molekulskim sitom.

1.4.2.2 Koncentracije izpostavljenosti Med merili, ki jih je treba upoštevati pri določanju najvišje koncentracije, so citotoksičnost, topnost v preizkušanem sistemu in spremembe v pH ali osmolarnosti. Citotoksičnost naj se določi ob aktivaciji presnove in brez nje v glavnem poskusu z uporabo ustreznega kazalca celične neokrnjenosti in rasti, kakor so stopnja konfluentne rasti, število živih celic ali mitotični indeks. Lahko je koristno, če se citotoksičnost in topnost določita v poprejšnjem poskusu. Uporabijo naj se vsaj tri koncentracije, ki jih je mogoče analizirati. Ob nastopu citotoksičnosti naj te koncentracije zajamejo območje od največje toksičnosti do majhne toksičnosti ali netoksičnosti; to bo navadno pomenilo, da razlika med koncentracijami ne bo smela biti večja od faktorja med 2 in √10. V času odvzema naj bo pri najvišji koncentraciji znatno zmanjšana stopnja konfluentne rasti, število celic ali mitotični indeks (vsi za več kakor 50 %). Mitotični indeks je le posredno merilo citotoskičnih/citostatskih učinkov in je odvisen od časa, ki je pretekel od obdelave. Vendar je mitotični indeks sprejemljiv za suspenzijske kulture, pri katerih so druge meritve toksičnosti lahko težavne in nepraktične. Informacije o dinamiki celičnega ciklusa, kakor je povprečni generacijski čas (AGT), se lahko uporabijo kot dodatne informacije. Vendar je AGT le povprečna vrednost, iz katere ni vedno razviden obstoj zapoznelih podpopulacij, in celo zelo majhno povečanje povprečnega generacijskega časa lahko pomeni znatno zapoznelost optimalnega števila aberacij. Za sorazmerno necitotoksične snovi naj bo največja preizkusna koncentracija 5μl/ml, 5 mg/ml oziroma 0,01 M, tista, ki je najnižja. Za sorazmerno netopne snovi, ki pri koncentracijah, nižjih od netopnih koncentracij, niso toksične, naj bo največji uporabljeni odmerek koncentracija nad mejo topnosti v končnem gojišču kulture ob koncu obdelave. Pri nekaterih primerih (npr. kadar se toksičnost pokaže le pri koncentracijah, višjih od netopne koncentracije) je priporočljivo preizkusiti več kakor eno koncentracijo z vidno oborino. Lahko je koristno oceniti topnost na začetku in na koncu obdelave, saj se topnost med izpostavitvijo v preizkusnem sistemu lahko spremeni zaradi navzočnosti celic, seruma S9 itn. Netopnost se lahko zazna s prostim očesom. Oborina ne sme vplivati na štetje.

1.4.2.3 Negativni in pozitivni kontrolni vzorci V vsak poskus naj se vključijo sočasni pozitivni in negativni (topilo ali nosilec) kontrolni vzorci, ob aktivaciji presnove in brez nje. Kadar se uporabi aktivacija presnove, mora biti kemikalija pozitivne kontrole tista, pri kateri je za mutageni odziv potrebna aktivacija. V pozitivnih kontrolnih vzorcih naj se uporabi znani klastogen pri ravneh izpostavljenosti, pri katerih se pričakuje ponovljivo in zaznavno povečanje glede na ozadje, ki pokaže občutljivost preizkusnega sistema. Koncentracije pozitivne kontrole naj se izberejo tako, da so učinki jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete kodiranih mikroskopskih preparatov. Primeri snovi pozitivne kontrole vključujejo: Stanje aktivacije presnove Snov Št. CAS Št. Einecs Ni zunanje aktivacije presnove metil metansulfonat 66-27-3 200-625-0 etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozosečnina 759-73-9 212-072-2 mitomicin C 50-07-7 200-008-6 4-nitrokinolin-N-oksid 56-57-5 200-281-1 Zunanja aktivacija presnove benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 ciklofosfamid ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Lahko se uporabijo druge ustrezne snovi pozitivne kontrole. Uporabijo naj se kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isto skupino nevarnosti kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo. Za vsak odvzem naj se pripravijo negativni kontrolni vzorci, ki jih sestavlja le topilo ali nosilec v obdelovalnem gojišču, obdelani na enak način kakor obdelovalne kulture. Uporabijo se tudi neobdelani kontrolni vzorci, razen če pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo ne povzroča škodljivih ali mutagenih učinkov.

1.4.3 Postopek

1.4.3

1.4.3.1 Obdelava s preizkušano snovjo Množeče se celice se obdelajo s preizkušano snovjo ob navzočnosti in ob odsotnosti sistema za aktivacijo presnove. Obdelava limfocitov naj se začne približno 48 ur po mitogeni stimulaciji.

1.4.3.2 Navadno se pri vsaki koncentraciji uporabita dve vzporedni kulturi; uporaba dveh vzporednih kultur se močno priporoča pri negativnih/s topilom kontrolnih kulturah. Kadar se na podlagi preteklih podatkov lahko dokaže, da so razlike med dvema vzporednima kulturama minimalne (13) (14), je sprejemljivo, da se uporabi ena kultura za vsako koncentracijo. Plinaste ali hlapne snovi naj se preizkušajo z ustreznimi metodami, na primer v zatesnjenih posodah za kulture (15) (16).

1.4.3.3 Čas odvzema celic iz kulture V prvem poskusu naj se celice za 3-6 ur izpostavijo preizkušam snovi, ob aktivaciji presnove in brez nje, in vzorčijo v času približno 1,5 dolžine normalnega celičnega ciklusa po začetku obdelave (12). Če so pri takšnem protokolu rezultati negativni ob aktivaciji, pa tudi brez nje, se opravi dodatni poskus brez aktivacije, pri katerem se kultura nenehno obdeluje do vzorčenja v času, enakem približno 1,5 dolžine normalnega celičnega ciklusa. Nekatere kemikalije se laže zaznajo pri časih obdelave/vzorčenja, ki so daljši od 1,5 dolžine ciklusa. Negativne rezultate ob aktivaciji presnove je treba potrditi za vsak primer posebej. Kadar se pojmuje, da potrditev negativnih rezultatov ni potrebna, naj se to utemelji.

1.4.3.4 Priprava kromosomov Celične kulture se obdelajo s Colcemidom® ali kolhicinom, navadno 1-3 ure pred odvzemom celic. Celice se odvzamejo in obdelajo za pripravo kromosomov iz vsake kulture posebej. Priprava kromosomov vključuje hipotonično obdelavo celic, fiksiranje in barvanje.

1.4.3.5 Analiza Vsi preparati, skupaj s pozitivnimi in negativnimi kontrolnimi vzorci, naj se pred mikroskopsko analizo neodvisno kodirajo. Ker fiksiranje pogosto povzroči pretrganje dela metafaznih celic in izgubo kromosomov, naj bo število centromer v štetih celicah pri vseh vrstah celic enako modalnemu številu ± 2. Če je to primerno, naj se na vsako koncentracijo in vsak kontrolni vzorec v štetje vključi vsaj 200 dobro vidnih metafaz, ki so enakomerno porazdeljene med vzporedne vzorce. To število se lahko zmanjša, kadar se opazi veliko število aberacij. Čeprav je namen preizkusa zaznati strukturne kromosomske aberacije, je pomembno, da se evidentirata poliploidija in endoreduplikacija, kadar se pokažeta.

2. PODATKI

2.

2.1 OBDELAVA REZULTATOV Poskusna enota je celica, zato naj se določi odstotek celic z eno ali več strukturnimi kromosomskimi aberacijami. Različni tipi strukturnih kromosomskih aberacij naj se navedejo skupaj s števili in pogostnostjo za poskusne in kontrolne kulture. Presledki se evidentirajo ločeno in navedejo v poročilu, vendar se na splošno ne vključijo v skupno pogostnost aberacij. Evidentirajo naj se tudi sočasne meritve citotoksičnosti za vse obdelane in negativne kontrolne kulture v glavnih poskusih aberacij. Navedejo se podatki za posamezne kulture. Vsi podatki naj bodo povzeti v tabelah. Preverjanje jasnega pozitivnega odziva ni potrebno. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. Potrebnost potrditve negativnih rezultatov je obravnavana pod 1.4.3.3. V nadaljnjih poskusih naj se preuči možnost prilagoditve preizkusnih parametrov, da se razširi območje pogojev analize. Preizkusni parametri, ki bi se lahko prilagodili, vključujejo intervale med koncentracijami in pogoje aktivacije presnove.

2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV Pozitivni rezultat se lahko določi na podlagi številnih meril, kakor je na primer s koncentracijo povezano povečanje ali ponovljivo povečanje števila celic s kromosomskimi aberacijami. Najprej naj se preuči biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov preizkusa se kot pomoč lahko uporabijo statistične metode (3) (13). Statistična značilnost naj ne bo edini odločilni dejavnik za pozitivni odziv. Povečano število poliploidnih celic lahko pomeni, da preizkušana snov lahko zavre mitozo in povzroči numerične kromosomske aberacije. Povečano število celic z endoredupliciranimi kromosomi lahko pomeni, da preizkušana snov lahko zavre potek celičnega ciklusa (17) (18). Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo navedenih meril, ni mutagena v tem sistemu. Čeprav bo večina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki preprečili zanesljivo oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. Pozitivni rezultati preizkusa kromosomskih aberacij in vitro pomenijo, da preizkušana snov povzroča strukturne kromosomske aberacij e v kultiviranih somatskih celicah sesalcev. Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne povzroča kromosomskih aberacij v kultiviranih somatskih celicah sesalcev.

3. POROČANJE

3. POROČILO O PRESKUSU

Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije:

Topilo/nosilec:

utemeljitev izbire nosilca,

topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta znani.

Celice:

vrsta in vir celic,

značilnosti kari otipa in ustreznost uporabljene vrste celic,

odsotnost mikoplazme, če je to primerno,

podatki o dolžini celičnega ciklusa,

spol donorjev krvi, celotna kri ali ločeni limfociti, uporabljeni mitogen,

število pasaž, če je to primerno,

metode vzdrževanj a celične kulture, če j e to primerno,

modalno število kromosomov.

Preskusni pogoji:

vrsta snovi za ustavitev metafaze, njena koncentracija in čas izpostavljenosti celic,

razlogi za izbiro koncentracij in števila kultur, vključno z npr. podatki o citotoksičnosti in mejah topnosti, če so na voljo,

sestava gojišč, koncentracija CO2, če je to primerno,

koncentracija preizkušane snovi,

volumen dodanega nosilca in preizkušane snovi,

temperatura inkubacije,

čas inkubacije,

trajanje obdelave,

gostota celic ob nasaditvi, če je to primerno,

vrsta in sestava sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili sprejemljivosti,

pozitivni in negativni kontrolni vzorci,

metode priprave mikroskopskih preparatov,

merila za štetje aberacij,

število analiziranih metafaz,

metode merjenja toksičnosti,

merila za določitev, ali je študija pozitivna, negativna ali dvoumna.

Rezultati:

znaki toksičnosti, npr. stopnja konfluentne rasti, podatki o celičnem ciklusu, število celic, mitotični indeks,

znaki obarjanja,

podatki o pH in osmolarnosti obdelovalnega gojišča, če sta bila določena,

opredelitev aberacij, skupaj s presledki,

število celic s kromosomskimi aberacijami in tip kromosomskih aberacij, ki se navedeta posebej za vsako obdelano in kontrolno kulturo,

spremembe v ploidnosti, če so bile opažene,

odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogoče,

statistične analize, če so bile opravljene,

podatki o sočasni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli,

podatki o pretekli negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni.

Diskusija rezultatov.

Sklepi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)

LITERATURA Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York in London, str. 1–29. Ishidate, M. Jr. in Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, v: Progress in Mutation Research, zv. 5, Ashby, J. idr., (izd.) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, str. 427–432. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G., in Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), str. 1–175. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J., in Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, str. 147–204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I., in Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, str. 297–305. Ames, B. N., McCann, J., in Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, str. 347–364. Maron, D. M., in Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, str. 173–215. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M., in de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, str. 83–90. Matsuoka, A., Hayashi, M., in Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, str. 277–290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., in Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, str. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., in Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, v: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R., in Philpot, R. M. (izd.), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, str. 85–88. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, str. 241–261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G, Chanter, D. O., in Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, v: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, str. 141–154. Soper, K. A., in Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, str. 139–149. Krahn, D. F., Barsky, F. C, in McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, v: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (izd.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, str. 91–103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., in Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, str. 795–801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, str. 403–413. Huang, Y., Change, C, in Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, str. 1362–1364.

B.11 MUTAGENOST – PRESKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ V KOSTNEM MOZGU SESALCEV IN VIVO

B.11

1. METODA Ta metoda ustreza metodi OECD TG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997).

1.

1.1 UVOD Preizkus kromosomskih aberacij in vivo pri sesalcih se uporablja za odkrivanje strukturnih kromosomskih aberacij, ki jih povzroči preizkušana snov v celicah kostnega mozga živali, navadno glodavcev (1) (2) (3) (4). Ločimo dva tipa strukturnih kromosomskih aberacij, kromosomski tip in kromatidni tip. Povečanje poliploidije lahko pomeni, da kemikalija lahko povzroči numerične aberacij e. Večina kemičnih mutagenov povzroči aberacij e kromatidnega tipa, nastopajo pa tudi aberacij e kromosomskega tipa. Kromosomske mutacije in podobni pojavi so vzrok genskih bolezni pri človeku in obstajajo tehtni dokazi, da so kromosomske mutacije in podobni pojavi, ki povzročajo spremembe v onkogenih in genih, zaviralcih rasti tumorjev, povezani z rakom pri človeku in v poskusnih sistemih. Pri tem preizkusu se redno uporabljajo glodavci. Tarčno tkivo pri tem preizkusu je kostni mozeg, ker je zelo vaskularizirano tkivo in vsebuje populacijo celic s hitro menjavo ciklusa, ki se z lahkoto izolirajo in obdelajo. Druge vrste in tarčna tkiva niso predmet te metode. Ta preizkus kromosomskih aberacij je posebno primeren za ocenjevanje nevarnosti mutagenosti, ker omogoča upoštevanje dejavnikov presnove in vivo, farmakokinetike in popravljanja DNA, čeprav so ti lahko različni pri različnih vrstah in tkivih. Preizkus in vivo je koristen tudi za nadaljnjo preiskavo mutagenih učinkov, odkritih pri preizkusu in vitro. Če obstajajo dokazi, da preizkušana snov ali reaktivni metabolit ne bo dosegel tarčnega tkiva, ta preizkus ni primeren. Glej tudi splošni uvod dela B.

1.2 DEFINICIJE Aberacija kromatidnega tipa: strukturna poškodba kromosoma, izražena kot prelom posameznih kromatid ali prelom in združitev med kromatidama. Aberacija kromosomskega tipa: strukturna poškodba kromosoma, izražena kot prelom ali prelom in združitev pri obeh kromatidah na istem mestu. Endoreduplikacija: proces, pri katerem se jedro po podvojitvi DNA v fazi S ne začne deliti, ampak takoj nastopi druga faza S. Nastanejo kromosomi s 4, 8, 16, ... kromatidami. Presledek: akromatska lezija, manjša od širine ene kromatide, ob zelo majhni neporavnanosti kromatid(-e). Numerična aberacija: število kromosomov, drugačno od normalnega števila, ki je značilno za uporabljene celice. Poliploidija: večkratnik haploidnega števila kromosomov (n), razen diploidnega števila (tj. 3n, 4n in tako naprej). Strukturna aberacija: sprememba v strukturi kromosoma, ki je vidna pri mikroskopskem pregledu metafaze celične delitve v obliki delecij in fragmentov, transpozicij ali recipročnih transi okacij.

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Živali se primerno izpostavijo preizkušam snovi in se v primernem času po tretiranju žrtvujejo. Pred žrtvovanjem se živali tretirajo s sredstvom za ustavitev metafaze (npr. kolhicinom ali Colcemidom®). Nato se pripravijo in obarvajo preparati kromosomov iz celic kostnega mozga in se določijo kromosomske aberacije v metafaznih celicah.

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Priprave

1.4.1

1.4.1.1 Izbira živalskih vrst Navadno se uporabljajo podgane, miši in kitajski hrčki, lahko pa se uporabi katera koli primerna vrsta sesalcev. Uporabijo naj se splošno uporabljani laboratorijski sevi mladih zdravih odraslih živali. Ob začetku študije naj bo nihanje teže živali čim manjše in naj ne presega ± 20 % srednje vrednosti teže vsakega spola.

1.4.1.2 Pogoji bivanja in hranjenja Uporabljajo se splošni pogoji iz splošnega uvoda dela B, vendar naj bo ciljna vlažnost 50–60 %.

1.4.1.3 Priprava živali Zdrave mlade odrasle živali se naključno dodelijo kontrolni in tretirani skupini. Kletke se razporedijo tako, da se čimbolj zmanjšajo možni učinki postavitve kletke. Živali se označijo z enkratnimi oznakami. Živali se vsaj pet dni aklimatizirajo na laboratorijske razmere.

1.4.1.4 Priprava odmerkov Trdne preizkušane snovi naj se pred odmerjanjem živalim raztopijo ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, se razredčijo. Tekoče preizkušane snovi se lahko odmerijo neposredno ali pa se pred odmerjanjem razredčijo. Uporabljajo naj se sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.

1.4.2 Preizkusni pogoji

1.4.2

1.4.2.1 Topilo/nosilec Topilo/nosilec naj nima toksičnih učinkov pri uporabljenih odmerkih in naj se zanj ne sumi, da kemično reagira s preizkusno snovjo. Če se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vključitev podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporoča se, da se, kadar koli je to mogoče, kot prva možnost preuči uporaba vodnega topila/nosilca.

