Kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 av den 30 maj 2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)
Grade B
mapped from publisher markup. A grade says how a document's structure was obtained, not how reliable the law is.
Address https://gelex.eu/eli/EU/act/2008/440@2008-05-30/sv
Contents
- Preamble
- ANNEX
- A.1
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.4
- 1.5 TABELL: METODERNAS LÄMPLIGHET A. B. C. D.
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.1.1
- 1.6.1.2 Apparatur:
- 1.6.2
- 1.6.4
- A.2
- 1.
- 1.4
- 1.5 Tabell 1 Jämförelse av metoderna
- 1.6
- 1.6.4
- 1.6.6
- 2. Tabell 2: Temperaturkorrektionsfaktorer ft
- A.3
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 3. Tabell 1.4.1.1.1.4.1.21.4.1.31.4.21.4.31.4.4 Metodernas lämplighet
- 3. Tabell 1.4.1.1.1.4.1.2 Metodernas lämplighet a)
- 3. Tabell 1.4.1.1.1.4.1.21.4.1.31.4.2 Metodernas lämplighet a)
- 4.1.2.3.4.5.6.7.
- A.
- 1.
- 1.4
- 1.5 Tabell 1.4.11.4.21.4.31.4.41.4.51.4.61.4.7 Kvalitetskriterier
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 1.6.2.2
- 1.6.4
- 1.6.4.2
- 1.6.5
- 1.6.6
- 1.6.6.1 Inert gas:
- 1.6.6.2 Förberedelse av mättnadskolonnen:
- a)
- b)
- 1.6.7
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.
- A.5
- 1.
- 1.6
- 1.6.4
- 1.6.4.1
- 1.6.4.1.3 Figur Mätkropp
- 1.6.4.2
- 1.6.4.2.2 Montering;
- a)
- b)
- 2. Tabell Korrektion av den mätta ytspänningen Endast för vattniga lösningar, ρ = 1 g/cm3
- 3.
- A.6
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.6
- 1.6.3
- 1.6.3.2 Testförfarande:
- 1.6.3.3 Apparatur
- 1.6.3.4 Apparatur (se figur 4 och 3)
- 1.6.4
- 2.
- 3.
- A.8
- 1.
- 1.3 Skakkolvmetoden
- 1.4
- 1.5
- 1.5.1 Skakkolvmetoden
- 1.5.2 Skakkolvmetoden
- 1.5.3 Skakkolvmetoden
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.2.1
- 1.6.2.3
- 1.6.3
- 1.6.3.1 Apparatur
- 1.6.3.2 Beräkning av dödtiden t0
- 2. Skakkolvmetoden
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.
- A.9
- 1.
- 1.5
- 1.6
- 1.6.3
- 1.6.3.2 Abel-apparat:
- A.10
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 3.
- A.11
- 1.
- 1.6
- A.12
- 1.
- 1.3
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 1.6.3
- 1.6.4
- A.13
- 1.
- 1.6
- 1.6.2 a)
- 2.
- A.14
- 1.
- 1.1 a)
- 1.4
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 1.6.2.2 a)
- 1.6.3
- 1.6.3.2 a)
- 3.
- A.15
- 1.
- 1.6
- A.16
- 1.
- 1.6
- 1.6.1
- 4.
- Figur 1 Mall till 20 mm testkub
- Figur 2 Typisk temperatur/tidskurva
- A.17
- 1.
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.2
- 3.
- 3.2 a)
- A.18
- 1.
- 1.6
- 2.
- 2.2
- A.19
- 1.
- 1.6
- 2.
- 2.2
- A.20
- 1.
- 1.5.
- 1.5.4
- 2.
- 3.
- 3.1
- A.21
- 1.
- 1.6
- 1.6.1
- 1.6.1.2
- 2.
- 2.1 Tabell 1 Exempel på resultat
- 3.
- 3.2 a)
- 4.1.
- Figur 1 Tryckkärl
- Figur 2 Stödställning
- Figur 3 Tändsystem
- 1.
- 2.
- 4.
- 1.2 För fasta ämnen
- Tillägg 1 Utvärderingsmetod
- INLEDNING
- BEDÖMNINGSMETOD
- BERÄKNINGSFÖRFARANDE
- RAPPORT
- HÄNVISNINGAR
- Tillagg 2
- Figur 1 Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt den dynamiska metoden
- Figur 2a Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt den statiska metoden (med U-rörsmanometer)
- Figur 2b Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt den statiska metoden (med tryckindikator)
- Figur 3 Isoteniskop (se hänvisning 7).
- Figur 4 Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt ångtrycksvågsmetoden
- Figur 5 Exempel på en apparat för förångning vid lågt tryck genom effusionsmetoden, med en effusionscellvolym av 8 cm
- Figur 6a Exempel på ett flödessystem för bestämning av ångtryck genom gasmättnadsmetoden
- Figur 6b Exempel på ett system för bestämning av ångtryck genom gasmättnadsmetoden med kapillärrör placerat efter gasmättnadskammaren
- Figur 7 Exempel på försöksanordning för rotormetoden
- Figur 8 Exempel på mathuvud med roterande kula
- Figur 1 Kolonnelueringsmetod med recirkulationspump
- Figur 2 En typisk mikrokolonn
- Figur 3 En typisk mikrokolonn
- Figur 4 Kolonnelueringsmetod med nivåkärl*
- UPPSKATTNINGSMETOD Preliminär uppskattning av fördelningskoefficient.
- BERÄKNINGSMETODER Principen för beräkningsmetoderna
- Hansch Π-metoden
- Rekkers metod
- Hansch-Leos metod
- Kombinerad metod
- i)
- ii)
- iii)
- iv)
- Tillägg 2 Rekommenderade referensämnen för HPLC-metoden
- Figur Form och tillbehör för anordning av testhögen
- Figur Apparatur
- Exempel på materialspecifikation för värmesensitivitetstestet (se DIN 1623) 1.2.3.
- Figur 1 Apparatur för värmesensitivitetstest
- Figur 2 Värmesensitivitetstest
- Figur 3 Kalibrering av uppvärmningshastigheten vid test av värmesensitivitet
- Figur 4 Slagpåverkanapparatur
- Figur 5 Apparatur för friktionssensitivitet
- Figur Form och tillbehör för iordningställande av högen
- 1.1.11.21.31.4
- 3.1.2.3.4.5.6.7.8.9.
- DEL B METODER FÖR BESTÄMNING AV TOXICITET OCH ANDRA HÄLSOEFFEKTER
- ALLMÄN INLEDNING A.
- i)
- ii)
- B.1a
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.5.3
- 1.6
- 3.
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.
- B.1b
- 1.
- 1.4
- 1.5
- 1.6
- 3.
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.
- B.2
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3 a)
- 3.
- 3.1 a)
- B.3
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3 Bedömning av toxicitet bos det motsatta könet
- 3.
- B.4
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 2.
- 3.
- 4.1.2.3.4.5.5a.6.7.8.9.
- Tabell 1 Rodnad och sårskorpebildning Ödembildning GRADERING AV HUDREAKTIONER
- B.5
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.2.3
- 1.4.2.7
- 2.
- 3.
- 4.1.2.3.4.5.6.(6a)(7)(8)(9)(10)
- Tabell 1 GRADERING AV OKULÄRA SKADOR
- Hornhinna (kornea)
- Iris
- Konjunktiva
- Chemos
- B.6
- 1.
- 1.5
- 1.5.1
- 1.5.1.2
- 1.5.1.3
- 1.5.2
- 1.5.2.2
- 1.5.2.3
- 3. Försöksrapport (GPMT och Buehler-test)
- B.7
- 1.
- 1.4
- 1.4.2
- 1.4.3
- 3. FÖRSÖKSRAPPORT
- B.8
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3 a)
- 3.
- 3.1
- pt_2 a)
- B.9
- 1.
- 1.6
- 1.6.2
- 1.6.3
- 3.
- B.10
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.3
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.
- B.11
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.5
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.
- B.12
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.5
- 1.5.2 a)
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.
- B.13/14
- 1.
- 1.5
- 1.5.1
- 1.5.2
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.
- B. 15
- 1.
- 1.6 Förberedelser
- Metabolisk aktivering
- Teststammar
- Media
- Användning av negativa och positiva kontroller
- Exponeringskoncentration
- Inkubationsbetingelser
- Spontana mutationsfrekvenser
- Antal parallella plattor
- 3.
- B.16
- 1.
- 1.6 Förberedelser
- Metabolisk aktivering
- Teststammar
- Media
- Användning a v negativa och positiva kontroller
- Exponeringskoncentration
- Inkubationsbetingelser
- Spontana mitotiska rekombinations frekvenser
- Antal parallella plattor
- 3.
- B.17
- 1.
- 1.4
- 1.4.1
- 1.4.2
- 1.4.3
- 2.
- 3. TESTRAPPORT
- 4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.
- B.18
- 1.
- 1.6 Förberedelser
- Antal kulturer
- Användning av negativa och positiva kontroller
- Exponeringskoncentration
- Celler
- Metabolisk aktivering
- Förberedelse av kulturer
- Exponering av kulturerna för tes t ämnet Primärkulturer av råtthepatocyter
- Autoradiografisk bestämning
- LSC-mätning
- 2.
- 3.
- B.19
- 1.
- 1.6 Testbetingelser
- Antal kulturer
- Användning av negativa och positiva kontroller
- Exponerings koncentration
- Odling
- Exponering
- Skörd av celler
- Kromosompreparation och färgning
- Analys
- 3.
- B.20
- 1.
- 1.6 Förberedelser
- Stammar
- Testämne
- Antal
- Tillförselväg
- Användning av negativa och positiva kontroller
- Exponeringskoncentration
- 3.
- B.21
- 1.
- 1.6 Förberedelser
- Celler
- Medium
- Testämne
- Metabolisk aktivering
- Användning a v negativa och positiva kontroller
- Exponeringskoncentration
- 3.
- B.22
- 1.
- 1.6 Förberedelser
- Tillförselväg
- Försöksdjur
- Antal och kön
- Användning a v negativa och positiva kontroller
- Dosnivåer
- Gränstest
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING
med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,
med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, särskilt artikel 13.3, och
av följande skäl:
(1) Enligt förordning (EG) nr 1907/2006 ska testmetoder antas på gemenskapsnivå för ämnestestsyften om sådana tester krävs för att generera information om ämnenas inneboende egenskaper.
(2) I bilaga V till rådets direktiv 67/548/EEG av den 27 juni 1967 om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen fastställs metoder för ämnens och preparats (beredningars) fysikalisk-kemikaliska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet. Bilaga V till direktiv 67/548/EEG har upphävts genom direktiv 2006/121/EG, med verkan från och med den 1 juni 2008.
(3) De testmetoder som ingår i bilaga V till direktiv 67/548/EEG bör tas med i denna förordning.
(4) Denna förordning hindrar inte användning av andra testmetoder, förutsatt att användningen av dessa är i enlighet med artikel 13(3) i förordning (EG) nr 1907/2006.
(5) Principerna för att ersätta, minska och förbättra användningen av djur i provningsförfaranden bör till fullo beaktas när testmetoder utarbetas, särskilt när lämpliga validerade metoder för att ersätta, minska eller förbättra djurförsök blir tillgängliga.
(6) De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats genom artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
De testmetoder som ska tillämpas för de syften som avses i förordning (EG) nr 1907/2006 fastställs i bilagan till denna förordning.
Artikel 2
Kommissionen ska där så är lämpligt se över de testmetoder som ingår i denna förordning i syfte att ersätta, minska eller förfina testning på ryggradsdjur.
Artikel 3
Hänvisningar till bilaga V till direktiv 67/548/EEG ska läsas som hänvisningar till denna förordning.
Artikel 4
Denna förordning träder i kraft dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.
Den ska tillämpas från och med den 1 juni 2008. Utfärdad i Bryssel den 30 maj 2008. På kommissionens vägnar Stavros Dimas Ledamot av kommissionen
ANNEX
BILAGA DEL A: METODER FÖR BESTÄMNING AV FYSIKALISK-KEMISKA EGENSKAPER
A.1 SMÄLT-/FRYSPUNKT
A.1
1. METOD De flesta av de beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlinjer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinciperna anges i hänvisningarna 2 och 3.
1.
1.1 INLEDNING De beskrivna metoderna och apparaterna kan användas för bestämning av ämnens smältpunkt, utan någon begränsning beträffande deras renhetsgrad. Valet av metod beror på arten av det ämne som ska undersökas. Det är följaktligen avgörande om ämnet lätt, med svårighet eller inte alls kan pulvriseras. För vissa ämnen är det mer ändamålsenligt att bestämma frys- eller stelningspunkten, och i denna metod inbegrips standarder för sådana bestämningar. Om det till följd av ämnets särskilda egenskaper inte går att korrekt bestämma ovan nämnda parametrar kan det vara ändamålsenligt att bestämma den lägsta flytpunkten.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Smältpunkten definieras som den temperatur vid vilken fasövergången från fast till flytande tillstånd sker vid normalt atmosfäriskt tryck, och denna temperatur motsvarar idealt fryspunkten. Eftersom fasövergången för många ämnen sker under ett punktintervall beskrivs den ofta som smäkintervallet. Omvandling av enheter (K till oC): t = T – 273,15 t temperaturen i grader Celsius ( oC) T termodynamiska temperaturen Kelvin (K)
1.3 REFERENSÄMNEN Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder. Vissa referensämnen anges i hänvisningarna (se hänvisning 4).