1.4.2.2 Kontrolni vzorci V vsak preizkus naj se vključijo sočasni pozitivni in negativni (topilo/nosilec) kontrolni vzorci za vsak spol. Razen tretiranja s preizkusno snovjo naj se z živalmi v kontrolnih skupinah ravna enako kakor s tistimi v tretiranih skupinah. Snovi pozitivne kontrole naj pri ravneh izpostavljenosti, pri katerih se pričakuje zaznavno povečanje glede na ozadje, povzročijo kromosomske aberacije in vivo. Odmerki pozitivne kontrole naj se izberejo tako, da so učinki jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete kodiranih mikroskopskih preparatov. Sprejemljivo je, da se snovi pozitivne kontrole dajejo živalim drugače kakor preizkušana snov in da se pri pozitivni kontroli vzorči le enkrat. Lahko se uporabijo kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isti razred kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo: Snov Št. CAS Št. Einecs Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozosečnina 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamid Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietilenmelamin 51-18-3 200-083-5 Negativni kontrolni vzorci, tretirani le s topilom ali nosilcem, drugače pa obravnavani enako kakor tretirane skupine, naj se vključijo v vsako vzorčenje, razen če pretekli kontrolni podatki kažejo na sprejemljivo spremenljivost med posameznimi živalmi in pogostnost celic s kromosomskimi aberacijami. Če se pri negativni kontroli opravi le eno vzorčenje, je čas prvega vzorčenja najprimernejši. Uporabijo naj se tudi netretirani kontrolni vzorci, razen če pretekli ali objavljeni kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo/nosilec ne povzroča škodljivih ali mutagenih učinkov.

1.5 POSTOPEK

1.5

1.5.1 Število in spol živali Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vključevati vsaj pet živali vsakega spola, ki jih je mogoče analizirati. Če so v času študije na voljo podatki študij o isti vrsti in ob uporabi istega načina izpostavljanja, ki dokazujejo, da med spoloma ni znatnih razlik v toksičnosti, bo zadostovalo preizkušanje na enem spolu. Kadar bi bila izpostavljenost kemikaliji pri človeku lahko omejena na en spol, na primer pri nekaterih farmacevtskih učinkovinah, naj se preizkus opravi na živalih ustreznega spola.

1.5.2 Program tretiranja Preizkušane snovi naj se po možnosti dajo z enkratnim vnosom. Preizkušane snovi se lahko dajejo tudi v razdeljenem odmerku, to pomeni dva vnosa v istem dnevu, ne več kakor nekaj ur narazen, da se olajša dajanje velikega volumna materiala. Drugačni režimi odmerjanja naj bodo znanstveno utemeljeni. Vzorci naj se vzamejo dvakrat v enem dnevu ob različnih časih po tretiranju. Pri glodavcih je prvi čas vzorčenja 1,5 dolžine normalnega celičnega ciklusa (ki navadno traja 12–18 ur) po tretiranju. Ker čas, potreben za sprejem in presnovo preizkušane snovi ter njen učinek na dinamiko celičnega ciklusa, lahko vpliva na optimalni čas za zaznavo kromosomskih aberacij, se priporoča ponovni odvzem vzorcev 24 ur po prvem vzorčenju. Če se uporabijo režimi odmerjanja, daljši od enega dneva, naj se vzorči enkrat, 1,5 dolžine normalnega celičnega ciklusa po zadnjem vnosu. Pred žrtvovanjem se živalim intraperitonealno injicira ustrezen odmerek sredstva za ustavitev metafaze (npr. Colcemida® ali kolhicina). Živali se vzorčijo v ustreznem časovnem intervalu po tem. Pri miših je ta interval približno 3–5 ur; pri kitajskih hrčkih je ta interval približno 4–5 ur. Celice se odvzamejo iz kostnega mozga in analizirajo, da se določijo kromosomske aberacij e.

1.5.3 Velikost odmerkov Če se opravi študija za ugotavljanje območja, ker ni na voljo ustreznih podatkov, naj se opravi v istem laboratoriju, na isti vrsti, sevu in spolu ter ob enakem režimu tretiranja, kakor bo to uporabljeno v glavni študiji (5). Če toksičnost je, se za prvo vzorčenje uporabijo tri velikosti odmerkov. Te velikosti odmerkov naj zajamejo območje od največje toksičnosti do majhne toksičnosti ali netoksičnosti. Pri poznejšem vzorčenju se lahko uporabi le največji odmerek. Največji odmerek je opredeljen kot odmerek, ki povzroči takšne znake toksičnosti, na podlagi katerih je pričakovati, da bi večji odmerki pri istem režimu odmerjanja povzročili smrt. Snovi s specifičnim biološkim delovanjem pri majhnih netoksičnih odmerkih (na primer hormoni in mitogeni) so lahko izjeme pri merilih za določanje odmerka in naj se ovrednotijo za vsak primer posebej. Največji odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzroči nekaj znakov toksičnosti v kostnem mozgu (npr. več kakor 50 % zmanjšanje mitotičnega indeksa).

1.5.4 Mejni preizkus Če preizkus pri eni velikosti odmerka vsaj 2000 mg/kg telesne teže, ki se da v enem vnosu ali v dveh vnosih v istem dnevu, ne povzroči nobenih opaznih toksičnih učinkov in če se na podlagi podatkov o strukturno sorodnih snoveh ne pričakuje, da bo snov genotksična, se lahko pojmuje, da popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov ni potrebna. Mejni odmerek za dolgotrajnejše študije je 2000 mg/kg telesne teže/dan za tretiranje do 14 dni in 1000 mg/kg telesne teže/dan za tretiranje, daljše od 14 dni. Pričakovana izpostavljenost človeka lahko nakaže potrebo po večjih odmerkih pri mejnem preizkusu.

1.5.5 Dajanje odmerkov Navadno se preizkušana snov daje z gavažo po želodčni cevki ali ustrezni intubacijski kanili ali z intraperitonealno injekcijo. Sprejemljivi so tudi drugi načini izpostavljanja, kadar jih je mogoče utemeljiti. Največji volumen tekočine, ki se lahko naenkrat da z gavažo ali injekcijo, je odvisen od velikosti preizkušane živali. Volumen naj ne presega 2 ml/100 g telesne teže. Uporabo večjih volumnov je treba utemeljiti. Razen pri dražečih ali jedkih snoveh, ki bodo navadno povzročile dražilne učinke pri večjih koncentracijah, naj se s prilagoditvijo koncentracije čimbolj zmanjša spremenljivost preizkušanega volumna, tako da se zagotovi stalni volumen pri vseh velikostih odmerkov.

1.5.6 Priprava kromosomov Takoj po žrtvovanju se kostni mozeg odvzame, izpostavi hipotonični raztopini in fiksira. Celice se nato nanesejo na objektna stekelca in obarvajo.

1.5.7 Analiza Kot merilo citotoksičnosti naj se določi mitotični indeks v vsaj 1000 celicah na žival pri vseh tretiranih živalih (skupaj s pozitivnimi kontrolnimi vzorci) in netretiranih živalih negativne kontrole. Analizira naj se vsaj 100 celic za vsako žival. To število se lahko zmanjša, kadar se opazi veliko število aberacij. Vsi preparati, skupaj s pozitivnimi in negativnimi kontrolnimi vzorci, naj se pred mikroskopsko analizo neodvisno kodirajo. Ker postopki priprave mikroskopskih preparatov pogosto povzročijo pretrganje dela metafaz in izgubo kromosomov, naj bo število centromer v štetih celicah enako 2 n ± 2.

2. PODATKI

2.

2.1 OBDELAVA REZULTATOV Podatki za posamezne živali naj bodo prikazani v tabelah. Poskusna enota je žival. Za vsako žival naj se določi število štetih celic, število aberacij na celico in odstotek celic z eno ali več strukturnimi kromosomskimi aberacij ami. Različni tipi strukturnih kromosomskih aberacij naj se navedejo skupaj s števili in pogostnostjo za tretirane in kontrolne skupine. Presledki se evidentirajo ločeno in navedejo v poročilu, vendar se na splošno ne vključijo v skupno pogostnost aberacij. Če ni dokaza za razliko v odzivu med spoloma, se pri statistični analizi lahko združijo podatki za oba spola.

2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV Pozitivni rezultat se lahko določi na podlagi številnih meril, kakor je na primer z odmerkom povezano povečanje relativnega števila celic s kromosomskimi aberacijami ali jasno povečanje števila celic z aberacijami v posamezni tretirani skupini ob posameznem vzorčenju. Najprej naj se preuči biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov preizkusa se kot pomoč lahko uporabijo statistične metode (6). Statistična značilnost naj ne bo edini odločilni dejavnik za pozitivni odziv. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. Povečanje poliploidije lahko pomeni, da preizkušana snov lahko povzroči numerične kromosomske aberacije. Povečanje pogostnosti endoreduplikacije lahko pomeni, da preizkušana snov lahko zavre potek celičnega ciklusa (7) (8). Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo navedenih meril, ni mutagena v tem preizkusu. Čeprav bo večina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki preprečili zanesljivo oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število opravljenih poskusov. Pozitivni rezultati preizkusa kromosomskih aberacij in vivo pomenijo, da preizkušana snov povzroča kromosomske aberacije v kostnem mozgu preizkušane vrste. Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne povzroča kromosomskih aberacij v kostnem mozgu preizkušane vrste. Obravnava naj se verjetnost, da preizkušana snov ali njeni metaboliti dosežejo krvni obtok ali posebej tarčno tkivo (npr. sistemska toksičnost).

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije:

Topilo/nosilec:

utemeljitev izbire nosilca,

topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta znani.

Preizkusne živali:

uporabljena vrsta/sev,

število, starost in spol živali,

vir, pogoji bivanja, prehrana itn.,

teža posameznih živali na začetku preizkusa, skupaj z območjem telesne teže, srednjo vrednostjo in standardnim odklonom za vsako skupino.

Preizkusni pogoji:

pozitivni in negativni (nosilec/topilo) kontrolni vzorci,

podatki študije za ugotavljanje območja, če je bila opravljena,

razlogi za izbiro velikosti odmerka,

podrobnosti o pripravi preizkušane snovi,

podrobnosti o dajanju preizkušane snovi,

razlogi za način dajanja,

metode za preverjanje, ali je preizkušana snov dosegla krvni obtok ali tarčno tkivo, če je to primerno,

način preračunavanja koncentracije preizkušane snovi v hrani/pitni vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je to primerno,

podrobnosti o kakovosti hrane in vode,

podroben opis programov tretiranja in vzorčenja,

metode merjenja toksičnosti,

vrsta snovi za ustavitev metafaze, njena koncentracija in čas tretiranja,

metode priprave mikroskopskih preparatov,

merila za štetje aberacij,

število analiziranih celic na žival,

merila za določitev, ali je študija pozitivna, negativna ali dvoumna.

Rezultati:

znaki toksičnosti,

mitotični indeks,

tip in število aberacij, navedena za vsako žival posebej,

skupno število aberacij na skupino, s srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni,

število celic z aberacij ami na skupino, s srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni,

spremembe v ploidnosti, če so bile opažene,

odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogoče,

statistične analize, če so bile opravljene,

podatki o sočasni negativni kontroli,

podatki o pretekli negativni kontroli, z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni,

podatki o sočasni pozitivni kontroli.

Diskusija rezultatov.

Sklepi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)

LITERATURA Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, v Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (izd.), IRL Press, Oxford, Washington D. C, str. 275–306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F., in Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, str. 157–165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J., in Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, v: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Poročilo, del I, pregledan, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115–141. Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S., in Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, str. 305–312. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J., in Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, str. 313–319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G., in Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, v: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Poročilo, del III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (izd.) Cambridge University Press, Cambridge, str. 184–232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, str. 403–413. Huang, Y., Change, C, in Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, str. 1362–1364.

B.12 MUTAGENOST – PREIZKUS MIKRONUKLEUSOV V ERITROCITIH SESALCEV IN VIVO

B.12

1. METODA Ta metoda ustreza metodi OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).

1.

1.1 UVOD Preizkus mikronukleusov in vivo pri sesalcih se uporablja za odkrivanje poškodb, ki jih preizkušana snov povzroči na kromosomih ali mitotičnem aparatu eritroblastov, z analizo eritrocitov, vzorčenih iz kostnega mozga in/ali celic periferne krvi živali, navadno glodavcev. Namen preizkusa mikronukleusov je določiti snovi, povzročiteljice citogenetskih poškodb, zaradi katerih nastanejo mikronukleusi, ki vsebujejo zaostale fragmente kromosomov ali cele kromosome. Ko se eritroblast iz kostnega mozga razvije v polikromatični eritrocit, se jedro izvrže; kakršen koli mikronukleus, kije nastal, lahko ostane v drugače brezjedrni citoplazmi. Vidnost mikronukleusov je v teh celicah olajšana, ker nimajo jedra. Povečanje pogostnosti polikromatičnih eritrocitov z mikronukleusi pri tretiranih živalih je znak induciranih poškodb kromosomov. Pri tem preizkusu se redno uporablja kostni mozeg glodavcev, saj v tem tkivu nastajajo polikromatični eritrociti. Določanje nezrelih (polikromatičnih) eritrocitov z mikronukleusi v periferni krvi je enako sprejemljivo pri kateri koli vrsti, pri kateri je bilo dokazano, da vranica ni zmožna odstraniti eritrocitov z mikronukleusi, ali ki je pokazala dovoljšno občutljivost za zaznavanje snovi, povzročajočih strukturne ali numerične kromosomske aberacije. Mikronukleusi se lahko razločijo na podlagi številnih meril. Ta vključujejo določanje navzočnosti ali odsotnosti kinetohora ali centromerne DNA v mikronukleusih. Pogostnost nezrelih (polikromatičnih) eritrocitov z mikronukleusi je glavna končna točka. Število zrelih (normokromatičnih) eritrocitov, ki vsebujejo mikronukleuse, v periferni krvi med določenim številom zrelih eritrocitov se tudi lahko uporabi kot končna točka preizkusa, kadar se živali tretirajo štiri tedne ali več. Ta preizkus mikronukleusov in vivo pri sesalcih je posebno primeren za ocenjevanje nevarnosti mutagenosti, ker omogoča upoštevanje dejavnikov presnove in vivo, farmakokinetike in popravljanja DNA, čeprav so ti lahko različni pri različnih vrstah, tkivih in genetskih končnih točkah. Preizkus in vivo je koristen tudi za nadaljnjo preiskavo mutagenih učinkov, odkritih v sistemu in vitro. Če obstajajo dokazi, da preizkušana snov ali reaktivni metabolit ne bo dosegel tarčnega tkiva, ta preizkus ni primeren. Glej tudi splošni uvod dela B.

1.2 DEFINICIJE Centromera (kinetohor): del(-i) kromosoma, s katerim(-i) se med celično delitvijo povežejo niti delitvenega vretena, kar omogoči urejeno gibanje hčerinskih kromosomov proti poloma hčerinskih celic. Mikronukleusi: majhna jedra, poleg glavnega jedra celic in ločena od njega, ki nastanejo med telofazo mitoze (mejoze) iz zaostalih fragmentov kromosomov ali celih kromosomov. Normokromatični eritrocit: zreli eritrocit, ki nima ribosomov in ga lahko ločimo od nezrelih, polikromatičnih eritrocitov z barvanjem, selektivnim za ribosome. Polikromatični eritrocit: nezreli eritrocit, v vmesnem stadiju razvoja, ki še vedno vsebuje ribosome in ga zato lahko ločimo od zrelih, normokromatičnih eritrocitov z barvanjem, selektivnim za ribosome.

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Živali se primerno izpostavijo preizkušam snovi. Če se uporabi kostni mozeg, se živali žrtvujejo ob primernih časih po tretiranju, nato se odvzame kostni mozeg ter se pripravijo in obarvajo preparati (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Kadar se uporabi periferna kri, se kri odvzame ob primernih časih po tretiranju, nato se pripravijo in obarvajo razmazi krvi (4) (8) (9) (10). Pri študijah s periferno krvjo naj med zadnjo izpostavitvijo in odvzemom celic preteče čimmanj časa. Preparati se analizirajo, da se določi navzočnost mikronukleusov.

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Priprave

1.4.1

1.4.1.1 Izbira živalskih vrst Če se uporabi kostni mozeg, se priporočajo miši ali podgane, lahko pa se uporabi katera koli primerna vrsta sesalcev. Kadar se uporabi periferna kri, se priporočajo miši. Lahko pa se uporabi katera koli primerna vrsta sesalcev, pri kateri vranica ne odstrani eritrocitov z mikronukleusi ali ki je pokazala dovoljšno občutljivost za zaznavanje snovi, povzročajočih strukturne ali numerične kromosomske aberacije. Uporabijo naj se splošno uporabljani laboratorijski sevi mladih zdravih živali. Ob začetku študije naj bo nihanje teže živali čim manjše in naj ne presega ± 20 % srednje vrednosti teže vsakega spola.

1.4.1.2 Pogoji bivanja in hranjenja Uporabljajo se splošni pogoji iz splošnega uvoda dela B, vendar naj bo ciljna vlažnost 50–60 %.

1.4.1.3 Priprava živali Zdrave mlade odrasle živali se naključno dodelijo kontrolni in tretirani skupini. Živali se označijo z enkratnimi oznakami. Živali se vsaj pet dni aklimatizirajo na laboratorijske razmere. Kletke se razporedijo tako, da se čimbolj zmanjšajo možni učinki postavitve kletke.

1.4.2 Preizkusni pogoji

1.4.2

1.4.2.1 Topilo/nosilec Topilo/nosilec naj nima toksičnih učinkov pri uporabljenih odmerkih in naj se zanj ne sumi, da kemično reagira s preizkušano snovjo. Če se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vključitev podpirajo referenčni podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporoča se, da je, kadar koli je to mogoče, prva izbira vodno topilo/nosilec.

1.4.2.2 Kontrolni vzorci V vsak preizkus naj se vključijo sočasni pozitivni in negativni (topilo/nosilec) kontrolni vzorci za vsak spol. Razen tretiranja s preizkušano snovjo naj se z živalmi v kontrolnih skupinah ravna enako kakor s tistimi v tretiranih skupinah. Snovi pozitivne kontrole naj pri ravneh izpostavljenosti, pri katerih se pričakuje zaznavno povečanje glede na ozadje, povzročijo nastanek mikronukleusov in vivo. Odmerki pozitivne kontrole naj se izberejo tako, da so učinki jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete kodiranih mikroskopskih preparatov. Sprejemljivo je, da se snovi pozitivne kontrole dajejo živalim drugače kakor preizkušana snov in da se pri pozitivni kontroli vzorči le enkrat. Poleg tega se lahko uporabijo kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isto skupino nevarnosti kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo. Primeri snovi pozitivne kontrole vključujejo: Snov Št. CAS Št. Einecs Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozosecnina 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamid Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietilenmelamin 51-18-3 200-083-5 Negativni kontrolni vzorci, tretirani le s topilom ali nosilcem, drugače pa obravnavani enako kakor tretirane skupine, naj se vključijo v vsako vzorčenje, razen če pretekli kontrolni podatki dokazujejo sprejemljivo spremenljivost med posameznimi živalmi in pogostnost celic z mikronukleusi. Če se pri negativni kontroli opravi le eno vzorčenje, je čas prvega vzorčenja najprimernejši. Uporabijo naj se tudi netretirani kontrolni vzorci, razen če pretekli ali objavljeni kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo/nosilec ne povzroča škodljivih ali mutagenih učinkov. Če se uporabi periferna kri, je kot negativni kontrolni vzorec lahko sprejemljiv tudi vzorec pred tretiranjem, vendar le pri kratkotrajnih študijah periferne krvi (npr. 1-3 tretiranje(-a)), kadar so dobljeni podatki v pričakovanem območju glede na preteklo kontrolo.

1.5 POSTOPEK

1.5

1.5.1 Število in spol živali Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vključevati vsaj pet živali vsakega spola, ki jih je mogoče analizirati (11). Če so v času študije na voljo podatki študij o isti vrsti in ob uporabi istega načina izpostavljanja, ki dokazujejo, da med spoloma ni znatnih razlik v toksičnosti, bo zadostovalo preizkušanje na enem spolu. Kadar bi bila lahko izpostavljenost kemikaliji pri človeku omejena na en spol, na primer pri nekaterih farmacevtskih učinkovinah, naj se preizkus opravi na živalih ustreznega spola.

1.5.2 Program tretiranja Ni mogoče priporočiti nobenega standardnega programa tretiranja (to je enega, dveh ali več vnosov v 24-urnih intervalih). Vzorci iz dolgotrajnih režimov odmerjanja so sprejemljivi, pod pogojem, daje bil dokazan pozitivni učinek pri tej študiji ali pri negativni študiji, če je bila dokazana toksičnost ali je bil uporabljen mejni odmerek in se je odmerjanje nadaljevalo do vzorčenja. Preizkušane snovi se lahko dajejo tudi v razdeljenem odmerku, to pomeni dva vnosa v istem dnevu, ne več kakor nekaj ur narazen, da se olajša dajanje velikega volumna materiala. Preizkus se lahko izvede na dva načina: Lahko se vzamejo dodatni vzorci ob drugih časih, kadar je to primerno.

1.5.2

(a) živali se s snovjo tretirajo enkrat. Vzorci kostnega mozga se odvzamejo vsaj dvakrat, vsaj 24 ur po tretiranju in najpozneje 48 ur po tretiranju, z ustreznimi intervali med vzorčenji. Vzorčenje manj kakor 24 ur po tretiranju naj se utemelji. Vzorci periferne krvi se odvzamejo vsaj dvakrat, vsaj 36 ur po tretiranju in najpozneje 72 ur po tretiranju, z ustreznimi intervali med vzorčenji. Ko se pri posameznem vzorčenju opazi pozitivni odziv, dodatno vzorčenje ni potrebno;

(b) če se opravita dva dnevna vnosa ali več (npr. dva vnosa ali več v 24-urnih intervalih), se vzorci odvzamejo enkrat med 18. in 24. uro po zadnjem vnosu pri kostnem mozgu in enkrat med 36. in 48. uro po zadnjem vnosu pri periferni krvi (12).

1.5.3 Velikost odmerkov Če se opravi študija za ugotavljanje območja, ker ni na voljo ustreznih podatkov, naj se opravi v istem laboratoriju, na isti vrsti, sevu in spolu ob enakem režimu tretiranja, kakor bo to uporabljeno v glavni študiji (13). Če toksičnost je, se za prvo vzorčenje uporabijo tri velikosti odmerkov. Te velikosti odmerkov naj zajamejo območje od največje toksičnosti do majhne toksičnosti ali netoksičnosti. Pri poznejšem vzorčenju se lahko uporabi le največji odmerek. Največji odmerek je opredeljen kot odmerek, ki povzroči takšne znake toksičnosti, na podlagi katerih je pričakovati, da bi večji odmerki pri istem režimu odmerjanja povzročili smrt. Snovi s specifičnim biološkim delovanjem pri majhnih netoksičnih odmerkih (na primer hormoni in mitogeni) so lahko izjeme pri merilih za določanje odmerka in naj se ovrednotijo za vsak primer posebej. Največji odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzroči nekaj znakov toksičnosti v kostnem mozgu (npr. zmanjšanje deleža nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti v kostnem mozgu ali periferni krvi).

1.5.4 Mejni preizkus Če preizkus pri eni velikosti odmerka vsaj 2000 mg/kg telesne teže, ki se da v enem vnosu ali dveh vnosih v istem dnevu, ne povzroči nobenih opaznih toksičnih učinkov in če se na podlagi podatkov o strukturno sorodnih snoveh ne pričakuje, da bo snov genotksična, se lahko pojmuje, da popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov ni potrebna. Mejni odmerek za dolgotrajnejše študije je 2000 mg/kg telesne teže/dan za tretiranje do 14 dni in 1000 mg/kg telesne teže/dan za tretiranje, daljše od 14 dni. Pričakovana izpostavljenost človeka lahko nakaže potrebo po večjih odmerkih pri mejnem preizkusu.

1.5.5 Dajanje odmerkov Navadno se preizkušana snov daje z gavažo po želodčni cevki ali ustrezni intubacijski kanili ali z intraperitonealno injekcijo. Sprejemljivi so tudi drugi načini izpostavljanja, kadar se lahko utemeljijo. Največji volumen tekočine, ki se lahko naenkrat da z gavažo ali injekcijo, je odvisen od velikosti preizkusne živali. Volumen naj ne presega 2 ml/100 g telesne teže. Uporabo večjih volumnov je treba utemeljiti. Razen pri dražilnih ali jedkih snoveh, ki bodo pri večjih koncentracijah navadno povzročile dražilne učinke, naj se s prilagoditvijo koncentracije čimbolj zmanjša spremenljivost preizkusnega volumna, tako da se zagotovi stalni volumen pri vseh velikostih odmerkov.

1.5.6 Priprava kostnega mozga/krvi Celice kostnega mozga se navadno odvzamejo iz stegnenic ali golenic takoj po žrtvovanju. Navadno se celice odstranijo iz stegnenic ali golenic, se preparirajo in obarvajo z uporabo uveljavljenih metod. Periferna kri se odvzame iz repne vene ali druge primerne krvne žile. Krvne celice se takoj supravitalno obarvajo (8) (9) (10) ali pa se pripravijo razmazi, ki se nato obarvajo. Uporaba DNA-specifičnega barvila (npr. akridin oranž (14) ali Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) lahko prepreči nastanek nekaterih artefaktov, povezanih z uporabo barvila, ki ni specifično za DNA. Ta prednost ne preprečuje uporabe splošno uporabljenih barvil (npr. Giemsa). Lahko se uporabijo tudi dodatni sistemi (npr. celulozne kolone za odstranitev celic z jedri (16)), pod pogojem, daje bilo dokazano, da ti sistemi zadovoljivo delujejo pri pripravi mikronukleusov v laboratoriju.

1.5.7 Analiza Za vsako žival se določi delež nezrelih med vsemi (nezrelimi + zrelimi) eritrociti, tako da se prešteje skupaj vsaj 200 eritrocitov pri kostnem mozgu in 1000 eritrocitov pri periferni krvi (17). Vsi preparati, skupaj s pozitivnimi in negativnimi kontrolnimi vzorci, naj se pred mikroskopsko analizo neodvisno kodirajo. V določanje incidence nezrelih eritrocitov z mikronukleusi se vključi vsaj 2000 nezrelih eritrocitov na žival. Dodatne informacije se lahko pridobijo s štetjem zrelih eritrocitov z mikronukleusi. Pri analizi mikroskopskih preparatov naj delež nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti ne bo manjši od 20 % kontrolne vrednosti. Kadar se živali tretirajo nepretrgano štiri tedne ali več, se lahko določi tudi incidenca mikronukleusov v vsaj 2000 zrelih eritrocitih na žival. Sistemi za avtomatizirano analizo (slikovna analiza in pretočna citometrična analiza celičnih suspenzij) so sprejemljiva alternativa ročnemu določanju, če so ustrezno utemeljeni in validirani.

2. PODATKI

2.

2.1 OBDELAVA REZULTATOV Podatki za posamezne živali naj bodo prikazani v tabelah. Poskusna enota je žival. Za vsako analizirano žival posebej naj se navedejo število štetih nezrelih eritrocitov, število nezrelih eritrocitov z mikronukleusi in število nezrelih med vsemi eritrociti. Kadar se živali tretirajo nepretrgano štiri tedne ali več, se navedejo tudi podatki o zrelih eritrocitih, če so bili zbrani. Za vsako žival se navede delež nezrelih med vsemi eritrociti, in če je to primerno, odstotek eritrocitov z mikronukleusi. Če ni dokaza za razliko v odzivu med spoloma, se pri statistični analizi lahko združijo podatki za oba spola.

2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV Pozitivni rezultat se lahko določi na podlagi številnih meril, kakor je na primer z odmerkom povezano povečanje števila celic z mikronukleusi ali jasno povečanje števila celic z mikronukleusi v posamezni tretirani skupini ob posameznem vzorčenju. Najprej naj se preuči biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov preizkusa se kot pomoč lahko uporabijo statistične metode (18) (19). Statistična značilnost naj ne bo edini odločilni dejavnik za pozitivni odziv. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo navedenih meril, ni mutagena v tem preizkusu. Čeprav bo večina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki preprečili zanesljivo oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. Pozitivni rezultati preizkusa mikronukleusov pomenijo, da snov povzroča nastanek mikronukleusov, ki so posledica poškodb kromosomov ali mitotičnega aparata v eritroblastih preizkusne vrste. Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne povzroča nastanka mikronukelusov v nezrelih eritrocitih preizkusne vrste. Obravnava naj se verjetnost, da preizkušana snov ali njeni metaboliti dosežejo krvni obtok ali posebej tarčno tkivo (npr. sistemska toksičnost).

3. POROČANJE

3. POROČILO O PRESKUSU

Poročilo o preizkusu naj vsebuje naslednje informacije:

Topilo/nosilec:

utemeljitev izbire nosilca,

topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta znani,

Preizkusne živali:

uporabljena vrsta/sev,

število, starost in spol živali,

vir, pogoji bivanja, prehrana itd.,

teža posameznih živali na začetku preizkusa, skupaj z območjem telesne teže, srednjo vrednostjo in standardnim odklonom za vsako skupino.

Preizkusni pogoji:

podatki o pozitivnih in negativnih (nosilec/topilo) kontrolnih vzorcih,

podatki študij e za ugotavljanje območja, če je bila opravljena,

razlogi za izbiro velikosti odmerka,

podrobnosti o pripravi preizkušane snovi,

podrobnosti o dajanju preizkušane snovi,

razlogi za način dajanja,

metode za preverjanje, ali je preizkušana snov dosegla krvni obtok ali tarčno tkivo, če je to primerno,

način preračunavanja koncentracije preizkušane snovi v hrani/pitni vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je to primerno,

podrobnosti o kakovosti hrane in vode,

podroben opis programov tretiranja in vzorčenja,

metode priprave mikroskopskih preparatov,

metode merjenja toksičnosti,

merila za štetje nezrelih eritrocitov z mikronukleusi,

število analiziranih celic na žival,

merila za določitev, ali je študija pozitivna, negativna ali dvoumna.

Rezultati:

znaki toksičnosti,

delež nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti,

število nezrelih eritrocitov z mikronukleusi, navedeno za vsako žival posebej,

srednja vrednost ± standardni odklon nezrelih eritrocitov z mikronukleusi na skupino,

odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogoče,

uporabljene statistične analize in metode,

podatki o sočasni in pretekli negativni kontroli,

podatki o sočasni pozitivni kontroli.

— Diskusija rezultatov.

— Sklepi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)

LITERATURA Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, str. 187–190. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, str. 9–15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G., in Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, str. 61–118. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F., in Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, str. 29–80. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., in Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, v: Developments in Science and Practice of Toxicology, izd. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, str. 555–558. MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., in Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, str. 103–112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., in Shelby, M. E. (1990), The in Vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, str. 513–522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T., in Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, str. 245–249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, str. 83–98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, str. 53–159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S., in Vannier, B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, str. 293–304. Higashikuni, N., in Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, str. 313–319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J., in Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, str. 313–319. Hayashi, M., Sofumi, T., in Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, str. 241–247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., in Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, str. 269–275. Romagna, F., in Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, str. 91–104. Gollapudi, B., in McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, str. 97–99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., in Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, v: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Poročilo, del 1, pregledan, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115–141. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G., in Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (izd.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Poročilo, del III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 184–232.

B.13/14 MUTAGENOST: PREIZKUS POVRATNE MUTACIJE PRI BAKTERIJAH

B.13/14

1. METODA Ta metoda ustreza metodi OECD TG 471, Bacterial Reverse Mutation Test (1997).

1.

1.1 UVOD Pri preizkusu bakterijskih povratnih mutacij se sevi vrst Salmonella typhimurium in Escherichia coli, ki potrebujejo aminokisline, uporabljajo za odkrivanje točkovnih mutacij, ki vključujejo substitucijo, adicijo ali delecijo enega ali nekaj baznih parov DNA (1) (2) (3). Princip tega preizkusa bakterijskih povratnih mutacij je, da zazna mutacije, ki obrnejo mutacije v preizkusnih sevih in obnovijo funkcionalno sposobnost bakterij za sintezo osnovne aminokisline. Povratno mutirane bakterije se zaznajo po sposobnosti rasti v odsotnosti aminokisline, ki jo starševski preizkusni sev potrebuje. Točkovne mutacije so vzrok številnih genskih bolezni pri človeku in obstajajo tehtni dokazi, da so točkovne mutacije onkogenov in genov, zaviralcev rasti tumorjev somatskih celic, povezane z nastankom tumorjev pri človeku in poskusnih živalih. Preizkus bakterijskih povratnih mutacij je hiter, poceni in relativno lahko izvedljiv. Mnogi preizkusni sevi imajo več značilnosti, zaradi katerih so občutljivejši za zaznavanje mutacij, vključno z odzivnimi zaporedji DNA na mestih povratnih mutacij, povečano prepustnostjo celice za velike molekule in odstranitvijo DNA-popravljalnih mehanizmov ali okrepitvijo procesov popravljanja DNA, podvrženega napakam. Specifičnost preizkusnih sevov lahko da koristne informacije o vrstah mutacij, ki jih povzročijo genotoksične snovi. Na voljo je obsežna baza rezultatov za preizkuse bakterijskih povratnih mutacij za številne strukture in razvite so bile dobro uveljavljene metodologije za preizkušanje kemikalij z različnimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi, vključno s hlapnimi spojinami. Glej tudi splošni uvod dela B.

1.2 DEFINICIJE Preizkus povratnih mutacij pri vrsti Salmonella typhimurium ali Escherichia coli zazna mutacijo pri sevu, ki potrebuje aminokislino (histidin oziroma triptofan), s katero nastane sev, neodvisen od zunanje oskrbe z aminokislino. Mutageni substitucije baznih parov so snovi, ki povzročijo zamenjavo baz v DNA. Pri preizkusu povratne mutacije takšna zamenjava lahko nastane na mestu izvirne mutacije ali na drugem mestu bakterijskega genoma. Mutageni premika bralnega okvira so snovi, ki povzročijo adicijo ali delecijo enega ali več baznih parov DNA in tako spremenijo bralni okvir RNA.

1.3 ZAČETNI PREUDARKI Pri preizkusu bakterijskih povratnih mutacij se uporabljajo prokariontske celice, ki se od sesalskih razlikujejo v lastnostih, kakor so sprejemanje, presnova, kromsomska struktura in procesi popravljanja DNA. Za preizkuse, opravljene in vitro, so navadno potrebni zunanji viri aktivacije presnove. Sistemi aktivacije presnove in vitro ne morejo povsem posnemati razmer in vivo pri sesalcih. Preizkus torej ne daje neposrednih informacij o mutagenosti in rakotvornosti snovi pri sesalcih. Preizkus bakterijskih povratnih mutacij se splošno uporablja kot začetno presejanje za odkrivanje genotoksičnega delovanja in zlasti delovanja, ki povzroči točkovne mutacije. Obsežna baza podatkov je pokazala, da mnoge kemikalije, ki pri tem preizkusu dajo pozitivni rezultat, kažejo mutageno delovanje tudi pri drugih preizkusih. Obstajajo primeri mutagenov, ki jih ta preizkus ne zazna; razlogi za te pomanjkljivosti se lahko pripišejo posebni naravi zaznane končne točke, razlikam v aktivaciji presnove ali razlikam v biološki razpoložljivosti. Po drugi strani pa lahko dejavniki, ki povečajo občutljivost preizkusa bakterijskih povratnih mutacij, privedejo do precenitve mutagenega delovanja. Preizkus bakterijskih povratnih mutacij morda ne bo primeren za ocenjevanje nekaterih skupin nevarnih kemikalij, na primer močno baktericidnih spojin (npr. nekaterih antibiotikov) in tistih, za katere se domneva (ali ve), da motijo sistem podvojevanja prav v sesalskih celicah (npr. nekateri inhibitorji topoizomeraze in nekateri nukleozidni analogi). Pri takšnih primerih bi bili lahko bolj primerni preizkusi mutacij pri sesalcih. Čeprav so mnoge spojine, pri katerih je rezultat tega preizkusa pozitiven, rakotvorne snovi za sesalce, soodvisnost ni absolutna. Odvisna je od skupine nevarnosti kemikalije in obstajajo rakotvorne snovi, ki jih ta preizkus ne zazna, ker delujejo prek drugih mehanizmov, ki niso genotoksični, ali mehanizmov, ki jih v bakterijskih celicah ni.