1.4 TESTMETODSPRINCIP Temperaturen (temperarurintervallet) för fasövergången från fast till flytande tillstånd eller från flytande till fast tillstånd bestäms. I praktiken bestäms temperaturen vid begynnande smältning/frysning och vid slutlig smältning/frysning under uppvärmning/avkylning av ett prov av testämnet vid atmosfäriskt tryck. Fem typer av metoder beskrivs, nämligen kapillärmetoder, varmebordsmetoder, fryspunktsbestämning, metoder för termisk analys och bestämning av lägsta flytpunkt (utvecklad för petroleumoljor). I vissa fall kan det vara praktiskt att mäta fryspunkten i stället för smältpunkten.
1.4
1.4.1 Kapillärmetoder
1.4.1
1.4.1.1 Smältpunktsanordningar med vätskebad Ett kapillärrör fylls med en liten, tätt packad mängd av det finmalda ämnet. Röret uppvärms tillsammans med en termometer och temperaturstegringen ställs in till mindre än ca 1 K/min under själva smältningen. Temperaturen vid begynnande och slutlig smältning bestäms.
1.4.1.2 Srnältpunktsanordningar med metallblock Enligt beskrivningen under 1.4.1.1, bortsett från att kapillärröret och termometern är placerade i ett uppvärmt metallblock och kan iakttas genom hål i blocket.
1.4.1.3 Bestämmng med fotocell Provet i kapillärröret uppvärms automatiskt i en metallcylinder. En ljusstråle riktas genom ämnet via ett hål i cylindern på en exakt inställd fotocell. Vid smältningen ändras de flesta ämnens optiska egenskaper från ogenomskinligt till genomskinligt. Ljusstyrkan som når fotocellen ökar, varvid en stoppsignal sänds till en digital indikator som visar temperaturen hos en platinamotståndstermometer som är placerad i värmekammaren. Denna metod kan inte användas för vissa starkt färgade ämnen.
1.4.2 Värmebord
1.4.2
1.4.2.1 Koflers värmebänk Koflers värmebänk består av två elektriskt uppvärmda metallstycken med olika värmeledningsförmåga och är så utformad att dess temperaturgradient i längdriktningen nästan är linjär. Värmebänkens temperaturområde kan spänna från 283 K till 543 K och är försedd med en särskild anordning för temperaturavläsning som består av en löpare med visare och en flagga, och som är särskilt utformad för den aktuella bänken. Smältpunkten bestäms genom att det aktuella ämnet läggs i ett tunt lager direkt på värmebänkens ovansida. Efter några sekunder utvecklas en skarp skiljelinje mellan den flytande och den fasta fasen. Skiljelinjens temperatur avläses genom att visaren ställs in på linjen.
1.4.2.2 Smältmikroskop Flera värmebord med mikroskop används vid bestämning av smältpunkten på mycket små provmängder. I de flesta värmeborden mäts temperaturen med ett känsligt termoelement, men ibland används även kvicksilvertermometrar. En typisk smältpunktsanordning, bestående av värmebord med mikroskop, är utrustad med en värmekammare som innehåller en metallplatta på vilken proven placeras på ett objektglas. I mitten av metallplattan finns ett hål genom vilket ljus kan sändas från mikroskopets belysningsspegel. När anordningen används är kammaren stängd med en glasplatta för att förhindra tillträde av luft till provet. Uppvärmningen av provet regleras med en reostat. Om det krävs mycket exakta mätningar kan polariserat ljus användas för optiskt anisotropa ämnen.
1.4.2.3 Meniskmetoden Denna metod används endast för polyamiden Den temperatur vid vilken en silikonoljemenisk, som är innesluten mellan ett värmebord och ett täckglas som vilar på polyamidprovämnet, förskjuts iakttas visuellt.
1.4.3 Metod för bestämning av fryspunkt Provet placeras i ett särskilt provrör och sätts i en apparat för bestämning av fryspunkten. Provet avkyls under försiktig och oavbruten omrörning och temperaturen mäts med passande mellanrum. När temperaturen är konstant vid flera avläsningar registreras denna temperatur (korrigerad för termometerfel) som fryspunkten. Underkylning ska undvikas genom att man upprättar jämvikt mellan den fasta fasen och vätskefasen.
1.4.4 Termisk analys
1.4.4
1.4.4.1 Differentiell termisk analys (DTA) Genom denna metod registreras temperaturskillnaden mellan ämnet och ett referensämne som en funktion av temperaturen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrollerade temperaturprogram. En fasövergång i provet som åtföljs av en entalpiändring visar sig genom en endoterm (smältning) eller exoterm (frysning) avvikelse från den registrerade baslinjen.
1.4.4.2 Differentiell scanningkalorimetri (DSC) Genom denna metod registreras skillnaden i den energimängd som tillförs ett ämne och ett referensmaterial som en funktion av temperaturen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrollerade temperaturprogram. Denna skillnad motsvarar den energi som är nödvändig för att upprätthålla en temperaturskillnad på noll mellan ämnet och referensmaterialet. En fasövergång i provet ledsagad av en entalpiändring visar sig genom en endoterm (smältning) eller exoterm (frysning) avvikelse från den registrerade baslinjen.
1.4.5 Flytpunkt Denna metod har utvecklats för petroleumoljor och är lämplig för oljeaktiga ämnen med låg smältpunkt. Efter att provet först har värmts upp kyls det ned med en bestämd hastighet, och dess flytegenskaper undersöks med 3K:s mellanrum. Den lägsta temperaturen vid vilken rörelse av ämnet kan iakttas registreras som flytpunkten.
1.5 KVALITETSKRITERIER I följande tabell anges de olika metodernas lämplighet och noggrannhet vid bestämning av smältpunkt/smältpunktsintervall.
1.5 TABELL: METODERNAS LÄMPLIGHET A. B. C. D.
Kapillärmetoder Mätmetod Ämnen som kan pulvriseras Ämnen som inte lätt pulvriseras Temperatur område Uppskattad exakthet Befintlig standard Smältpunktsanordning med vätskebad ja några få 273 till 573 K ±0,3 K JIS K 0064 Smältpunkts-anordning med metallblock ja några få 293 till >573K ±0,5 K ISO 1218 (E) Bestämning med fotocell ja flera med hjälp av särskild utrustning 253 till 573 K ±0,5 K Värmebord och frysmetoder Mätmetod Ämnen som kan pulvriseras Ämnen som inte latt pulvriseras Temperaturområde Uppskattad exakthet Befintlig standard Koflers värmebank ja nej 283 till > 573 K ±1,0 K ANSI/ASTM D 3451-76 Smältmikroskop ja några få 273 till > 573 K ±0,5 K DIN 53736 Meniskmetod nej endast för polyamider 293 till > 573 K ±0,5 K ISO 1218 (E) Fryspunkt-metoder ja ja 223 till 573 K ±0,5 K t.ex. BS 4695 Termisk analys Mätmetod Ämnen som kan pulvriseras Ämnen som inte lätt pulvriseras Temperaturområde Uppskattad cxakthet Befintlig standard Differentiell termisk analys ja nej 173 till 1273 K upp till 600 K ±0,5 K upp till 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Differentiell kalorimetri ja ja 173 till 1273 K upp till 600 K ±0,5 K upp till 1273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 Flytpunkt Matmetod Ämnen som kan pulvriseras Ämnen som inte lätt pulvriseras Temperaturområde Uppskattad exakthet Befintlig standard Flytpunkt för petroleum- oljor och oljeaktiga ämnen för petroleum- oljor och oljeaktiga ämnen 223 till 323 K ±3,0 K ASTM D 97-66
1.6 METODBESKRIVNING Tillvägagångssättet för nästan alla testmetoderna beskrivs i internationella och nationella standarder (se tillägg 1).