1.4 PRINCIP PREIZKUSNE METODE Suspenzije bakterijskih celic se izpostavijo preizkušam snovi ob navzočnosti in ob odsotnosti zunanjega sistema za aktivacijo presnove. Pri metodi vključitve v ploščo se te suspenzije zmešajo s poltrdim gojiščem in takoj razlijejo po minimalnem gojišču. Pri metodi poprejšnje inkubacije se obdelovalna zmes inkubira in nato zmeša s poltrdim gojiščem pred nanosom na minimalno gojišče. Pri obeh tehnikah se po dveh ali treh dneh inkubacije preštejejo kolonije povratnih mutant in primerjajo s številom kolonij spontanih povratnih mutant na kontrolnih ploščah s topilom. Opisanih je nekaj postopkov za izvedbo preizkusa bakterijskih povratnih mutacij. Med splošno uporabljanimi so metoda vključitve v ploščo (1) (2) (3) (4), metoda poprejšnje inkubacije (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuacijska metoda (9) (10) in suspenzijska metoda (11). Opisane so tudi prilagoditve za preizkušanje plinov ali hlapov (12). Postopki, opisani v metodi, veljajo predvsem za metodo vključitve v ploščo in metodo poprejšnje inkubacije. Obe sta sprejemljivi za izvajanje preizkusa ob aktivaciji presnove in brez nje. Nekatere snovi se lahko učinkoviteje zaznajo z metodo poprejšnje inkubacije. Te snovi sodijo v skupine nevarnih kemikalij, ki vključujejo kratkoverižne alifatske nitrozamine, dvovalentne kovine, aldehide, azo barvila in diazo spojine, pirolizidinske alkaloide ter alil in nitro spojine (3). Priznano je tudi, da se pri uporabi standardnih postopkov, kakor sta metoda vključitve v ploščo ali metoda poprejšnje inkubacije, nekatere skupine mutagenov ne zaznajo vedno. Ti naj se obravnavajo kot posebni primeri in močno se priporoča, da se za njihovo zaznavanje uporabijo nadomestni postopki. Določijo se lahko naslednji posebni primeri (skupaj s primeri postopkov, ki bi se lahko uporabili za njihovo zaznavanje): azo barvila in diazo spojine (3) (5) (6) (13), plini in hlapne kemikalije (12) (14) (15) (16) ter glikozidi (17) (18). Odstopanje od standardnega postopka je treba znanstveno utemeljiti.

1.5 OPIS PRESKUSNE METODE

1.5

1.5.1 Priprave

1.5.1

1.5.1.1. Bakterije Sveže kulture bakterij se vzgojijo do pozne logaritemske faze ali zgodnje stacionarne faze rasti (približno 109 celic na ml). Kulture v pozni stacionarni fazi naj se ne uporabljajo. Kulture, ki se uporabijo v preizkusu, morajo obvezno imeti velik delež živih bakterij. Delež se lahko dokaže na podlagi podatkov o rastnih krivuljah iz preteklih kontrol ali pri vsakem preizkusu z določitvijo števila živih celic s štetjem na plošči. Priporočena temperatura inkubacije je 37 oC. Uporabi naj se vsaj pet sevov bakterij. Ti naj vključujejo štiri seve vrste S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 ali TA97a ali TA97; TA98 in TA100), za katere je bilo dokazano, da so zanesljivi in dajejo ponovljive rezultate med laboratoriji. Ti štirje sevi vrste S. typhimurium imajo na primarnem mestu povratne mutacije bazne pare GC in znana je možnost, da ne zaznajo nekaterih oksidirajočih mutagenov, prečnih povezovalcev in hidrazinov. Takšne snovi lahko zaznajo sevi E. coli WP2 ali S. typhimurium TA102 (19), ki imajo na primarnem mestu povratne mutacije bazni par AT. Priporočena kombinacija sevov je torej: Da bi se zaznali prečno povezovalni mutageni, bi bilo morda bolj primerno vključiti TA102 ali dodati sev E. coli, zmožen popravljanja DNA [npr. E. coli WP2 ali E. coli WP2 (pKM101)]. Uporabljajo naj se uveljavljeni postopki za pripravo založne kulture, preverjanje označevalcev in shranjevanje. Potreba po aminokislinah za rast naj se dokaže za vsak pripravek zamrznjene založne kulture (histidin za seve S. typhimurium in triptofan za seve E. coli). Podobno naj se preverijo druge fenotipske značilnosti, namreč: navzočnost ali odsotnost R-plazmidov, kadar je to primerno [tj. odpornost proti ampicilinu pri sevih TA98, TA100 in TA97a ali TA97, WP2 uvrA in WP2 uvrA (pKM101), in odpornost proti ampicilinu + tetraciklinu pri sevu TA 102G; navzočnost značilnih mutacij (tj. mutacije rfa pri S. typhimurium prek občutljivosti za kri stal vijolično in mutacije uvrA pri E. coli ali mutacije uvrB pri S. typhimurium prek občutljivosti za ultravijolično svetlobo) (2) (3). Število kolonij spontanih povratnih mutant pri sevih naj bo v območjih pogostnosti, pričakovanih glede na pretekle kontrolne podatke laboratorija, in po možnosti v območju, navedenem v literaturi.

S. typhimurium TA1535 in

S. typhimurium TA1537 ali TA97 ali TA97a in

S. typhimurium TA98 in

S. typhimurium TA100 in

E. coli WP2 uvrA, ali E. coli WP2 uvrA (pKM101), ali S. typhimurium TA102.

1.5.1.2 Gojišče Uporabljata se ustrezno minimalno gojišče (ki vsebuje npr. minimalno gojišče E po Vogel-Bonnerju in glukozo) in poltrdo gojišče, ki vsebuje histidin in biotin ali triptofan, da se omogoči nekaj delitev celic (1) (2) (9).

1.5.1.3 Aktivacija presnove Bakterije naj se izpostavijo preizkušam snovi ob navzočnosti in ob odsotnosti ustreznega sistema za aktivacijo presnove. Najpogosteje uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija z dodanim kofaktorjem (S9), pripravljena iz jeter glodavcev, ki so bila obdelana s sredstvi za encimsko indukcijo, kakor je Aroclor 1254 (1) (2), ali z zmesjo fenobarbitona in β-naftoflavona (18) (20) (21). Postmitohondrij ska frakcija se navadno uporablja v koncentracijah od 5 do 30 % v/v v zmesi S9. Izbira in stanje sistema za aktivacijo presnove sta lahko odvisna od skupine nevarnosti preizkušane kemikalije. Včasih je primerno uporabiti več kakor eno koncentracijo postmitohondrijske frakcije. Pri azo barvilih in diazo spojinah bo morda bolj primerno uporabiti redukcijski sistem aktivacije presnove (6) (13).

1.5.1.4 Preizkušana snov/priprava Trdne preizkušane snovi naj se pred obdelavo bakterij raztopijo ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, se razredčijo. Tekoče preizkušane snovi se lahko dodajo neposredno v preizkusni sistem in/ali se pred obdelavo razredčijo. Uporabljajo naj se sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo. Topilo/nosilec naj ne vzbuja suma, da kemično reagira s preizkušano snovjo, in naj bo združljivo s preživetjem bakterij in delovanjem S9 (22). Če se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vključitev podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporoča se, da se, kadar koli je to mogoče, kot prva možnost preuči uporaba vodnega topila/nosilca. Kadar se preizkušajo v vodi nestabilne snovi, naj se uporabijo brezvodna organska topila.

1.5.2 Preizkusni pogoji

1.5.2

1.5.2.1 Preizkusni sevi (glej 1.5.1.1)

1.5.2.2 Koncentracije izpostavljenosti Med merili, ki jih je treba upoštevati pri določanju največje uporabljene količine preizkušane snovi, so citotoksičnost in topnost v končni obdelovalni zmesi. Lahko je koristno, če se toksičnost in netopnost določita v poprejšnjem poskusu. Citotoksičnost se lahko zazna prek zmanjšanja števila kolonij povratnih mutant, čistine na bakterijskem ozadju ali zmanjšanja bakterijskega ozadja ali stopnje preživetja obdelanih kultur. Citotoksičnost snovi se lahko spremeni ob navzočnosti sistemov za aktivacijo presnove. Netopnost naj se oceni kot oborina v končni zmesi pri dejanskih pogojih preizkusa in naj bo vidna s prostim očesom. Priporočena največja preizkusna koncentracija za topne necitotoksične snovi je 5 mg/ploščo ali 5 μl/ploščo. Pri necitotoksičnih snoveh, ki niso topne pri koncentracijah 5 mg/ploščo ali 5 μl/ploščo, naj bo ena ali več preizkušenih koncentracij netopnih v končni obdelovalni zmesi. Preizkušane snovi, ki so citotoksične že pri koncentracijah, manjših od 5 mg/ploščo ali 5 ul/ploščo, naj se preizkušajo do citotoksične koncentracije. Oborina ne sme vplivati na štetje. Uporabi naj se vsaj pet različnih koncentracij preizkušane snovi, ki jih je mogoče analizirati, z intervalom približno pol log (tj. √10) med preizkusnimi točkami pri začetnem poskusu. Primerni so lahko manjši intervali, kadar se raziskuje odvisnost med koncentracijo in odzivom. Lahko se izvedejo preizkusi s koncentracijami, večjimi od 5 mg/ploščo ali 5 μl/ploščo, kadar se ocenjujejo snovi, ki vsebujejo znatne količine potencialno mutagenih nečistot.

1.5.2.3 Negativni in pozitivni kontrolni vzorci V vsak preizkus naj se vključijo sočasni pozitivni in negativni (topilo ali nosilec) kontrolni vzorci, specifični za sev, ob aktivaciji presnove in brez nje. Izberejo naj se koncentracije pozitivne kontrole, ki dokazujejo učinkovito izvedbo vsakega preizkusa. Pri preizkusih, pri katerih se uporabi sistem aktivacije presnove, naj se referenčna(-e) snov(-i) pozitivne kontrole izbere(-jo) na podlagi vrste uporabljenih bakterijskih sevov. Naslednje snovi so primeri ustreznih snovi pozitivne kontrole za preizkuse z aktivacijo presnove: Št. CAS Št. Einecs Snovi 781-43-1 212-308-4 9,10-dimetilantracen 57-97-6 200-359-5 7,12-dimetilbenzo(a) antracen 50-32-8 200-028-5 benzo[a]piren 613-13-8 210-330-9 2-aminoantracen 50-18-0 ciklofosfamid 6055-19-2 200-015-4 ciklofosfamid monohidrat Naslednja snov je ustrezna snov pozitivne kontrole za metodo redukcijske aktivacije presnove: Št. CAS Št. Einecs Snovi 573-58-0 209-358-4 Kongo rdeče 2-aminoantracen naj se ne uporablja kot edini kazalec učinkovitosti zmesi S9. Če se uporabi 2-aminoantracen, naj bo tudi za vsako serijo S9 značilen mutagen, ki potrebuje aktivacijo presnove z mikrosomskimi encimi, npr. benzo[a]piren, dimetilbenzo antracen. Naslednje snovi so primeri snovi pozitivne kontrole za posamezne seve, za preizkuse, izvedene brez zunanjega sistema aktivacije presnove: Št. CAS Št. Einecs Snovi Sev 26628-22-8 247-852-1 natrijev azid TA 1535 in TA 100 607-57-8 210-138-5 2-nitrofluoren TA 98 90-45-9 201-995-6 9-aminoakridin TA 1537, TA 97 in TA 97a 17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 in TA 97a 80-15-9 201-254-7 kumol hidroperoksid TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomicin C WP2 uvrA in TAl 02 70-25-7 200-730-1 N-metil-N-nitro-N-nitrozogvanidin WP2, WP2uvrA in WP2uvrA(pK M101) 56-57-5 200-281-1 4-nitrokinolin-1-oksid WP2, WP2uvrA in WP2uvrA(pK M101) 3688-53-7 furilfuramid (AF2) sevi s plazmidi Lahko se uporabijo druge ustrezne referenčne snovi pozitivne kontrole. Uporabijo naj se kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isto skupino nevarnosti kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo. Vključijo naj se negativni kontrolni vzorci, ki jih sestavlja le topilo ali nosilec brez preizkušane snovi, obdelani na enak način kakor obdelovalne skupine. Uporabijo se tudi neobdelani kontrolni vzorci, razen če pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo ne povzroča škodljivih ali mutagenih učinkov.

1.5.3 Postopek Pri metodi vključitve v ploščo (1) (2) (3) (4) brez aktivacije presnove se navadno 0,05 ml ali 0,1 ml preizkušane raztopine, 0,1 ml sveže bakterijske kulture (ki vsebuje približno 108 živih celic) in 0,5 ml sterilnega pufra zmeša z 2,0 ml poltrdega gojišča. Pri preizkusu z aktivacijo presnove se navadno 0,5 ml zmesi za aktivacijo presnove, ki vsebuje ustrezno količino postmitohondrijske frakcije (v območju od 5 do 30 % v/v v zmesi za aktivacijo presnove), zmeša s poltrdim gojiščem (2,0 ml) skupaj z bakterijami in preizkušano snovjo/raztopino. Vsebina vsake epruvete se premeša in razlije po površini plošče minimalnega gojišča. Pred inkubacijo naj se poltrdo gojišče strdi. Pri metodi poprejšnje inkubacije (2) (3) (5) (6) se preizkušana snov/raztopina inkubira skupaj s preizkusnim sevom (ki vsebuje približno 108 živih celic) in sterilnim pufrom ali sistemom za aktivacijo presnove (0,5 ml), navadno 20 minut ali več pri 30–37 oC, preden se zmeša s poltrdim gojiščem in razlije na površino plošče minimalnega gojišča. Navadno se 0,05 ali 0,1 ml preizkušane snovi/raztopine, 0,1 ml bakterij in 0,5 ml zmesi S9 ali sterilnega pufra zmeša z 2,0 ml poltrdega gojišča. Epruvete se med inkubacijo prezračujejo s stresalnikom. Za ustrezno oceno nihanja naj se za vsako velikost odmerka uporabijo tri plošče. Uporaba dveh plošč je sprejemljiva, kadar je znanstveno utemeljena. Občasna izguba plošče ne pomeni nujno neveljavnega preizkusa. Plinaste ali hlapne snovi naj se preizkušajo z ustreznimi metodami, na primer v zatesnjenih posodah (12) (14) (15) (16).

1.5.4 Inkubacija Vse plošče posameznega preizkusa naj se inkubirajo 48-72 ur pri 37 oC. Po inkubaciji se določi število kolonij povratnih mutant na ploščo.

2. PODATKI

2.

2.1 OBDELAVA REZULTATOV Podatki se prikažejo kot število kolonij povratnih mutant na ploščo. Navede se tudi število kolonij povratnih mutant na ploščah negativne (kontrolni vzorec s topilom in neobdelani kontrolni vzorec, če se uporabi) in pozitivne kontrole. Navedejo se število na posameznih ploščah, srednja vrednost števila kolonij povratnih mutant na ploščo in standardni odklon za preizkušano snov ter pozitivne in negativne (neobdelane in/ali s topilom) vzorce. Preverjanje jasnega pozitivnega odziva ni potrebno. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. Negativne rezultate je treba potrditi za vsak primer posebej. Kadar se pojmuje, da potrditev negativnih rezultatov ni potrebna, naj se to utemelji. V nadaljnjih poskusih naj se preuči možnost prilagoditve preizkusnih parametrov, da se razširi območje analiziranih pogojev. Preizkusni parametri, ki bi se lahko prilagodili, vključujejo intervale med koncentracijami, metodo obdelave (vključitev v ploščo ali poprejšnja inkubacija v suspenziji) in pogoje aktivacije presnove.

2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV Pozitivni rezultat se lahko določi na podlagi številnih meril, kakor sta na primer s koncentracijo povezano povečanje v preizkušanem območju in/ali ponovljivo povečanje števila kolonij povratnih mutant na ploščo pri eni ali več koncentracijah pri vsaj enem sevu s sistemom za aktivacijo presnove ali brez njega (23). Najprej naj se preuči biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov preizkusa se kot pomoč lahko uporabijo statistične metode (24). Vendar pa naj statistična značilnost ne bo edini odločilni dejavnik za pozitivni odziv. Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo navedenih meril, ni mutagena v tem preizkusu. Čeprav bo večina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki preprečili zanesljivo oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. Pozitivni rezultati preizkusa bakterijskih povratnih mutacij pomenijo, da snov povzroča točkovne mutacije z zamenjavo baz ali premikom bralnega okvira v genomu Salmonella typhimurium in/ali Escherichia coli. Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ni mutagena za preizkusno vrsto.

3. POROČANJE

3. POROČILO O PRESKUSU

Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije:

Topilo/nosilec:

utemeljitev izbire topila/nosilca,

topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta znani.

Sevi :

uporabljeni sevi,

število celic na kulturo,

značilnosti seva.

Preizkusni pogoji:

količina preizkušane snovi na ploščo (mg/ploščo ali μl/ploščo), skupaj z razlogi za izbiro odmerka in števila plošč na koncentracijo,

uporabljena gojišča,

vrsta in sestava sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili sprejemljivosti,

postopki obdelave.