1.6
1.6.1 Kapillärrörsmetoder Fint pulvriserade ämnen uppvisar vid långsam uppvärmning vanligtvis ett smältningsförlopp enligt figur 1.
1.6.1
Figur 1 Steg A Steg B Steg C Steg D Steg E Steg A (Begynnande smältning): Små droppar fördelar sig jämnt över kapillärrörets innervägg. Steg B Ett mellanrum uppstår mellan provet och innerväggen till följd av att provet krymper under smältningen. Steg C Det krympta provet börja sjunka mot botten och övergår i flytande form. Steg D En obruten menisk bildas vid ytan, men en väsentlig del av provet består fortfarande av fast ämne. Steg E (Slutlig smältning): Det finns inga fasta partiklar. Vid bestämning av smältpunkten antecknas temperaturerna vid begynnande och slutlig smältning.
1.6.1.1 Smältpunktsanordningar med vätskebad Figur 2 visar ett exempel på en standardiserad smältpunktsapparat (JIS K 0064) av glas. Alla mått är angivna i mm.
1.6.1.1
Figur 2 A: Mätkärl B: Propp C: Luftningshål D: Termometer E: Hjälptermometer F: Badvätska G: Kapillärrör av glas, längd 80 – 100 mm. in-nerdiameter 1.0 ± 0.2 mm, väggtjocklek 0.2 – 0.3 mm. H: Sidorör
Badvätska:
En lämplig vätska väljs. Valet beror på den smältpunkt som ska bestämmas, t.ex. paraffinolja för smältpunkter upp till 473 K och silikonolja för smältpunkter upp till 573 K. För smältpunkter över 523 K kan en blandning bestående av 3 delar svavelsyra och 2 delar kaliumsulfat (viktförhållande) användas. Vid användning av denna blandning ska lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas.
Termometer:
Endast termometrar som uppfyller kraven i följande eller likvärdiga standarder bör användas: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Förfarande:
Det torra ämnet pulvriseras fint i en mortel och fylls i kapillärröret, som är tillslutet i den ena änden, till en höjd av ungefär 3 mm efter tät packning. För att få ett jämnt packat prov låter man kapillärröret falla från en höjd av ungefär 700 mm genom ett lodrätt glasrör ned på ett urglas. Det fyllda kapillärröret placeras i badet så att den mittersta delen av termometerns kvicksilverkula berör den del av kapillärröret där provet finns. Normalt placeras kapillärröret i apparaten när badets temperatur är ungefär 10 K under smältpunkten. Badvätskan uppvärms med en temperaturstegring av ungefar 3 K/min under omrörning av vätskan. När temperaturen är ungefär 10 K under den förväntade smältpunkten ställs temperaturstegringen in till högst 1 K/min.
Beräkning:
Smältpunkten beräknas enligt följande: T-TD+0,00016(TD – TE)n där: T korrigerad smältpunkt i K TD temperaturavläsning av termometer D i K TE temperaturavläsning av termometer E i K n antal gradindelningar av den utstående delen av termometer D:s kvicksilverpelare.
1.6.1.2 Smältpunktsanordning med metallblock
1.6.1.2 Apparatur:
Denna består av
ett cylindriskt metallblock, vars översta del är ihålig och bildar en kammare (se figur 3),
en metallpropp med två eller flera hål som gör det möjligt att föra in rör i metallblocket,
ett uppvärmningssystem för metallblocket, t.ex. i form av ett elektriskt motstånd inneslutet i blocket,
en reostat för reglering av energitillförseln, om elektrisk uppvärmning används,
fyra fönster av värmebeständigt glas på kammarens sidovägg, placerade diametralt och vinkelrätt mot varandra. Framför ett av dessa fönster finns en lupp monterad för iakttagelse av kapillärröret. De tre andra fönstren används för att belysa kammarens insida med hjälp av lampor,
ett kapillärrör av värmebeständigt glas, tillslutet i ena änden (se 1.6.1.1).
Termometer:
Se standarderna i punkt 1.6.1.1. Även termoelektriska instrument med jämförbar noggrannhet kan användas.
Figur 3 Termometer Kapillärrör Metallpropp Lupp Lampa Elektriskt motstånd Uppvärmningsblock av metall
1.6.1.3 Bestämning med fotocell Apparatur och förfarande: Apparaturen består av en metallkammare med ett automatiskt uppvärmningssystem. Tre kapillärrör fylls enligt 1.6.1.1 och placeras i ugnen. Flera linjära temperaturstegringar kan användas för att kalibrera apparaturen och lämplig temperaturstegring justeras elektriskt med en förvald konstant och linjär hastighet. Skrivare visar den faktiska ugnstemperaturen och temperaturen för ämnet i kapillärrören.
1.6.2 Värmebord
1.6.2
1.6.2.1 Koflers värmebänk Se tillägg.
1.6.2.2 Smältmikroskop Se tillägg.
1.6.2.3 Meniskmetoden (polyamider) Se tillägg. Uppvärmningshastigheten vid smältpunkten ska vara lägre än 1 K/min.
1.6.3 Metoder för bestämning av fryspunkt Se tillägg.
1.6.4 Termisk analys
1.6.4
1.6.4.1 Differentiell termisk analys Se tillägg.
1.6.4.2 Differentiell scanningkalorimetri Se tillägg.
1.6.5 Bestämning av flytpunkt Se tillägg.
2. DATA I vissa fall är termometerkorrektion nödvändigt.
3. RAPPORTERING Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: Som smältpunkt anges medelvärdet av minst två mätningar, som ligger inom gränserna för den uppskattade noggrannheten (se tabellerna). Om skillnaden mellan temperaturen vid begynnande och slutlig smältning ligger inom gränsvardena för metodens noggrannhet, anges temperaturen vid den slutliga smältningen som smältpunkten. I motsatt fall anges båda temperaturerna. Om ämnet upplöses eller sublimeras innan smältpunkten nås anges den temperatur där detta fenomen iakttas. Alla uppgifter och upplysningar av betydelse för tolkningen av resultaten måste anges, i synnerhet vad gäller orenheter och ämnets fysiska tillstånd.
Använd testmetod.
Noggrann beskrivning av substansen (beteckning och orenheter) och eventuella inledande reningsåtgärder.
Den uppskattade noggrannheten.
4.1.2.3.4. HÄNVISNINGAR OECD, Paris, Test Guideline 102, rådets beslut K(81) 30 slutligt, 1981. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds, Experimental thermodynamics, Butterworths, London1975, vol. II, 803–834. R. Weissberg ed., Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959,, vol. I del I kapitel VII. IUPAC, Physiochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, vol. 48, 1976, 505–515.
A.2 KOKPUNKT
A.2
1. METOD De flesta av de beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlinjer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinciperna anges i hänvisningarna 2 och 3.
1.
1.1. INLEDNING De metoder och anordningar som beskrivs här kan användas för alla vätskor och ämnen med låg smältpunkt, förutsatt att det inte inträffar någon kemisk reaktion under kokpunkten (t.ex. autooxidation, omordning, nedbrytning). Metoderna kan användas för alla vätskor, oavsett renhetsgrad. De metoder där man använder bestämning med fotocell och de som är baserade på termisk analys framhävs särskilt eftersom de kan användas för bestämning av både smält- och kokpunkter. Dessutom kan dessa mätningar utföras automatiskt. Den dynamiska metoden har den fördelen att den också kan användas för bestämning av ångtryck, och det är inte nödvändigt att korrigera kokpunkten till standardtryck (101,325 kPa) eftersom standardtrycket kan ställas in med en manostat under mätningen. Anmärkningar: Orenheters inflytande på kokpunktsbestämningen beror i hög grad på arten av orenhet. Om provet innehåller flyktiga orenheter, som kan påverka resultaten, kan ämnet eventuellt lenas.
1.2. DEFINITIONER OCH ENHETER Standardkokpunkten definieras som den temperatur vid vilken en vätskas ångtryck är 101,325 kPa. Om kokpunkten inte mäts vid normalt atmosfäriskt tryck kan ångtryckets beroende av temperaturen beskrivas genom Clausius-Clapeyrons ekvation: log p = Δ Hv2,3 RT+konst. där: p ämnets ångtryck i pascal A Hv ämnets förångningsvärme i J mol-1 R den universella gaskonstanten = 8,314 J mol-1 K-1 T termodynamisk temperatur i K Kokpunkten anges i förhållande till det aktuella trycket under mätningen. Omvandling Tryck (enhet: kPa) 100 kPa bar = 0,1 MPa (enheten bar är fortfarande tillåten men rekommenderas inte). 133 Pa 1 mm Hg = 1 Torr (enheterna mm Hg och Torr är inte tillåtna). 1 atm standardatmosfär = 101325 Pa (enheten atm är inte tillåten). Temperatur (enhet: K) t = T – 273,15 t temperatur i grader Celsius ( oC) T termodynamisk temperatur i kelvin (K)
1.3 REFERENSÄMNEN Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder. I de metoder som anges i tillägget anges vissa referensämnen.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Det finns fem metoder för bestämning av kokpunkten (kokpunktsintervallet) som är baserade på mätning av den temperatur vid vilken proven kokar, och två metoder som är baserade på termisk analys.
1.4
1.4.1 Bestämning med hjälp av ebulliometer Ebulliometern utvecklades ursprungligen för molekylviktsbestämning via kokpunktshöjningar, men de lämpar sig även för exakt bestämning av kokpunkter. En mycket enkel apparat beskrivs i ASTM D 1120-72 (se tillägg). I denna apparat uppvärms vätskan under jämviktsbetingelser i atmosfäriskt tryck tills den kokar.
1.4.2 Dynamisk metod Genom denna metod mäts ångans förtätningstemperatur med hjälp av en lämplig termometer i återloppet vid kokning. Med denna metod kan trycket varieras.
1.4.3 Destillationsmetod för bestämning av kokpunkt Genom denna metod destilleras vätskan, och ångans förtätningstemperatur och destillatmängden mäts.
1.4.4 Siwoloboffs metod Ett prov uppvärms i ett provrör som är nedsänkt i vätska i ett värmebad. Ett sammangjutet kapillärrör med en luftbubbla i den nedre änden sänks ned i provröret.
1.4.5 Bestämning med fotocell Vid användning av Siwoloboffs princip sker automatisk fotoelektrisk mätning av uppstigande bubblor.
1.4.6 Differentiell termisk analys Genom denna metod registrerar temperaturskillnaden mellan ämnet och ett referensämne som en funktion av temperaturen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrollerade temperaturprogram. En fasöver-gång i provet som åtföljs av en entalpiändring visar sig genom en endoterm (smältning) eller exoterm (frysning) avvikelse från den registrerade baslinjen.
1.4.7 Differentiell scanningkalorimetri Genom denna metod registreras skillnaden i den energimängd som tillförs ett ämne och ett referensmaterial som en funktion av temperaturen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrollerade temperaturprogram. Denna skillnad motsvarar den energi som är nödvändig för att upprätthålla en temperaturskillnad på noll mellan ämnet och referensmaterialet. En fasövergång i provet som åtföljs av en entalpiändring visar sig genom en endoterm (smältning) eller exoterm (frysning) avvikelse från den registrerade baslinjen.
1.5 Tabell 1 Jämförelse av metoderna
KVALITETSKRITERIER I tabell 1 anges de olika metodernas lämplighet och noggrannhet vid bestämning av kokpunkt/kokpunktsintervall. Mätmetod Uppskattad noggrannhet Befintliga standarder Ebulliometer ±1,4 K (upp till 373 K) ±2,5 K (upp till 600 K) ASTM D 1120-72 Dynamisk metod ±0,5 K (upp till 600 K) Destillationsprocess (kokpunktsintervall) ±0,5 K (upp till 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71 Siwoloboffs metod ± 2 K (upp till 600 K) Bestämning med fotocell ±0,3 K (vid 373 K) Differentiell termisk kalorimetri ±0,5 K (upp till 600 K) ±2,0 K (upp till 1273 K) ASTM E 537-76 Differentiell scanningkalorimetn ±0,5 K (upp till 600 K) ±2,0 K (upp till 1273 K) ASTM E 537-76
1.6 METODBESKRIVNING Tillvägagångssättet för vissa metoder beskrivs i internationella och nationella standarder (se tillägg).
1.6
1.6.1 Ebulliometer Se tillägg.
1.6.2 Dynamisk metod Se testmetod A.4 för bestämning av ångtrycket. Den kokpunkt, som iakttas vid ett tryck av 101,325 kPa, antecknas.