Rezultati :

znaki toksičnosti,

znaki obarjanja,

število kolonij na posameznih ploščah,

srednja vrednost števila kolonij povratnih mutant na ploščo in standardni odklon,

odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogoče,

statistične analize, če so bile opravljene,

podatki o sočasni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni,

podatki o pretekli negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni.

Diskusija rezultatov.

Sklepi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)

LITERATURA Ames, B. N., McCann, J., in Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, str. 347–364. Maron, D. M., in Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, str. 173–215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S., in Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, str. 217–233. Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K., in Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, str. 69–240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T., in Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, str. 91–96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A., in Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, v: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, izd. Norpoth K. H., in Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, str. 273–285. Gatehouse, D. G, Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D., in Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, v: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS, del 1, pregledan, izd. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, str. 13–61. Aeschacher, H. U., Wolleb, U., in Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, str. 167–177. Green, M. H. L., Muriel, W. J., in Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, str. 33–42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D., in Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, v: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2. izdaja, izd. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W., in Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, str. 141–161. Thompson, E. D., in Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, str. 453–465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F., in Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, str. 335–344. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D., in Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, str. 33–47. Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T., in Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, str. 2–141. Simmon, V., Kauhanen, K., in Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges in F., Sobels (izd.) Elsevier, Amsterdam, str. 249–258. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G., in Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, str. 421–441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., in Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, str. 3780–3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A., in Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, str. 4961–4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J., in Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, str. 285–291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., in Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, v: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, izd. F. J. de Serres idr. Elsevier, North Holland, str. 85–88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., in Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, str. 175–177. Maron, D., Katzenellenbogen, J., in Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, str. 343–350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E., in Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, str. 83–91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D., in Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, v: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, del II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, izd. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, str. 28–65.

B.15 PRESKUS MUTAGENOSTI IN PRESEJALNA ŠTUDIJA RAKOTVORNOSTI GENSKA MUTACIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.15

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B.

1.2 OPREDELITEV POJMOV Glej Splošni uvod dela B.

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Za merjenje nastanka genskih mutacij, ki jih inducirajo kemijski povzročitelji z ali brez metabolne aktivacije, je mogoče uporabiti niz haploidnih in diploidnih sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae. Uporabljajo se sistemi napredne mutacije v haploidnih sevih, kot je merjenje mutacije rdečih mutant, ki potrebujejo adenin (ade-1, ade-2), v bele mutante, ki potrebujejo dvojni adenin, ter selektivni sistemi, kot je indukcija odpornosti proti kanavaninu in cikloheksimidu. Najširše validirani sistem povratne mutacije vključuje uporabo haploidnega seva XV 185-14C, ki nosi ochre nesmiselne mutacije ade 2–1, org 4–17, lys 1–1 in trp 5–48, ki so povratne z mutageni, ki povzročajo zamenjave baz, in inducirajo usmerjene mutacije ali ochre supresorske mutacije. XV 185-14C nosi tudi označevalec his 1–7, ki je drugače pomenska mutacija, v glavnem povratna z mutacijami na drugem mestu, ter označevalec hom 3–10, ki je povraten z mutageni, ki inducirajo mutacije tipa premik bralnega okvira. Pri diploidnih vrstah S. cerevisisae je edina široko uporabljana vrsta D7, ki je homozigotna za ilv 1–92.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6 Priprave

Raztopino preskusnih kemikalij in kontrolo je treba z uporabo ustreznega nosilca pripraviti tik pred preskusom. Če gre za v vodi netopne organske spojine, naj se ne uporabi več kot 2 % raztopina v/v organskih topil, kot so etanol, aceton ali dimetilsulfoksid (DMSO). Končna koncentracija nosilca ne sme bistveno vplivati na sposobnost preživetja celic in na značilnosti rasti.

Metabolna aktivacija

Celice je treba izpostaviti preskusnim kemikalijam v prisotnosti in v odsotnosti ustreznega eksogenega metabolnega aktivacijskega sistema. Najpogosteje uporabljeni sistem je s kofaktorjem dopolnjena post-mitohondrijalna frakcija iz jeter glodalcev, ki so bila prej tretirana s sredstvi, za encimsko indukcijo. Za metabolno aktivacijo je lahko ustrezna tudi uporaba drugih vrst, tkiv, post-mitohondrijalnih frakcij ali postopkov.

Preskusni pogoji

Preskusni sevi

V študijah genske mutacije sta najbolj uporabljana haploidni sev XV 185-14C in diploidni sev D7. Ustrezni so lahko tudi drugi sevi.

Gojišča

Za določitev preživetja celic in števila mutant se uporabijo ustrezna gojišča.

Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol

Pozitivno kontrolo, netretirano kontrolo in kontrolo topila je treba opraviti hkrati. Za vsak specifičen mutacijski ciljni učinek je treba uporabiti ustrezne kemikalije pozitivne kontrole.

Koncentracije izpostavljenosti

Uporabiti je treba najmanj pet ustrezno razporejenih koncentracij preskusne snovi. V primeru strupenih snovi pri najvišji koncentraciji preživetje ne sme pasti pod 5 do 10 %. Z relativno vodotopnimi snovmi je treba preskus opravljati do meje njihove topnosti z uporabo ustreznih postopkov. Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo določiti od primera do primera.

Inkubacijski pogoji

Plošče se inkubirajo štiri do sedem dni pri 28 do 30 oC v temi.

Frekvence spontanih mutacij

Uporabljati je treba subkulture s frekvencami spontanih mutacij znotraj dovoljenega razpona.

Število dvojnikov

Za analizo prototrofov, ki so nastali z gensko mutacijo, in sposobnosti preživetja celic je treba uporabiti najmanj tri ponovitvene plošče na koncentracijo. V primeru preskusov, pri katerih se uporabljajo označevalci, kot je hom 3-10 z nizko stopnjo mutacije, je treba za pridobitev statistično ustreznih podatkov število plošč povečati.

Postopek

Tretiranje sevov S. cerevisiae se običajno izvaja s preskusnim postopkom v tekoči suspenziji, ki zajema ali celice v stacionarni fazi ali rastoče celice. Začetne preskuse je treba opraviti na rastočih celicah: 1 - 5 × 10 celic/ml se izpostavi preskusni kemikaliji največ 18 ur pri 28 do 37 oC s tresenjem; če je primerno, se med tretiranjem doda ustrezna količina metabolnega aktivacij skega sistema. Na koncu tretiranja se celice centrifugirajo, sperejo in zasejejo na ustrezno gojišče. Po inkubaciji se plošče preštejejo za določitev preživetja in indukcije genske mutacije. Če je prvi preskus negativen, je treba drugi preskus opraviti z uporabo celic v stacionarni fazi. Če je prvi preskus pozitiven, se ga potrdi z ustreznim neodvisnim preskusom.

2. PODATKI Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je razvidno število preštetih kolonij, število mutant, preživetje in frekvenco mutant. Vse rezultate je treba potrditi z neodvisnim preskusom. Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statističnih metod.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Če je mogoče, se v poročilo o preskusu glede na tip izvajane študije vključijo naslednji podatki:

uporabljeni sev,

preskusni pogoji: celice v stacionarni fazi ali rastoče celice, sestava gojišč, inkubacijska temperatura in trajanje, metabolni aktivacijski sistem,

pogoji tretiranja: stopnje izpostavljenosti, postopek in trajanje tretiranja, temperatura tretiranja, pozitivna in negativna kontrola,

število preštetih kolonij, število mutant, preživetje in frekvenca mutantov, razmerje odmerek/odziv, če je primerno, statistična ocena podatkov,

obravnava rezultatov,

razlaga rezultatov.

3.2 OCENA IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B.

B.16 MITOTIČNA REKOMBINACIJA - SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B.

1.2 OPREDELITEV POJMOV Glej Splošni uvod dela B.

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Mitotično rekombinacijo v Saccharomyces cerevisiae je mogoče zaznati med geni (ali bolj splošno med genom in njegovo centromero) ali znotraj genov. Prvi primer se imenuje mitotični crossing-over in ustvarja recipročne produkte, medtem ko je drugi najpogosteje nerecipročen in se imenuje konverzija genov. Preskus crossing-over se običajno opravlja s proizvajanjem recesivnih homozigotnih kolonij ali sektorjev, ki nastanejo v heterozigotnem sevu, medtem ko se preskus konverzije genov opravlja s proizvodnjo prototrofnih revertant, ki nastanejo na avksotrofnem heteroalelnem sevu, ki nosi dva različna okvarjena alela istega gena. Najpogosteje uporabljani sevi za odkrivanje mitotične konverzije genov so D4 (heteroalelna na ade 2 in trp 5), D7 (heteroralelna na trp 5), BZ34 (heteroalelna na org 4) in JD1 (hetroalelna na his 4 in trp 5). Mitotični crossing-over, s katerim nastajajo rdeči in rožnati homozigotni sektorji, je mogoče določiti v D5 ali na D7 (ki meri tudi mitotično konverzijo genov in povratno mutacijo na ilv 1–92), pri čemer sta oba seva heteroalelna za komplementne alele ade 2.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6 Priprave

Raztopino preskusnih kemikalij ter kontrolo ali referenčne spojine je treba z uporabo ustreznega nosilca pripraviti tik pred preskusom. Če gre za v vodi netopne organske spojine, naj se ne uporabi več kot 2 % raztopina v/v organskih topil, kot so etanol, aceton ali dimetilsulfoksid (DMSO). Končna koncentracija nosilca ne sme bistveno vplivati na sposobnost preživetja celic in na značilnosti rasti.

Metabolna aktivacija

Celice je treba izpostaviti preskusnim kemikalijam v prisotnosti in v odsotnosti ustreznega eksogenega metabolnega aktivacijskega sistema. Najpogosteje uporabljeni sistem je s kofaktorjem dopolnjena post-mitohondrijalna frakcija iz jeter glodalcev, ki so bila prej tretirana s sredstvi za indukcijo encimov. Za metabolno aktivacijo je lahko ustrezna tudi uporaba drugih vrst, tkiv, post-mitohondrijalnih frakcij ali postopkov.

Preskusni pogoji

Preskusni sevi

Najpogosteje uporabljani sevi so diploidi D4, D5, D7 in JD1. Ustrezna je lahko tudi uporaba drugih sevov.

Gojišča

Za določitev preživetja celic in frekvence mitotične rekombinacije se uporabijo ustrezna gojišča.

Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol

Pozitivno kontrolo, netretirano kontrolo in kontrolo topila je treba opraviti hkrati. Za vsak specifični ciljni učinek rekombinacije je treba uporabiti ustrezne kemikalije pozitivne kontrole.

Koncentracije izpostavljenosti

Uporabiti je treba najmanj pet ustrezno razporejenih koncentracij preskusne snovi. Med dejavniki, ki jih je treba upoštevati, so citotoksičnost in topnost. Najnižja koncentracija ne sme imeti nikakršnega učinka na sposobnost preživetja celic. V primeru strupenih kemikalij preživetje pri najvišji koncentraciji ne sme pasti pod 5 do 10 %. Z relativno vodotopnimi snovmi je treba preskus opravljati do meje njihove topnosti z uporabo ustreznih postopkov. Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo določiti od primera do primera. Celice se lahko izpostavijo preskusnim kemikalijam ali v njihovi stacionarni fazi ali v času rasti za obdobje največ 18 ur. Za dolga obdobja tretiranja pa je treba kulture mikroskopsko pregledati za nastanek spor, katerih prisotnost bi razveljavila preskus.

Inkubacijski pogoji

Plošče se inkubira v temi štiri do sedem dni pri 28 do 30 oC. Plošče, uporabljene za analizo rdečih in rožnatih homozigotnih sektorjev, ki nastanejo z mitotičnim crossing-over, je treba hraniti v hladilniku (približno 4 oC) za nadaljnji dan ali dva pred štetjem, da se omogoči razvoj ustreznih pigmentiranih kolonij.

Frekvence spontane mitotične rekombinacije

Uporabiti je treba subkulture s frekvencami spontane mitotične rekombinacije znotraj dovoljenega normalnega razpona.

Število dvojnikov

Uporabiti je treba najmanj tri ponovitvene plošče na koncentracijo za analizo prototrofov, ki so nastali z mitotično konverzijo genov, in sposobnosti preživetja celic. V primeru preskusov recesivne homozigotnosti, ki nastane z mitotičnim (crossing-over, je treba število plošč povečati, da bi se dobilo ustrezno število kolonij.

Postopki

Obdelava sevov S. cerevisiae se običajno izvaja s preskusnim postopkom v tekoči suspenziji, ki zajema ali celice v stacionarni fazi ali rastoče celice. Začetne preskuse je treba opraviti na rastočih celicah: 1 – 5 × 107 celic/ml se izpostavi preskusni kemikaliji največ 18 ur pri 28 do 37 oC s tresenjem; če je primerno, se med tretiranjem doda ustrezna količina metabolnega aktivacijskega sistema. Na koncu tretiranja se celice centrifugirajo, sperejo in zasejejo na ustrezno gojišče. Po inkubaciji se plošče preštejejo za preživetje in indukcijo genske mutacije. Če je prvi preskus negativen, je treba ob uporabi celic v stacionarni fazi opraviti drugi preskus. Če je prvi preskus pozitiven, se ga potrdi z ustreznim neodvisnim preskusom.

2. PODATKI Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je razvidno število preštetih kolonij, število rekombinant, preživetje in frekvenca rekombinant. Rezultate je treba potrditi z neodvisnim preskusom. Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statističnih metod.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Če je mogoče, se v poročilo o preskusu glede na tip izvajane študije vključijo naslednji podatki:

uporabljeni sevi,

preskusni pogoji: celice v stacionarni fazi in rastoče celice, sestava gojišč, inkubacijska temperatura in trajanje, metabolni aktivacijski sistem,

pogoji tretiranja: stopnje izpostavljenosti, postopek in trajanje tretiranja, temperatura tretiranja, pozitivna in negativna kontrola,

število preštetih kolonij, število rekombinant, preživetje in frekvenca rekombinacije, razmerje odmerek/odziv, če je primerno, statistična ocena podatkov,

obravnava rezultatov,

razlaga rezultatov.

3.2 OCENA IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B.

B.17 MUTAGENOST – PREIZKUS GENSKIH MUTACIJ V CELICAH SESALCEV IN VITRO

B.17

1. METODA Ta metoda ustreza metodi OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).

1.

1.1 UVOD Preizkus genskih mutacij v celicah sesalcev in vitro se lahko uporablja za odkrivanje genskih mutacij, ki jih povzročajo kemične snovi. Primerne celične linije vključujejo celice limfoma miši L5178Y, linije celic kitajskega hrčka CHO, CHO-AS52 in V79 in človeške limfoblaste TK6 (1). V teh celičnih linijah najpogosteje uporabljane genske končne točke izmerijo mutacijo na lokusih za timidin-kinazo (TK) in hipoksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo (HPRT) in na transgenu za ksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo (XPRT). Preizkusi mutacij TK, HPRT in XPRT zaznajo različne vrste genskih pojavov. Lokacija TK in XPRT na avtosomih lahko omogoči zaznavo genskih pojavov (npr. obsežnih delecij), ki se ne zaznajo na lokusu za HPRT na X kromosomih (2) (3) (4) (5) (6). Pri preizkusu genskih mutacij v celicah sesalcev in vitro se lahko uporabijo kulture trajnih celičnih linij ali celičnih sevov. Uporabljene celice se izberejo na podlagi zmožnosti rasti v kulturi in stabilnosti pogostnosti spontanih mutacij. Za preizkuse, opravljene in vitro, so navadno potrebni zunanji viri aktivacije presnove. Takšen sistem aktivacije presnove ne more povsem posnemati razmer in vivo pri sesalcih. Treba je paziti, da se prepreči nastanek razmer, ki bi vodile do rezultatov, ne izražajočih prave mutagenosti. Pozitivni rezultati, ki ne izražajo prave mutagenosti, so lahko posledica sprememb pH, osmolarnosti ali visoke ravni citotoksičnosti (7). Ta preizkus se uporablja za iskanje možnih mutagenov in rakotvornih snovi za sesalce. Mnoge spojine, pri katerih je rezultat tega preizkusa pozitiven, so rakotvorne snovi za sesalce; vendar pa soodvisnost med tem preizkusom in rakotvornostjo ni popolna. Odvisna je od skupine nevarnosti kemikalije in vedno več je dokazov, da obstajajo rakotvorne snovi, ki jih ta preizkus ne zazna, ker, kakor kaže, delujejo prek drugih mehanizmov, ki niso genotoksični, ali mehanizmov, ki jih v sesalskih celicah ni (6). Glej tudi splošni uvod dela B.

1.2 DEFINICIJE Napredna mutacija: genska mutacija starševskega tipa mutirane oblike, ki povzroči spremembo ali izgubo encimskega delovanja kodirane beljakovine. Mutageni substitucije baznih parov: snovi, ki povzročijo zamenjavo ene ali več baznih parov v DNA. Mutageni premika bralnega okvira: snovi, ki povzročijo adicijo ali delecij o enega ali več baznih parov v molekuli DNA. Čas izražanja fenotipa: obdobje, v katerem se nespremenjeni genski produkti odstranijo iz na novo mutiranih celic. Pogostnost mutant: število opaženih mutiranih celic, deljeno s številom živih celic. Relativna skupna rast: povečanje števila celic v časovnem obdobju v primerjavi s kontrolno populacijo celic; izračunano kot zmnožek rasti v suspenziji glede na negativno kontrolo in učinkovitosti kloniranja glede na negativno kontrolo. Relativna rast v suspenziji: povečanje števila celic v obdobju izražanja glede na negativno kontrolo. Sposobnost preživetja: učinkovitost tvorbe klonov obdelanih celic v času nasaditve v selektivnih pogojih po času izražanja. Preživetje: učinkovitost tvorbe klonov obdelanih celic, ko se nasadijo na ploščo ob koncu obdelave; preživetje se navadno izraža v odvisnosti od preživetja kontrolne populacije celic.