1.6.3 Destillationsförlopp (kokpunktsintervall) Se tillägg.
1.6.4 Siwoloboffs metod Provet uppvärms i en smältpunktsapparat i ett provrör med en diameter på ungefär 5 mm (se figur 1). Figur 1 visar en typ av en standardiserad smält- och kokpunktsapparat (JIS K 0064) (gjord av glas, alla mått i mm). Ett kapillärrör, som är tillslutet ungefär 1 cm ovanför den nedre änden, placeras i provröret. Provet fylls så högt upp att den tillslutna delen av kapillärröret befinner sig under vattenytan. Provröret med kapillärröret fästs vid termometern med ett gummiband eller med ett stöd från sidan (se figur 2). Figur 2 Siwoloboffs princip Figur 3 Modifierad princip Badvätskan väljs med hänsyn till kokpunkten. Vid temperaturer upp till 573 K kan silikonolja användas. Paraf-finolja kan endast användas upp till 473 K. Uppvärmningen av badvätskan ska i början regleras till en temperaturstegring av 3 K/min, under omrörning. Vid ungefär 10 K under den förväntade kokpunkten sänks värmetillförseln så att temperaturstegringen blir mindre än 1 K/min. När temperaturen närmar sig kokpunkten börjar bubblor strömma ut från kapillärröret. Kokpunkten är den temperatur då bubbelströmmen under en kortvarig temperaturminskning upphör och vätskan börjar stiga upp i kapillärröret. Termometeravläsningen visar ämnets kokpunkt. I den modifierade principen (se figur 3) bestäms kokpunkten i ett kapillärrör avsett för smältpunktsbestämning. Det sträcks till en finspetsig tråd, ungefär 2 cm lång (a), och en liten provmängd sugs upp. Den öppna änden av det fina kapillärröret tillsluts genom smältning på så vis att en liten luftbubbla blir kvar i änden. Vid uppvärmning i smältpunktsapparaten (b) utvidgar sig luftbubblan. Kokpunkten är den temperatur vid vilken ämnesproppen når upp till ytan av badvätskan.
1.6.4
Figur 1 A: Mätkärl B: Propp C: Luftningshål D: Termometer E: Hjälptermometer F: Badvätska G: Provrör, högst 5 mm ytterdiameter, med ett ca 100 mm långt kapillärrör med en innerdiameter av ca 1 mm och en väggtjocklek av ca 0,2 - 0,3 mm. H: Sidorör
1.6.5 Bestämning med fotocell Provet uppvärms i ett kapillärrör i ett uppvärmt metallblock. En ljusstråle riktas via lämpliga hål i blocket genom ämnet mot en exakt inställd fotocell. Medan provets temperatur stiger utvecklas enstaka luftbubblor från kapillärröret. När kokpunkten är nådd ökar antalet bubblor kraftigt. Detta leder till att styrkan ändras på det ljus som är riktat mot fotocellen och en stoppsignal sänds till en indikator som visar temperaturen på en motståndstermometer av platina som är placerad i blocket. Denna metod är särskilt användbar eftersom den kan användas för bestämningar under rumstemperatur ned till 253,15 K (- 20 oC) utan ändringar av apparaturen. Instrumentet ska endast placeras i ett kylbad.
1.6.6 Termisk analys
1.6.6
1.6.6.1 Differentiell termisk analys Se tillägg.
1.6.6.2 Differentiell scanningkalorimetri Se tillägg.
2. Tabell 2: Temperaturkorrektionsfaktorer ft
DATA Vid små avvikelser från normalt tryck (högst ± 5 kPa) korrigeras kokpunktstemperaturer till Tn med användning av följande Sidney Young ekvation: Tn = T + (fT x Δp) där: Δ p (101,325 – p) [observera förtecknet] P ptrycket mätt i kPa fT kokpunktens ändring med trycket i K/kPa T uppmätt kokpunkt i K Tn kokpunkt korrigerad till normalt tryck i K I ovannämnda internationella och nationella standarder finns temperaturkorrektionsfaktorer fT för ett flertal ämnen och ekvationer för approximation av dem. Exempelvis anges i DIN 53171 följande grova korrektioner för lösningsmedel som ingår i färger: Temperatur T (K) Korrektionsfaktor fT (K/kPa) 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
3. RAPPORTERING Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: Som kokpunkt anges medelvärdet av minst två mätningar, som ligger mom gränserna för den uppskattade noggrannheten (se tabell 1). De uppmätta kokpunkterna och medelvärdet av dessa ska anges, och det tryck vid vilket mätningarna gjordes ska anges i kPa. Trycket bör helst ligga i närheten av normalt atmosfäriskt tryck. Alla uppgifter och upplysningar av betydelse för tolkningen av resultaten ska anges, i synnerhet vad gäller orenheter och ämnets fysiska tillstånd.
Använd testmetod.
Noggrann beskrivning av substansen (beteckning och orenheter) och eventuella inledande reningsåtgärder.
Den uppskattade noggrannheten.
4.1.2.3. HÄNVISNINGAR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, rådets beslut K(81) 30 slutligt. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II. R. Weissberg ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Inter-science Publ., New York, 1959, vol. I, del I, kapitel VII.
A.3 RELATIV DENSITET
A.3
1. METOD De flesta av de beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlinjer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinciperna anges i hänvisning 2.
1.
1.1 INLEDNING De beskrivna metoderna för bestämning av relativ densitet kan användas för fasta ämnen och vätskor, oavsett renhetsgrad. De olika metoder som får användas anges i tabell 1.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Fasta ämnens och vätskors relativa densitet (D420) är förhållandet mellan det undersökta ämnets vikt per volymenhet, bestämd vid 20 oC och vikten per samma volymenhet vatten, bestämd vid 4 oC. Den relativa densiteten har ingen dimension. Ett ämnes densitet, Q, är kvoten av vikten, m, och dess volym, v. Densiteten, Q, anges, i SI-enheter, i kg/m3.
1.3 REFERENSÄMNEN (SE HÄNVISNING 1 OCH 3) Referensämnen behöver inte användas varje gång ett nytt ämne ska undersökas. De ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Fyra metoder används.
1.4
1.4.1 Flottörmetoder
1.4.1
1.4.1.1 Hydrometer (för vätskor) Tillräckligt noggranna och snabba densitetsbestämningar kan göras med flytande hydrometrar, med vilka en vätskas densitet kan härledas från nedsänkningsgraden som avläses på en skala.
1.4.1.2 Hydrostatisk balans (för vätskor och fasta ämnen) Skillnaden mellan provets vikt mätt i luft och i en lämplig vätska (t.ex. vatten) kan användas för att bestämma dess densitet. För fasta ämnen är den mätta densiteten endast representativ för just det prov som har använts vid bestämningen. När densiteten hos vätskor ska bestämmas vägs först en kropp med känd volym, v, i luft och sedan i vätskan.
1.4.1.3 Metod med nedsänkt kula (för vätskor) (se hänvisning 4) Med denna metod bestäms en vätskas densitet utifrån skillnaden mellan vätskans vikt före och efter nedsänkning av en kula med känd volym i testvätskan.
1.4.2 Pyknometermetoder Pyknometrar av olika utformning och med kända volymer kan användas till fasta ämnen och vätskor. Densiteten beräknas utifrån viktskillnaden mellan den fulla och den tomma pyknometern och dess kända volym.
1.4.3 Luftjämförelsepyknometer (för fasta ämnen) Densiteten hos ett fast ämne, oavsett form, kan bestämmas vid rumstemperatur med en gasjämförelsepyknometer. Ämnets volym mäts i luft eller en inert gas i en cylinder med varierbar kalibrerad volym. Densiteten beräknas genom att vikten mäts efter volymbestämningen.
1.4.4 Oscillerande densitometer (se hänvisning 5, 6 och 7) En vätskas densitet kan bestämmas med en oscillerande densitometer. En mekanisk oscillator i form av ett U-rör sätts i vibration vid en viss frekvens som är beroende på oscillatorns vikt. När ett prov införs ändras oscillatorns resonansfrekvens. Apparaturen ska kalibreras med två vätskor med känd densitet. Dessa vätskor ska helst väljas så att deras densiteter spänner över hela det område som ska mätas.
1.5 KVALITETSKRITERIER I tabellen anges de olika metodernas lämplighet för bestämning av densitet.
1.6 METODBESKRIVNING Tillägget innehåller en lista över några standarder, från vilka ytterligare tekniska uppgifter kan inhämtas. Mätningarna ska utföras vid 20 oC, och minst två mätningar ska göras.
2. DATA Se standarder.
3. Tabell 1.4.1.1.1.4.1.21.4.1.31.4.21.4.31.4.4 Metodernas lämplighet
RAPPORTERING Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: Den relativa densiteten D204 ska anges enligt definitionen i 1.2 tillsammans med det undersökta ämnets fysiska tillstånd. Alla uppgifter och anmärkningar av betydelse för tolkningen av resultaten ska rapporteras, i synnerhet vad gäller orenheter och ämnets fysiska tillstånd. Mätmetod Densitet Maximal dynamisk viskositet Befintliga standarder Fasta Vätskor Hydrometer ja 5 Pa s ISO 387, ISO 649-2, NF T 20-050 Hydrostatisk balans ja ISO 1183 (A) ja 5 Pa s ISO 901 and 758 Metod med nedsänkt kula ja 20 Pa s DIN 53217 Pyknometer ISO 3507 ja ISO 1183(B), NF T 20-053 ja 500 Pa s ISO 758 Luftjämförelsepyknometer ja DIN 55990 Teil 3, DIN 53243 Oscillerande densitometer yes 5 Pa s
Använd testmetod.
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter) och eventuella inledande reningsåtgärder.
3. Tabell 1.4.1.1.1.4.1.2 Metodernas lämplighet a)
fasta ämnen
b)
vätskor
3. Tabell 1.4.1.1.1.4.1.21.4.1.31.4.2 Metodernas lämplighet a)
fasta ämnen
b)
vätskor
4.1.2.3.4.5.6.7.
HÄNVISNINGAR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, rådets beslut K(81) 30 slutligt. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., kapitel IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, del 1. IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, s. 508. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Fliüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, s. 427–430. Leopold, H., Die digitale Messung von Flussigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, s. 297–302. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei fliüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, s. 717–726. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, s. 253–255.
A.
4. ÅNGTRYCK
1. METOD De flesta av de beskrivna metoder som beskrivs är baserade på OECD:s riktlinjer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinciperna anges i hänvisningarna 2 och 3.
1.
1.1 INLEDNING Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap om ämnets struktur, smältpunkt och kokpunkt. Det finns inte någon enskild metod som kan användas över hela ångtrycksområdet. Därför rekommenderas flera metoder för mätning av ångtryck från < 10-4 till 105 Pa. Orenheter inverkar normalt på ångtrycket och graden av denna inverkan beror i hög grad på arten av orenhet. Om provet innehåller flyktiga orenheter som kan inverka på resultatet kan ämnet renas. Det kan också vara lämpligt att ange ångtrycket för det tekniska materialet. För vissa av de metoder som beskrivs här används apparater med metalldelar. Detta bör beaktas vid undersökning av frätande ämnen.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Ett ämnes ångtryck definieras som mättnadstrycket över ett fast ämne eller en vätska. Vid termodynamisk jämvikt är ett rent ämnes ångtryck endast en funktion av temperaturen. Den SI-enhet för tryck som används är pascal (Pa). Nedan följer några enheter som tidigare har använts, och deras omvandlingsfaktorer: 1 Torr (= 1 mm Hg) = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfär = 0,013 × 105 Pa 1 bar =105 Pa SI-enheten för temperatur är kelvin (K). Den universella gaskonstanten R är 8,314 J mol-1 K-1. Temperaturens beroende av ångtrycket beskrivs genom Clausius-Clapeyrons ekvation: log p = Δ Hv2,3 RT+konst. där: p ämnets ångtryck i pascal A Hv ämnets forångningsvärme i J mol-1 R den universella gaskonstanten i J mol-1 K-1 T termodynamisk temperatur i K
1.3 REFERENSÄMNEN Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Till bestämning av ångtrycket föreslås sju metoder som kan tillämpas i olika ångtrycksområden. För varje metod bestäms ångtrycket vid olika temperaturer. I ett begränsat temperaturområde är logaritmen för en rent ämnes ångtryck en linjär funktion av det inverterade värdet av temperaturen.
1.4
1.4.1 Dynamisk metod Med den dynamiska metoden mäts den kokpunkt som motsvarar ett givet tryck. Rekommenderat område: 103 till 105 Pa. Denna metod rekommenderas även för bestämning av normal kokpunkt och kan användas i detta syfte upp till 600 K.
1.4.2 Statisk metod Med den statiska metoden bestäms ångtrycket i ett slutet system, som är i termodynamisk jämvikt vid en given temperatur. Denna metod lämpar sig för fasta ämnen och vätskor som består av en eller flera komponenter. Rekommenderat område: 10 upp till 105 Pa. Denna metod kan också användas i området 1 till 10 Pa, under förutsättning att försiktighet iakttas.
1.4.3 Isoteniskop Denna standardiserade metod är också en statisk metod men den kan normalt inte användas för flerkomponents-system. Ytterligare information finns i ASTM metod D-2879-86. Rekommenderat område: 100 till 105 Pa.
1.4.4 Effusionsmetod: Ångtrycksjämvikt Den mängd ämne som avgår ur en cell per tidsenhet genom en öppning av känd storlek, bestäms under vakuum så att den mängd ämne som återvänder till cellen är försumbar (t.ex. genom mätning av den puls som en ångstråle framkallar på en känslig våg eller genom att mäta viktförlusten). Rekommenderat område: 1C-3 till 1 Pa.