1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE Celice brez timidin-kinaze (TK) so zaradi mutacije TK+/- -> TK-/- odporne proti citotoksičnim učinkom pirimidinskega analoga trifluorotimidina (TFT). Celice s timidin-kinazo so občutljive za TFT, ki zavira celično presnovo in ustavi celično delitev. Mutirane celice so tako sposobne množitve v navzočnosti TFT, medtem ko normalne celice, ki vsebujejo timidin-kinazo, to niso. Podobno se celice brez HPRT ali XPRT selekcionirajo z odpornostjo proti 6-tiogvaninu (TG) ali 8-azogvaninu (AG). Lastnosti preizkušane snovi naj se skrbno preučijo, če se v katerem koli od preizkusov genskih mutacij v celicah sesalcev preizkuša bazni analog ali spojina, sorodna selektivni snovi. Preuči naj se na primer vsaka domnevna selektivna toksičnost preizkušane snovi za mutirane in nemutirane celice. Treba je potrditi učinkovitost selekcijskega sistema/snovi, kadar se preizkušajo kemikalije, ki so po strukturi sorodne selektivni snovi (8). Celice v suspenziji ali enoplastni kulturi se za ustrezno časovno obdobje izpostavijo preizkušam snovi, ob aktivaciji presnove in brez nje, in se kultivirajo na novem gojišču, da se določi citotoksičnost in se omogoči izražanje fenotipa pred selekcijo mutant (9) (10) (11) (12) (13). Citotoksičnost se navadno določi z merjenjem relativne učinkovitosti tvorbe klonov (preživetje) ali relativne skupne rasti kultur po obdelovanju. Obdelovane kulture se vzdržujejo na rastnem gojišču dovolj dolgo obdobje, značilno za vsak izbran lokus in vrsto celic, ki omogoči skoraj optimalno izražanje fenotipa induciranih mutacij. Pogostnost mutant se določi z nasaditvijo znanega števila celic v gojišče s selektivno snovjo, da se zaznajo mutirane celice, in v gojišče brez selektivne snovi, da se določi učinkovitost tvorbe klonov (sposobnost preživetja). Po ustrezno dolgi inkubaciji se preštejejo kolonije. Pogostnost mutant se izračuna iz števila mutiranih kolonij v selektivnem gojišču in iz števila kolonij v neselektivnem gojišču.

1.4 OPIS PRESKUSNE METODE

1.4

1.4.1 Priprave

1.4.1

1.4.1.1 Celice Na voljo je več vrst celic, ki se lahko uporabijo pri tem preizkusu, skupaj s subkloni celic L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 ali TK6. Za vrsto celic, uporabljeno pri tem preizkusu, naj bodo dokazane občutljivost za kemične mutagene, velika učinkovitost tvorbe klonov in stabilna pogostnost spontanih mutacij. Preveri naj se, ali celice niso okužene z mikoplazmo, in če so, naj se ne uporabijo. Preizkus naj bo načrtovan tako, da bosta njegova občutljivost in moč vnaprej določeni. Število uporabljenih celic, kultur in koncentracij preizkušane snovi naj izraža te določene parametre (14). Najmanjše število živih celic, ki preživijo obdelovanje in se uporabijo v vsaki fazi preizkusa, naj temelji na pogostnosti spontanih mutacij. Splošno vodilo je, da se uporabi število celic, ki je vsaj 10-kratna recipročna vrednost pogostnosti spontanih mutacij. Vendar se priporoča, da se uporabi vsaj 106 celic. Na voljo naj bodo zadovoljivi pretekli podatki o uporabljenem celičnem sistemu, ki kažejo na dosledno učinkovitost preizkusa.

1.4.1.2 Gojišče in pogoji kultiviranja Uporabijo naj se ustrezna gojišča za kulture in pogoji inkubacije (posode za kulture, temperatura, koncentracija CO2 in vlažnost). Gojišča naj se izberejo glede na selektivne sisteme in vrsto celic, ki se uporabijo v preizkusu. Posebej pomembno je, da se izberejo takšni pogoji kultiviranja, ki zagotavljajo optimalno rast celic v času izražanja in sposobnost tvorjenja kolonij mutiranih, pa tudi nemutiranih celic.

1.4.1.3 Priprava kultur Celice se namnožijo iz založnih kultur, nasadijo v gojišče in inkubirajo pri 37 oC. Pred uporabo v tem preizkusu bo morda iz kultur treba odstraniti že obstoječe mutirane celice.

1.4.1.4 Aktivacija presnove Celice naj se izpostavijo preizkušam snovi ob navzočnosti in ob odsotnosti ustreznega sistema za aktivacijo presnove. Najpogosteje uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija z dodanim kofaktorjem (S9), pripravljena iz jeter glodavcev, ki so bila obdelana s sredstvi za encimsko indukcijo, kakor je Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18), ali z zmesjo fenobarbitona in β-naftoflavona (19) (20). Postmitohondrijska frakcija se navadno uporablja v koncentracijah 1–10 % v/v v končnem preizkusnem gojišču. Izbira in stanje sistema za aktivacijo presnove sta lahko odvisna od skupine nevarnosti preizkušane kemikalije. Včasih je primerno uporabiti več kakor eno koncentracijo postmitohondrijske frakcije. Vrsta razvojnih dosežkov lahko skupaj s pridobivanjem gensko spremenjenih celičnih linij, v katerih se izražajo geni za točno določene aktivirajoče encime, daje možnosti za endogeno aktivacijo. Izbira uporabljenih celičnih linij naj bo znanstveno utemeljena (npr. s pomembnostjo izoencima citokrom P450 za presnovo preizkušane snovi).

1.4.1.5 Priprava preizkušane snovi Trdne preizkušane snovi naj se pred obdelavo celic raztopijo ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, se razredčijo. Tekoče preizkušane snovi se lahko dodajo neposredno v preizkusni sistem in/ali pred obdelavo razredčijo. Uporabljajo naj se sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.

1.4.2 Preizkusni pogoji

1.4.2

1.4.2.1 Topilo/nosilec Topilo/nosilec naj ne vzbuja suma, da kemično reagira s preizkušano snovjo, in naj bo združljivo s preživetjem celic in delovanjem S9. Če se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vključitev podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporoča se, da se, kadar koli je to mogoče, kot prva možnost preuči uporaba vodnega topila/nosilca. Kadar se preizkušajo v vodi nestabilne snovi, naj se uporabijo brezvodna organska topila. Voda se lahko odstrani z molekulskim sitom.

1.4.2.2 Koncentracije izpostavljenosti Med merili, ki jih je treba upoštevati pri določanju najvišje koncentracije, so citotoksičnost, topnost v preizkusnem sistemu in spremembe v pH ali osmolarnosti. Citotoksičnost naj se določi ob aktivaciji presnove in brez nje v glavnem poskusu z uporabo ustreznega kazalca celične neokrnjenosti in rasti, kakor sta relativna učinkovitost tvorbe klonov (preživetje) ali relativna skupna rast. Lahko je koristno, če se citotoksičnost in topnost določita v poprejšnjem poskusu. Uporabijo naj se vsaj štiri koncentracije, ki jih je mogoče analizirati. Pri citotoksičnosti naj te koncentracije zajemajo območje od največje toksičnosti do majhne toksičnosti ali netoksičnosti; to bo navadno pomenilo, da razlika med koncentracijami ne bo smela biti večja od faktorja med 2 in √10. Če največja koncentracija temelji na citotoksičnosti, naj povzroči približno 10–20 % (vendar ne manj kakor 10 %) relativno preživetje (relativna učinkovitost tvorbe klonov) ali relativno skupno rast. Za sorazmerno necitotoksične snovi naj bo največja preizkušana koncentracija 5 mg/ml, 5μl/ml oziroma 0,01 M, tista, ki je najnižja. Sorazmerno netopne snovi naj se preizkušajo do ali prek meje topnosti v pogojih kultiviranja. Netopnost naj se določi v končnem obdelovalnem gojišču, kateremu so izpostavljene celice. Lahko je koristno oceniti topnost na začetku in na koncu obdelave, saj se topnost med izpostavitvijo v preizkusnem sistemu lahko spremeni zaradi navzočnosti celic, S9, seruma itn. Netopnost se lahko zazna s prostim očesom. Oborina ne sme vplivati na štetje.

1.4.2.3 Kontrolni vzorci V vsak poskus naj se vključijo sočasni pozitivni in negativni (topilo ali nosilec) kontrolni vzorci, ob aktivaciji presnove in brez nje. Kadar se uporabi aktivacija presnove, mora biti kemikalija pozitivne kontrole tista, pri kateri je za mutageni odziv potrebna aktivacija. Primeri snovi pozitivne kontrole vključujejo: Stanje aktivacije presnove Lokus Snov Št. CAS Št. Einecs Ni zunanje aktivacije presnove HPRT etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozosečnina 759-73-9 212-072-2 TK (majhne in velike kolonije) metil metansulfonat 66-27-3 200-625-0 XPRT etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etil-N-nitrozosečnina 759-73-9 212-072-2 Zunanja aktivacija presnove HPRT 3-metilholantren 56-49-5 200-276-4 N-dimetil nitrozamin 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetilbenzoantracen 57-97-6 200-359-5 TK (majhne in velike kolonije) ciklofosfamid 50-18-0 200-015-4 ciklofosfamidmonohidrat 6055-19-2 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 3-metilholantren 56-49-5 200-276-5 XPRT N-dimetil nitrozamin(pri velikih koncentracijah S-9) 62-75-9 200-549-8 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 Lahko se uporabijo druge ustrezne referenčne snovi pozitivne kontrole, npr. če ima laboratorij bazo preteklih podatkov za 5-bromo 2'-dioksiuridin (št. CAS 59-14-3, št. Einecs 200-415-9), se lahko uporabi tudi ta referenčna snov. Uporabijo naj se kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isto skupino nevarnosti kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo. Vključijo naj se negativni kontrolni vzorci, ki jih sestavlja le topilo ali nosilec v obdelovalnem gojišču, obdelani enako kakor obdelovane skupine. Uporabijo se tudi neobdelani kontrolni vzorci, razen če pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo ne povzroča škodljivih ali mutagenih učinkov.

1.4.3 Postopek

1.4.3

1.4.3.1 Obdelava s preizkušano snovjo Množeče se celice naj se izpostavijo preizkušam snovi ob aktivaciji presnove in brez nje. Čas izpostavljenosti naj bo ustrezno dolg (navadno zadostuje 3-6 ur). Čas izpostavljenosti lahko traja en celični ciklus ali več. Pri vsaki preizkušeni koncentraciji se lahko obdelata dve vzporedni kulturi ali le ena. Kadar se uporabi le ena kultura, naj se poveča število koncentracij, da se zagotovi zadostno število kultur za analizo (npr. vsaj osem koncentracij, ki jih je mogoče analizirati). Uporabita naj se dve vzporedni kulturi negativne (topilo) kontrole. Plinaste ali hlapne snovi naj se preizkušajo z ustreznimi metodami, na primer v zatesnjenih posodah za kulture (21) (22).

1.4.3.2 Merjenje preživetja, sposobnosti preživetja in pogostnosti mutant Ob koncu izpostavljenosti se celice sperejo in kultivirajo, da se določi preživetje in omogoči izražanje fenotipa mutant. Merjenje citotoksičnosti z določanjem relativne učinkovitosti tvorbe klonov (preživetje) ali relativne skupne rasti kultur se navadno začne po obdelovanju. Vsak lokus potrebuje določen najmanjši čas za skoraj optimalno izrazitev fenotipa na novo induciranih mutacij (HPRT in XPRT potrebujeta vsaj 6-8 dni, TK pa vsaj 2 dni). Celice naj se gojijo na gojišču s selektivno(-imi) snovjo(-mi) in na gojišču brez takšnih snovi, da se določita število mutant in učinkovitost tvorbe klonov. Merjenje sposobnosti preživetja (ki se uporabi za izračun pogostnosti mutant) se začne ob koncu časa izražanja z nasaditvijo v neselektivno gojišče. Če da preizkušana snov pri preizkusu L5178Y TK+/- pozitiven rezultat, naj se pri vsaj eni od preizkusnih kultur (največja pozitivna koncentracija) ter pri negativnih in pozitivnih kontrolnih vzorcih kolonije razvrstijo po velikosti. Če da preizkušana snov pri preizkusu L5178Y TK+/- negativen rezultat, naj se kolonije razvrstijo po velikosti pri negativnih in pozitivnih kontrolnih vzorcih. Razvrstitev kolonij po velikosti se lahko izvede tudi pri študijah, pri katerih se uporabi TK6TK+/-.

2. PODATKI

2.

2.1 OBDELAVA REZULTATOV Podatki naj vključujejo citotoksičnost in sposobnost preživetja, število kolonij in pogostnost mutant za obdelane in kontrolne kulture. Pri pozitivnem odzivu pri preizkusu L5178Y TK+/- se kolonije štejejo z upoštevanjem merila velikih in majhnih kolonij pri vsaj eni od koncentracij preizkušane snovi (največja pozitivna koncentracija) ter pri negativni in pozitivni kontroli. Molekularne in citogenetske lastnosti mutant z velikimi in majhnimi kolonijami so bile podrobno raziskane (23) (24). Pri preizkusu TK+/- se kolonije štejejo z upoštevanjem merila kolonij z normalno rastjo (velike) in počasno rastjo (majhne) (25). Mutirane celice z najobsežnejšimi genskimi poškodbami imajo daljši podvojitveni čas in zato sestavljajo majhne kolonije. Obseg poškodb se giblje od izgube celega gena do kromosomskih aberacij, vidnih pri kari otipu. Nastanek mutant z majhnimi kolonijami se povezuje s kemikalijami, ki povzročajo obsežne kromosomske aberacije (26). Manj resno prizadete mutirane celice rastejo s podobno hitrostjo kakor starševske celice in sestavljajo velike kolonije. Navede naj se preživetje (relativna uspešnost tvorbe klonov) ali relativna skupna rast. Pogostnost mutant naj se izrazi kot število mutiranih celic na število preživelih celic. Navedejo se podatki za posamezne kulture. Vsi podatki naj bodo povzeti v tabelah. Preverjanje jasnega pozitivnega odziva ni potrebno. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. Negativne rezultate je treba potrditi za vsak primer posebej. Kadar se pojmuje, da potrditev negativnih rezultatov ni potrebna, naj se to utemelji. Pri dvoumnih ali negativnih rezultatih naj se v nadaljnjih poskusih preuči možnost prilagoditve preizkusnih parametrov, da se razširi območje analiziranih pogojev. Preizkusni parametri, ki bi se lahko prilagodili, vključujejo intervale med koncentracijami in pogoje aktivacije presnove.

2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV Pozitivni rezultat se lahko določi na podlagi številnih meril, kakor je na primer s koncentracijo povezano povečanje ali ponovljivo povečanje pogostnosti mutant. Najprej naj se preuči biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov preizkusa se kot pomoč lahko uporabijo statistične metode. Statistična značilnost naj ne bo edini odločilni dejavnik za pozitivni odziv. Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo navedenih meril, ni mutagena v tem sistemu. Čeprav bo večina študij dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki preprečili zanesljivo oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. Pozitivni rezultati preizkusa genskih mutacij v celicah sesalcev in vitro pomenijo, da preizkušana snov povzroča genske mutacije v uporabljenih kultiviranih sesalskih celicah. Ponovljiv rezultat pri koncentraciji s pozitivnim odzivom je najbolj pomemben. Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne povzroča genskih mutacij v uporabljenih kultiviranih sesalskih celicah.

3. POROČANJE

3. POROČILO O PRESKUSU

Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije:

Topilo/nosilec:

utemeljitev izbire nosilca/topila;

topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta znani.

Celice:

vrsta in vir celic,

število celičnih kultur,

število pasaž celic, če je to primerno,

metode vzdrževanja celične kulture, če je to primerno,

odsotnost mikoplazme.

Preizkusni pogoji:

razlogi za izbiro koncentracij in števila kultur, tudi npr. podatki o citotoksičnosti in mejah topnosti, če so na voljo,

sestava gojišč, koncentracija CO2,

koncentracija preizkušane snovi,

volumen dodanega nosilca in preizkušane snovi,

temperatura inkubacije,

čas inkubacije,

trajanje obdelave,

gostota celic med obdelavo,

vrsta in sestava sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili sprejemljivosti,

pozitivni in negativni kontrolni vzorci,

dolžina časa izražanja (skupaj s številom nasajenih celic ter programom kultiviranja na novem gojišču in dodajanja hranil, če je to primerno),

selektivne snovi,

merila za določitev, ali je preizkus pozitiven, negativen ali dvoumen,

uporabljene metode za določanje števila živih in mutiranih celic,

opredelitev, katera velikost in tip kolonij se upoštevata (vključno z merili za majhne in velike kolonije, če je to primerno).

Rezultati:

znaki toksičnosti,

znaki obarjanja,

podatki o pH in osmolarnosti med izpostavljenostjo preizkusni snovi, če sta bila določena,

velikost kolonij, če je določena, vsaj za negativne in pozitivne kontrolne vzorce,

usposobljenost laboratorija za zaznavanje mutant z majhnimi kolonijami pri sistemu L5178Y TK+/-, kadar je to primerno,

odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogoče,

statistične analize, če so bile opravljene,

podatki o sočasni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli,

podatki o pretekli negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni,

pogostnost mutant.

Diskusija rezultatov.

Sklepi.

4.(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)

LITERATURA Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y., in Mailing H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, str. 1306–1312. Liber, H. L., in Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, str. 467–485. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, str. 394–403. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, str. 121–128. Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, str. 235–239. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, str. 147–204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, str. 225–251. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, str. 17–36. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, str. 135–141. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, str. 9–17. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, str. 133–147. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, str. 239–268. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, str. 66–101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, str. 365–373. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, str. 347–364. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, str. 61–108. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 173–215. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254 – Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, str. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Clive, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute Mavournin, Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. 225-251. Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, str. 85–88. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tiče, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, str. 91–103. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, str. 795–801. Applegate, M.L., Cell/Hypoxanthine-Guanine M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, str. 51–55. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C, Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFT1) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, str. 161–174. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). ICR Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal 191-Induced in Human Cells. Mutation Res., 229, str. 89–102. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency L5178Y/TK+/- Small-Colony TK+/- Mutant Frequency in L5178Y/TK+/--3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, str. 609–614.

B.18 OKVARE IN POPRAVLJANJE DNK – NENAČRTNA SINTEZA DNK – SESALSKE CELICE IN VITRO

B.18

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B.

1.2 OPREDELITEV POJMOV Glej Splošni uvod dela B.

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Preskus nenačrtne sinteze DNK meri repaturno sintezo DNK po izrezu in odstranitvi dela DNK, ki vsebuje mesto okvare, ki so jo inducirali kemijski in fizikalni povzročitelji. Preskus temelji na vključitvi timidina, označenega s tritijem (3H-TdR), v DNK sesalskih celic, ki niso v fazi S celičnega ciklusa. Sprejem H-TdR se lahko določi z avtoradiografijo ali tekočinskim scintilacijskim štetjem (LSC) DNK iz tretiranih celic. Sesalske celice v kulturi, razen če se ne uporabljeni primarnih podganjih hepatocitov, se tretirajo s preskusnim sredstvom z ali brez eksogenega metabolnega aktivacijskega sistema. Nenačrtno sintezo DNK je mogoče meriti tudi v in vivo sistemih.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6 Priprave

Preskusne kemikalije in kontrolne ali referenčne snovi je treba pripraviti na rastnem gojišču ali pa raztopiti ali suspendirati v ustreznih nosilcih ter nato še nadalje razredčiti v rastnem gojišču za uporabo v preskusu. Končna koncentracija nosilca naj ne vpliva na sposobnost preživetja celic. V preskusu je mogoče uporabiti primarne kulture podganjih hepatocitov, človeške limfocite ali stabilizirane celične linije (npr. človeške diploidne fibroblaste). Celice je treba izpostaviti preskusni kemikaliji v prisotnosti in v odsotnosti ustreznega metabolnega aktivacij skega sistema.

Preskusni pogoji

Število kultur

Za vsako preskusno točko sta potrebni najmanj dve celični kulturi za avtoradiografijo in šest kultur (ali manj, če je to znanstveno utemeljeno) za določitev nenačrtne sinteze DNK s tekočinskim scintilacijskim štetjem.

Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol

V vsak preskus je treba hkrati vključiti pozitivne in negativne (netretirane in/ali kontrole nosilca) kontrole z in brez metabolne aktivacije. Primeri pozitivnih kontrol za preskus podganjih hepatocitov vključujejo 7,12- dimetil benzantracen (7,12-DMBA) ali 2-acetilaminofluoren (2-AAF). V primeru stabiliziranih celičnih linij je 4-nitrokinolin-N-oksid (4-NQO) primer pozitivne kontrole za avtoradiografski preskus in preskus tekočinskega scintilacijskega štetja, ki sta opravljena brez metabolne aktivacije; N-dimetil nitrosamin je primer spojine pozitivne kontrole kadar se uporabi metabolni aktivacijski sistem.

Koncentracije izpostavljenosti

Uporabiti je treba več koncentracij preskusne snovi v območju, ustreznem za opredelitev odziva. Najvišja koncentracija mora sprožiti nekaj citotoksičnih učinkov. Snovi, relativno netopne v vodi, je treba preskušati do meje njihove topnosti. Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo preskusne kemikalije določiti od primera do primera.

Celice

Za vzdrževanju kultur je treba uporabiti ustrezno rastno gojišče, CO2 koncentracijo, temperaturo in vlažnost. Stabilizirane celične linije je treba redno preverjati za okužbo z mikoplazmo.

Metabolna aktivacija

Sistem metabolne aktivacij e se s kulturami primarnih hepatocitov ne uporablja. Stabilizirane celične linije in limfociti se izpostavijo preskusni snovi v prisotnosti in v odsotnosti ustreznega metabolnega aktivacij skega sistema.

Postopek

Priprava kultur

Stabilizirane celične linije se pridobijo iz založnih kultur (npr. s tripsinizacijo ali z otresanjem), nacepljenih v posodah za kulture v primerni gostoti in inkubiranih pri 37 oC. Kratkotrajne kulture podganjih hepatocitov se določijo tako, da se sveže ločenim hepatocitom v ustreznem gojišču omogoči pritrditev na rastno podlago. Kulture človeških limfocitov se pripravijo z uporabo ustreznih tehnik.

Tretiranje kultur s preskusno snovjo Primarni podganji hepatociti

Sveže izolirane podganje hepatocite se primerno dolgo tretira s preskusno snovjo na gojišču, ki vsebuje 3H-TdR. Na koncu obdobja tretiranja je treba celice odstraniti z gojišča, in ji nato sprati, fiksirati in posušiti. Stekelca je treba potopiti v avtoradiografsko emulzijo (kot alternativo se lahko uporabi tudi odstranjevalni film), izpostaviti, razviti, obarvati in prešteti.

Stabilizirane celične linije in limfociti

Avtoradiografske tehnike: celične kulture se ustrezno dolgo izpostavijo preskusni snovi, čemur sledi tretiranje s 3H-TdR. Čas določa narava snovi, aktivnost metabolnih sistemov in tip celic. Da bi odkrili vrhunec nenačrtne sinteze DNK, je treba 3H-TdR dodati bodisi istočasno s preskusno snovjo bodisi nekaj minut po izpostavljenosti preskusni snovi. Na izbiro med tema dvema postopkoma bodo vplivale možne interakcije med preskusno snovjo in 3H-TdR. Da bi ločili med nenačrtno sintezo DNK in semikonzervativnim podvajanjem DNK je mogoče slednje inhibirati, na primer, z uporabo gojišča brez arginina, nizke vsebnosti seruma ali hidroksiuree na gojišču. Meritve nenačrtne sinteze DNK s tekočinskim scintilacijskim štetjem: Pred tretiranjem s preskusno snovjo je treba vstop celic v fazo S blokirati, kot je opisano zgoraj; celice je nato treba izpostaviti preskusni kemikaliji, kot je opisano v primeru avtoradiografije. Na koncu inkubacijskega obdobja je treba DNK ekstrahirati iz celic in določiti celotno vsebino DNK ter obseg vključitve 3H-TdR. Treba je upoštevati, da je pri uporabi človeških limfocitov v zgoraj navedenih tehnikah preprečevanje semikonzervativega podvajanja DNK v nestimuliranih kulturah nepotrebno.

Analiza

Avtoradiografske določitve

Pri določanju nenačrtne sinteze DNK v celicah v kulturi se jedra faze S ne štejejo. Prešteti je treba najmanj 50 celic na koncentracijo. Stekelca je treba kodirati pred štetjem. Na vsakem stekelcu je treba prešteti več široko ločenih poljubnih polj. Količino vključenega 3H-TdR v citoplazmi je treba določiti s preštevanjem treh področij velikosti jedra v citoplazmi vsake preštete celice.

Določitve s tekočinskim scintilacijskim štetjem

Pri določanju nenačrtne sinteze DNK s tekočinskim scintilacijskim štetjem je treba pri vsaki koncentraciji in v kontrolah uporabiti ustrezno število kultur. Vse rezultate je treba potrditi v neodvisnem preskusu.

2. PODATKI Podatki se povzamejo v obliki tabele.

2.

2.1 AVTORADIOGRAFSKE DOLOČITVE Obseg vključitve 3H-TdR v citoplazmi in število zrnc, najdenih na celičnem jedru, je treba zabeležiti posebej. Za opis porazdelitve obsega vključitve 3H-TdR v citoplazmi in število zrnc na jedro se lahko uporabi sredina, mediana in modus.

2.2 DOLOČITVE S TEKOČINSKIM SCINTILACIJSKIM ŠTETJEM Za namen določitev s tekočinskim scintilacijskim štetjem je treba vključitev 3H-TdR prikazati kot dpm/μg DNK. Srednja vrednost dpm/μg DNK s standardno deviacijo se lahko uporabi za opis porazdelitve vključitve. Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statističnih metod.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Če je mogoče, se v poročilo o preskusu glede na tip izvajane študije vključijo naslednji podatki:

uporabljene celice, gostoto in število pasaž v času obdelave, število celičnih kultur,

uporabljene metode za vzdrževanje celičnih kultur, vključno z gojiščem, temperaturo in koncentracijo CO2,

preskusna snov, nosilec, koncentracije in utemeljitev izbora koncentracij, uporabljenih v preskusu,

podrobnosti o metabolnem aktivacijskem sistemu,

program tretiranja,

pozitivne in negativne kontrole,

uporabljena avtoradiografska tehnika,

uporabljeni postopki za blokiranje vstopa celic v fazo S,

uporabljeni postopki za ekstrakcijo DNK in določanje celotne vsebine DNK pri določitvah s tekočinskim scintilacijskim štetjem,

razmerje odmerek/odziv, kadar je to mogoče,

statistična ocena,

obravnava rezultatov,

razlaga rezultatov.

3.2 OCENA IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B.

B.19 PRESKUS IZMENJAVE SESTRSKIH KROMATID IN VITRO

B.19

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B.

1.2 OPREDELITEV POJMOV Glej Splošni uvod dela B.

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Preskus izmenjave sestrskih kromatid (SCE) je kratkotrajni preskus za odkrivanje recipročnih izmenjav DNK med sestrskima kromatidama kromosoma, ki se podvaja. Izmenjava sestrskih kromatid predstavlja izmenjavo produktov podvajanja DNK na na videz homolognih lokusih. Proces izmenjave predvidoma zajema razpad in ponovno združitev DNK, čeprav je malo poznanega o njegovi molekularni osnovi. Za odkrivanje izmenjav sestrskih kromatid je potrebnih nekaj načinov diferencialnega označevanja sestrskih kromatid, to pa se lahko doseže z vključitvijo bromdeoksiuridina (BrdU) v kromosomsko DNK za dva celična cikla. Sesalske celice in vitro se izpostavijo preskusni kemikaliji z ali brez sesalskega eksogenega metabolnega aktivacijskega sistema, če je to primerno, in se jih goji skozi dva cikla podvajanja na gojišču, ki vsebuje BrdU. Po obdelavi z inhibitorjem delitvenega vretena (npr. s kolhicinom), da bi se celice akumulirale v metafazi mitoze (C-metafaza), se celice spravijo in opravijo kromosomske priprave.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

V preskusu je mogoče uporabiti primarne kulture, (človeške limfocite) ali stabilizirane celične linije (npr. celice jajčnikov kitajskega hrčka). Celične linije je treba preveriti za okužbo z mikoplazmo.

Uporabiti je treba ustrezno gojišče in inkubacijske pogoje (npr. temperatura, posode za gojitev, koncentracija CO2 in vlažnost).

Preskusne snovi se lahko pripravijo na gojišču ali raztopijo ali suspendira v ustreznih nosilcih pred tretiranjem celic. Končna koncentracija nosilca v gojitvenem sistemu ne sme bistveno vplivati na sposobnost preživetja celic ali stopnjo rasti, vplive na frekvenco izmenjav sestrskih kromatid pa je treba spremljati z uporabo kontrole s topilom.

Celice je treba izpostaviti preskusni snovi v prisotnosti in v odsotnosti sesalskega metabolnega aktivacijskega sistema. Kadar pa so uporabljeni tipi celic z endogeno metabolno aktivacijo, morata stopnja in narava aktivnosti ustrezati kemijskemu razredu, ki se preskuša.

1.6 Preskusni pogoji

Število kultur

Za vsako preskusno točko je potrebno uporabiti najmanj en dvojnik kultur.

Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol

V vsak preskus je treba vključiti pozitivne kontrole z uporabo neposredno delujoče spojine in spojine, ki zahteva aktivacijo presnove; uporabiti je treba tudi kontrolo nosilca. Primeri snovi, ki jih je mogoče uporabiti kot pozitivne kontrole, so naslednji: Kadar je primerno, se lahko vključi dodatna pozitivna kontrola enakega kemijskega razreda, kot je preskušana kemikalija.

neposredno delujoče spojine:

etilmetansulfonat,

posredno delujoče spojine:

ciklofosfamid.

Koncentracije izpostavljenosti

Uporabiti je treba najmanj tri ustrezno razporejene koncentracije preskusne snovi. Najvišja koncentracija mora povzročiti opazne strupene učinke, vendar mora še vedno omogočati ustrezno podvajanje celic. Snovi, relativno netopne v vodi, je treba preskušati do meje njihove topnosti z uporabo ustreznih postopkov. Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo preskusne snovi določiti od primera do primera.

Postopek

Priprava kultur

Stabilizirane celične linije se pridobijo iz založnih kultur (npr. s tripsinizacijo ali z otresanjem), nacepljenih v gojitvenih posodah v primerni gostoti in inkubiranih pri 37 oC. V primeru enoplastnih kultur je treba število celic na gojitveno posodo prilagoditi tako, da kulture v času spravila niso konfluentne za dosti več kot 50 %. Uporabijo pa se lahko tudi celice v suspenzijski kulturi. Kulture človeških limfocitov se z uporabo ustreznih tehnik pridobijo iz heparinizirane krvi in inkubirajo pri 37 oC.

Tretiranje

Celice v eksponentni fazi rasti se ustrezno dolgo izpostavijo preskusni snovi; v večini primerov je učinkovito že ena do dve uri, vendar pa se lahko v nekaterih primerih čas obdelave podaljša do dveh zaključenih celičnih ciklov. Celice, ki nimajo zadostne endogene metabolne aktivacije, je treba izpostaviti preskusni snovi v prisotnosti in odsotnosti ustreznega sistema metabolne aktivacije. Na koncu obdobja izpostavljenosti se s celic spere preskusna snov in celice se gojijo skozi dva cikla podvajanja v prisotnosti BrdU. Lahko pa se uporabi tudi drugi postopek, v katerem se celice istočasno izpostavljajo preskusni kemikaliji in BrdU za celoten čas gojitve dveh celičnih ciklov. Kulture človeških limfocitov se tretirajo v semisinhronih pogojih. Celice se analizirajo v njihovi drugi delitvi po tretiranju, s čimer se zagotovi, da so bile najobčutljivejše faze celičnega ciklusa izpostavljene kemikaliji. Vse kulture, ki jim je dodan BrdU, se obdelajo v temi ali pri zasenčeni razbeljeni svetlobi žarnic do spravila celic, da bi se kolikor je mogoče zmanjšala fotoliza DNK, ki vsebuje BrdU.

Spravilo celic

Celične kulture se obdelajo z inhibitorjem delitvenega vretena (npr. s kolhicinom) eno do štiri ure pred spravilom. Vsaka kultura se za pripravo kromosomov spravi in predela posebej.

Priprava in obarvanje kromosomov

Pripravki kromosomov se pridobijo s standardnimi citogenetskimi tehnikami. Obarvanje stekelc, za prikaz izmenjav sestrskih kromatid, je mogoče opraviti z več tehnikami (npr. fluorescenca plus Giemsa metoda).

Analiza

Število analiziranih celic naj temelji na spontani frekvenci izmenjave sestrskih kromatid v kontroli. Običajno se za izmenjavo sestrskih kromatid analizira najmanj 25 dobro razvitih metafaz na kulturo. Stekelca se kodirajo pred analizo. Pri človeških limfocitih se analizirajo le metafaze, ki vsebujejo 46 centromerov. Pri stabiliziranih celičnih linija se analizirajo le metafaze, ki vsebujejo ± 2 centromera modalnega števila. Navesti je treba ali je centrom erična zamenjava oznake zabeležena kot izmenjava sestrskih kromatid. Rezultate je treba potrditi z neodvisnim preskusom.

2. PODATKI Podatki se povzamejo v obliki tabele. Za vsako obdelano in kontrolno kulturo posebej je treba navesti število izmenjav sestrskih kromatid za vsako metafazo in število sestrskih kromatid na kromosom za vsako metafazo. Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statističnih metod.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Če je mogoče, se v poročilo o preskusu glede na tip izvajane študije vključijo naslednji podatki:

uporabljene celice, metode vzdrževanja celične kulture,

preskusni pogoji: sestava gojišča, koncentracija CO2, koncentracija preskusne snovi, uporabljen nosilec, inkubacijska temperatura, čas tretiranja, uporabljen inhibitor delitvenega vretena, njegova koncentracija in trajanje tretiranja z njim, tip uporabljenega sesalskega aktivacijskega metabolnega sistema, pozitivne in negativne kontrole,

število celičnih kultur na preskusno točko,

podrobnosti uporabljene tehnike za pripravo stekelc,

število analiziranih metafaz (podatki, podani za vsako kulturo posebej),

srednje število izmenjave med sestrskimi kromatidami na celico in na kromosom (podatki, podani za vsako kulturo posebej),

merila za štetje izmenjav sestrskih kromatid,

utemeljitev izbora odmerka,

razmerje odmerek-odziv, če je to primerno,

statistična ocena,

obravnava rezultatov,

razlaga rezultatov.

3.2 OCENA IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B.

B.20 PRESKUS SPOLNO VEZANE RECESIVNE SMRTNOSTI NA DROSOPHILA MELANOGASTER

B.20

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B.

1.2 OPREDELITEV POJMOV Glej Splošni uvod dela B.

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Preskus spolno vezane recesivne smrtnosti (SLRL) z uporabo Drosophile melanogaster odkriva pojavnost mutacij, in sicer točkastih mutacij in majhnih delecij, v zarodni liniji žuželke. Ta preskus je preskus napredne mutacije, ki je sposoben odkriti mutacije na približno 800 lokusih kromosoma X; to predstavlja približno 80 % vseh lokusov kromosoma X. Kromosom X predstavlja približno eno petino celotnega haploidnega genoma. Mutacije v kromosomu X Drosophile melanogaster se fenotipično izražajo na samcih, ki nosijo mutantni gen. Kadar je mutacija v hemizigotnih pogojih letalna, se na njeno prisotnost sklepa iz odsotnosti enega razreda zaroda samcev od dveh, ki jih običajno proizvede heterozigotna samica. Preskus spolno vezane recesivne smrtnosti izkorišča ta dejstva s pomočjo posebej označenih in razporejenih kromosomov.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6 Priprave

Zaloge

Uporabijo se lahko samci natančno opredeljenih zalog divjega tipa in samice zaloge seva Muller-5. Lahko pa se uporabijo tudi zaloge samic, ki so primerno označene z večkrat invertiranim kromosomom X.

Preskusna snov

Preskusne snovi je treba raztopiti v vodi. V vodi netopne snovi, se lahko raztopijo ali suspendirajo v ustreznih nosilcih (npr. mešanica etanola in Tween-60 ali 80), nato pa pred dajanjem razredčijo v vodi ali raztopini soli. Za nosilec naj se ne uporablja dimetilsulfoksid (DMSO).

Število živali

Preskus je treba zasnovati z vnaprej določeno občutljivostjo in močjo. Frekvenca spontanih mutacij, opažena v ustrezni kontroli, bo vplivala na število tretiranih kromosomov, ki morajo biti analizirani.

Način dajanja

Izpostavljenost je lahko oralna, z injekcijo ali pa se živali izpostavijo plinom ali hlapom. Hranjenje s preskusno snovjo se lahko opravi z raztopino sladkorja. Kadar je potrebno, se lahko snovi raztopijo v 0,7 % raztopini NaCl in vbrizgnejo v prsni koš ali trebuh.

Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol

Vključiti je treba negativne (nosilec) in pozitivne kontrole. Če pa so na razpolago ustrezni laboratorijski pretekli kontrolni podatki, sočasne kontrole niso potrebne.

Stopnje izpostavljenosti

Uporabiti je treba tri stopnje izpostavljenosti. Za predhodno oceno se lahko uporabi ena stopnja izpostavljenosti preskusni snovi, ki je bodisi maksimalna tolerirana koncentracija ali ki kaže nekaj znakov strupenosti. V primeru nestrupenih snovi je treba uporabiti izpostavljenost maksimalnim izvedljivim koncentracijam.

Postopek

Samci divjega tipa (stari tri do pet dni) se tretirajo s preskusno snovjo in parijo posamezno s presežnim številom samic, ki se še niso parile, iz zaloge Muller-5 ali iz druge zaloge, ustrezno označene (z večkrat invertiranim kromosomom X). Samice se vsake dva do tri dni zamenjajo s takimi, ki se še niso parile, da se pokrije celoten cikel zarodnih celic. Na zarodu teh samic se zabeležijo letalni učinki, ki ustrezajo učinkom na zrelo spermo, spermatide srednje in zadnje faze, zgodnje spermatide, spermatocite in spermatogonije v času tretiranja. Heterozigotnim samicam F1 iz zgoraj navedenih križanj se omogoči posamezno parjenje (tj. ena samica na fiolo) s svojimi brati. V generaciji F2 se pri vsaki kontroli zabeleži odsotnost samcev divjega tipa. Če se izkaže, da je kultura nastala iz samice F1, ki v starševskem kromosomu X nosi letalni gen (tj. ne opazi se samcev z tretiranim kromosomom), je treba potomke te samice z enakim genotipom preskušati, da bi se ugotovilo, ali se smrtnost ponovi v naslednji generaciji.

2. PODATKI Podatki se povzamejo v obliki tabele, da se pokaže število preskušanih kromosomov X, število neplodnih samcev in število letalnih kromosomov pri vsaki koncentraciji izpostavljenosti in za vsako obdobje parjenja vsakega posameznega tretiranega samca. Navesti je treba število skupin različnih velikosti na vsakega samca. Navedene rezultate je treba potrditi v posebnem preskusu. Pri oceni preskusov spolno vezane recesivne smrtnosti je treba uporabiti ustrezne statistične metode. Treba je upoštevati in z ustrezno statistično metodo oceniti kopičenje recesivnih letalnih genov, ki izhajajo od enega samca.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Če je mogoče, se v poročilo o preskusu glede na tip izvajane študije vključijo naslednji podatki:

zaloga: zaloge Drosophila ali uporabljeni sevi, starost žuželk, število tretiranih samcev, število sterilnih samcev, število stabiliziranih F2 kultur, število F2 kultur brez potomcev, število kromosomov, ki nosijo letalni gen, opaženo v vsaki fazi zarodne celice,

merila določanja velikosti tretiranih skupin,

preskusni pogoji: podroben opis programa tretiranja in vzorčenja, stopnje izpostavljenosti, podatki o strupenosti, negativne (topilo) in pozitivne kontrole, če je to primerno,

merila za štetje letalnih mutacij,,

razmerje izpostavljenost/učinek, kjer je mogoče,

ocena podatkov,

obravnava rezultatov,

razlaga rezultatov.

3.2 OCENA IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B.

B.21 PRESKUSI CELIČNE TRANSFORMACIJE SESALSKIH CELIC IN VITRO

B.21

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B.

1.2 OPREDELITEV POJMOV Glej Splošni uvod dela B.

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Za odkrivanje fenotipskih sprememb in vitro, ki jih inducirajo kemijske snovi, povezane z maligno transformacijo in vivo, se lahko uporabijo sistemi sesalskih celičnih kultur. Med splošno uporabljane celice spadajo C3H10T1/2, 3T3, SHE in podgane Fischer, preskusi pa temeljijo na spremembah v celični morfologiji, oblikovanju žarišč ali spremembah na izgubi pritrjevalne odvisnosti celic v poltrdnem agarju. Obstajajo tudi redkeje uporabljani sistemi, ki odkrivajo fiziološke ali morfološke spremembe v celicah po izpostavljenosti rakotvornim kemikalijam. Niti eden od ciljnih učinkov preskusa in vitro nima določene mehanistične povezave z rakom. Nekateri preskusni sistemi lahko odkrijejo promotorje tumorjev. Citotoksičnost se lahko določi z merjenjem učinka preskusnega materiala na sposobnosti tvorbe kolonij (učinkovitost kloniranja) ali na stopnje rasti kultur. Namen merjenja citotoksičosti je ugotoviti, ali je bila izpostavljenost preskusni kemikaliji toksikološko relevantna, ni pa mogoče z njim izračunati frekvenco transformacije v vseh preskusih, saj lahko nekateri vsebujejo podaljšano inkubacijo in/ali ponovni razmaz na plošče.

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6 Priprave

Celice

Odvisno od uporabljanega preskusa transformacije je na voljo niz celičnih linij ali primarnih celic. Raziskovalec mora zagotoviti, da celice v opravljanem preskusu kažejo ustrezno fenotipsko spremembo po izpostavljenosti znanim rakotvornim snovem in da sta veljavnost in zanesljivost preskusa, ki se ga opravlja v raziskovalčevem laboratoriju, dokazljivi in dokumentirani.

Gojišče

Uporabiti je treba gojišča in preskusne pogoje, ki ustrezajo izvajanemu preskusu transformacije.

Preskusna snov

Preskusne snovi se lahko pripravijo v gojišču ali raztopijo ali suspendirajo v ustreznih nosilcih tik pred tretiranjem celic. Končna koncentracija nosilca v gojitvenem sistemu ne sme vplivati na sposobnost preživetja celic, stopnjo rasti ali pojav transformacije.

Metabolna aktivacija

Celice je treba izpostaviti preskusni snovi v prisotnosti in v odsotnosti ustreznega metabolnega aktivacijskega sistema. Kadar pa so uporabljeni tipi celic z endogeno metabolno aktivacijo, se je treba prepričati, da narava aktivnosti ustreza kemijskemu razredu, ki se preskuša.

Preskusni pogoji

Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol

V vsak preskus je treba vključiti pozitivne kontrole z uporabo neposredno delujoče spojine ter spojine, ki zahteva metabolno aktivacijo; uporabiti je treba tudi negativno kontrolo (nosilec). Primeri snovi, ki jih je mogoče uporabiti kot pozitivne kontrole, so naslednji: Kadar je primerno, je treba vključiti dodatno pozitivno kontrolno enakega kemijskega razreda, kot je preskušana spojina.

Neposredno delujoče kemikalije:

etilmetansulfonat,

β-propiolakton.

Spojine, ki zahtevajo aktivacijo presnove:

2-acetilaminofluoren,

4-dimetil aminoazobenzen,

7,12-dimetilbenzantracen.

Koncentracije izpostavljenosti

Uporabiti je treba nekaj koncentracij preskusne snovi. Te koncentracije morajo povzročiti s koncentracijo povezane učinke strupenosti, pri čemer najvišja koncentracija povzroča nizko stopnjo preživetja, preživetje v najnižji koncentraciji pa mora biti približno enako kot v negativni kontroli. Snovi, relativno netopne v vodi, je treba preskušati do meje njihove topnosti z uporabo ustreznih postopkov. Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo preskusne snovi določiti od primera do primera.

Postopek

Celice je treba izpostaviti za ustrezno obdobje, odvisno od uporabljenega preskusnega sistema, to pa lahko pri podaljšani izpostavljenosti vključuje ponovno dajanje odmerka ob spremembi gojišča (in, če je potrebno, sveže mešanice za metabolno aktivacijo). Celice, ki nimajo zadostne endogene metabolne aktivacije, je treba izpostaviti preskusni snovi v prisotnosti in odsotnosti ustreznega metabolnega aktivacijskega sistema. Na koncu obdobja izpostavljenosti se s celic spere preskusna snov in celice se gojijo v pogojih, ki ustrezajo spremljanemu transformiranega fenotipa ter pojavnosti nekatere transformacije. Vsi rezultati se potrdijo v neodvisnem preskusu.

2. PODATKI Podatki se povzamejo v obliki tabele, ti pa so lahko zelo različni, odvisno od uporabljenega preskusa, npr. število kolonij ali žarišč na ploščo, pozitivne plošče ali število transformiranih celic. Kadar je primerno, je treba preživetje izraziti kot odstotek kontrolne stopnje in frekvence transformacij izražene s številom transformantov na število preživelih celic. Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statističnih metod.

3. POROČANJE

3.

3.1 POROČILO O PRESKUSU Če je mogoče, se v poročilo o preskusu glede na tip izvajane študije vključijo naslednji podatki:

uporabljen tip celic, število celičnih kultur, metode vzdrževanja celičnih kultur,

preskusni pogoji: koncentracija preskusne snovi, uporabljen nosilec, inkubacijski čas, trajanje in frekvenca tretiranja, gostota celic v času tretiranja, tip uporabljenega eksogenega metabolnega aktivacijskega sistema, pozitivne in negativne kontrole, določitev spremljanega fenotipa, uporabljen selektivni sistem (če je primerno), utemeljitev izbora odmerka,

metoda preštevanja živih in transformiranih celic,

statistična ocena,

obravnava rezultatov,

razlaga rezultatov.

3.2 OCENA IN RAZLAGA Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI Glej Splošni uvod dela B.

B.22

1. METODA

1.

1.1 UVOD Glej Splošni uvod dela B.

1.2 OPREDELITEV POJMOV Glej Splošni uvod dela B.

1.3 REFERENČNE SNOVI Jih ni.

1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE Učinki dominantne smrtnosti povzročajo embrionalno ali fetalno smrt. Indukcija dominantno letalnih genov zaradi izpostavljenosti kemijski snovi kaže, da snov deluje na zarodno tkivo preskusnih vrst. Na splošno velja, da so dominantni letalni geni posledica kromosomske okvare (strukturne in numerične anomalije). Če gre za tretiranje samic, so lahko embrionalne smrti tudi posledica strupenih učinkov. Na splošno se samci izpostavijo preskusni spojini in parijo z netretiranimi samicami, ki se še niso parile. Preskušajo se lahko različni stadiji zarodnih celic ločeno, z zaporednimi intervali parjenja. Porast števila mrtvih ugnezditev na samico v tretirani skupini nad številom mrtvih ugnezditev na samico v kontrolni skupini kaže na izgubo po ugnezditvi. Izguba pred ugnezditvijo se lahko oceni na podlagi števil corpora lutea ali s primerjavo skupnega števila ugnezditev na samico v preskusni in kontrolni skupini. Skupen dominantni letalni učinek je vsota izgub pred in po ugnezditvi. Izračun skupnega dominantnega smrtnega učinka temelji na primerjavi živih ugnezditev na samico v preskusni skupini z živimi ugnezditvami na samico v kontrolni skupini. Zmanjšanje števila ugnezditev v določenih presledkih je lahko rezultat uničenja celic (npr. spermatocit in/ali spermatogonijev).

1.5 MERILA KAKOVOSTI Jih ni.

1.6 OPIS PRESKUSNE METODE

1.6 Priprave

Kadar je mogoče, je treba preskusne snovi raztopiti ali suspendirati v izotonični raztopini soli. Kemikalije, netopne v vodi, se lahko raztopijo ali suspendirajo v ustreznem nosilcu. Uporabljeni nosilec ne sme interferirati s preskusno kemikalijo niti povzročati strupenih učinkov. Uporabiti je treba sveže pripravljene preskusne kemikalije.

Preskusni pogoji

Način dajanja

Preskusna spojina se na splošno da le enkrat. Na podlagi toksikoloških podatkov je mogoče uporabiti tudi ponavljajoči program tretiranja. Običajna načina dajanja sta oralna intubacija ali intraperitonealna injekcija. Ustrezni so tudi drugi načini dajanja.

Preskusne živali

Kot preskusne vrste se priporočajo podgane ali miši. Naključno se izberejo zdrave in spolno popolnoma zrele živali in se razporedijo v preskusne in kontrolne skupine.

Število in spol

Uporabiti je treba ustrezno število tretiranih samcev, da se lahko upošteva spontano spremembo ocenjevane biološke lastnosti. Izbrano število naj temelji na vnaprej določeni občutljivosti zaznavanja in vrednosti značilnosti. Na primer, v tipičnem preskusu bi moralo biti število samcev zadosti veliko, da omogoči od 30 do 50 brejih samic na interval parjenja.

Uporaba negativnih in pozitivnih kontrol

Na splošno je treba v vsak preskus vključiti sočasne pozitivne in negativne (nosilec) kontrole. Kadar so na voljo sprejemljivi rezultati pozitivne kontrole iz preskusov, ki so bili pred kratkim izvajani v istem laboratoriju, jih je mogoče uporabiti namesto sočasne pozitivne kontrole. Snovi pozitivne kontrole je treba uporabiti v ustrezno nizkem odmerku (npr. MMS, intraperitonealno, pri 10 mg/kilogram), da bi se dokazala občutljivost preskusa.

Velikosti odmerka

Običajno se uporabijo tri velikosti odmerka. Odmerek visoke velikosti mora povzročiti znake strupenosti ali zmanjšano plodnost pri tretiranih živalih. V nekaterih primerih lahko zadostuje že en sam visok odmerek.

Mejni preskus

Nestrupene snovi je treba preskusiti s 5 g/kilogram pri enem samem odmerku ali z 1 g/kilogram/dan pri ponovljenih odmerkih.

Postopek

Na voljo je nekaj programov tretiranja. Preskusna snov se najpogosteje daje samo enkrat. Uporabijo se lahko tudi drugi programi tretiranja. Posamezni samci se parijo zaporedno z eno ali dvema netretiranima samicama, ki se še nista parili, v ustreznih časovnih presledkih po tretiranju. Samice je treba pustiti s samci za čas najmanj enega pojatvenega cikla ali dokler se ne zgodi parjenje, kar se ugotovi ob prisotnosti semenčec v vagini ali ob prisotnosti vaginalnega zamaška. Število parjenj po tretiranju je določeno s programom tretiranja, zagotoviti pa je treba, da se vse faze zarodnih celic po tretiranju vzorčijo. Samice se žrtvujejo v drugi polovici brejosti, vsebina maternice pa se pregleda, da bi se določilo število mrtvih in živih ugnezditev. Lahko se pregledajo tudi jajčniki, da bi se določilo število corpora lutea.

2. PODATKI Podatki se povzamejo v obliki tabele, da bi se prikazalo število samcev, število brejih samic in število nebrejih samic. Navesti je treba posamezne rezultate vsakega parjenja, vključno z identiteto vsakega samca in samice. Za vsako samico je treba zabeležiti teden parjenja, velikost odmerka, ki so ga sprejeli samci, pogostost živih ugnezditev in mrtve ugnezditve. Izračun skupnega dominantnega smrtnega učinka temelji na primerjavi živih ugnezditev na samico v preskusni skupini z živimi ugnezditvami na samico v kontrolni skupini. Analizira se razmerje med mrtvimi in živimi ugnezditvami iz tretirane skupine v primerjavi z enakim razmerjem iz kontrolne skupine, da bi se prikazala izguba po ugnezditvi. Iz tabel mora biti razvidno, ali podatki navedeni kot zgodnje in pozne smrti. Če je ocenjena izguba pred ugnezditvijo, je treba navesti tudi to. Izgubo pred ugnezditvijo je mogoče izračunati kot razliko med številom corpora lutea in številom ugnezditev ali kot zmanjšanje povprečnega števila ugnezditev na maternico v primerjavi s parjenji v kontrolah. Podatki se ocenijo z ustreznimi statističnimi metodami.

vrsta, sev, starost in masa uporabljenih živali, število živali vsakega spola v preskusni in kontrolni skupini,

preskusna snov, nosilec, preskusne velikosti odmerka in utemeljitev izbora odmerka, negativne in pozitivne kontrole, podatki o strupenosti,

program dajanja in tretiranja,

program parjenja,

uporabljena metoda za določitev, ali je prišlo do parjenja,

čas žrtvovanja,

merila za preštevanj e dominantnih letalnih genov,

razmerje odmerek/odziv, če je primerno,

statistična ocena,

obravnava rezultatov,

3234 more provisions are not shown here; each has its own address.

Versions

2008-05-30