1.4.5 Effusionsmetod: genom viktförlust eller med en kylfälla Denna metod ar baserad på bestämning av den mängd testämne som under ultravakuum strömmar ut från en Knudsen-cell (se hänvisning 4) genom en mikroöppning per tidsenhet i gasform. Volymen av den utströmmade ångan kan konstateras antingen genom att bestämma cellens viktförlust eller genom att kondensera ångan vid låg temperatur och bestämma den förångade mängden ämne genom kromatografisk analys. Ångtrycket beräknas med användning av Hertz-Knudsen-relationen. Rekommenderat område: 10o till 1 Pa.
1.4.6 Gasmättnadsmetod En ström av inert bärargas leds över ämnet på ett sådant sätt att den mättas med ångan. Den mängd material som en känd bärargas transporterar kan antingen mätas genom insamling i en lämplig fälla eller genom in-line analys. Utifrån detta kan ångtrycket vid en given temperatur beräknas. Rekommenderat område: 10-4 till 1 Pa. Denna metod kan också användas i området 1 till 10 Pa, under förutsättning att försiktighet iakttas.
1.4.7 Rotormetod Med denna metod är det egentliga mätinstrumentet en liten stålkula som svävar i ett magnetfält och roterar med hög hastighet. Gastrycket utleds av den tryckavhängiga bromsningen av stålkulan. Rekommenderat område: 10-4 till 0,5 Pa.
1.5 Tabell 1.4.11.4.21.4.31.4.41.4.51.4.61.4.7 Kvalitetskriterier
KVALITETSKRITERIER I följande tabell jämförs de olika metoderna för bestämning av ångtrycket med hänsyn till användning, repeterbarhet, reproducerbarhet, mätområde och befintlig standard. Ebulliometer Ämnen Uppskattad repeterbarhet Uppskattad reproducerbarhet Re kommenderat område Befintlig standard Fasta Vätskor Dynamisk metod Låg smältning ja Upp till 25 % Upp till 25 % 103 Pa till 2 × 103 Pa — 1 till 5 % 1 till 5 % 2 × 103 Pa till 105 Pa — Statisk metod ja ja 5 till 10 % 5 till 10 % 10 Pa till 105 Pa NFT 20-048 (5) Isoteniskop ja ja 5 till 10 % 5 till 10 % 102 Pa till 105 Pa ASTM-D 2879-86 Effusionsmetod Ångtrycksvåg ja ja 5 till 20 % Upp till 50 % 10-3 Pa till 1 Pa NFT 20-047 (6) Effusionsmetod Viktförlust ja ja 10 till 30 % — 10-3 Pa till 1 Pa — Gasmättnadsmetod ja ja 10 till 30 % Upp till 50 % 10-4 Pa till 1 Pa — Rotormetod ja ja 10 till 20 % — 10-4 Pa till 0,5 Pa —
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Dynamisk mätning
1.6.1
1.6.1.1 Apparatur Mätinstrumentet består typiskt av ett kokkärl med ansluten kylare av glas eller metall (se figur 1), utrustning för mätning av temperaturen och utrustning för reglering och mätning av trycket. En typisk mätutrustning, som den som visas på ritningen, är gjord av värmebeständigt glas och består av fem delar: Ett stort, delvis dubbelväggigt rör som består av ett slipat förband, en kylare, ett kylkärl och ett inlopp. En glascylinder med en Cottrell-pump är monterad på rörets koksektion och har en grov yta av krossat glas för att undvika stötkokning. Temperaturen mäts med en lämplig temperaturgivare (t.ex. motståndstermometer eller termoelement med mantel) som har förts in i instrumentet helt till mätpunkten (se figur 1, nr 5) genom ett lämpligt inlopp (t.ex. slipat hanförband). De nödvändiga anslutningarna görs till tryckreglerings- och mätutrustningen. Kolven, som fungerar som en buffertvolym, är ansluten till mätapparaten med ett kapillärrör. Kokkärlet värms upp med ett värmeelement (t.ex. värmepatron) som sätts in i glasapparaturen nedifrån. Önskad strömstyrka ställs in och mäts med ett termoelement. Det vakuum på mellan 102 Pa och omkring 105 Pa som krävs ställs in med en vakuumpump. En passande ventil används för att reglera trycket med luft eller kväve (mätområde ca 102 till 105 Pa) och för utluftning. Trycket mäts med en manometer.
1.6.1.2 Mätförfarande Ångtrycket mäts genom bestämning av provets kokpunkt vid olika angivna tryck mellan ungefär 103 och 105 Pa. En jämn temperatur under konstant tryck visar att kokpunkten är nådd. Skummande ämnens ångtryck kan inte mätas med denna metod. Ämnet placeras i det rena torkade testkärlet. Det kan uppstå problem med fasta ämnen som inte är i pulverform, men detta kan ibland undvikas genom att uppvärmning av kylmanteln. Sedan kärlet fyllts sammanflänsas apparaten och ämnet avgasas. Därefter ställs lägsta önskat tryck in och uppvärmningen sätts på. Samtidigt ansluts temperaturgivaren till en skrivare. Jämvikt har nåtts när en konstant kokpunkt registreras vid konstant tryck. Man ska särskilt se till att stötkokning inte förekommer. Dessutom måste fullständig kondensation ske i kylaren. Vid bestämning av ångtrycket av fasta ämnen med låg smältpunkt ska man se till att kylaren inte täpps till. Sedan jämviktspunkten har registrerats ställs ett högre tryck in. Processen fortsätter på samma sätt tills 105 Pa har uppnåtts (sammanlagt ungefär 5–10 mätpunkter). I kontrollsyfte ska jämviktspunkterna upprepas vid avtagande tryck.
1.6.2 Statisk mätning
1.6.2
1.6.2.1 Apparatur Apparaten består av en provbehållare och ett uppvärmnings- och kylsystem för att reglera och mäta provets temperatur. Apparaten omfattar dessutom utrustning för inställning och mätning av trycket. Grundprinciperna framgår av figur 2a och 2b. Provkammaren (se figur 2a) är på den ena sidan avgränsad av en lämplig högvakuumventil och på den andra sidan förbunden med ett U-rör som innehåller lämplig manometervätska. Den ena anden av U-roret är ansluten till vakuumpumpen, till kvävecylindern eller utluftningsventilen och en manometer. En tryckmätare med en separat visare kan användas i stället för U-röret (se figur 2b). Provets temperatur styrs genom att provkärlet, inklusive ventil och U-rör, placeras i ett bad som har en konstant temperatur av ±0,2 K. Temperaturen mäts på provkärlets utsida eller i själva kärlet. En vakuumpump med en kylfälla för evakuering av apparaten används. I metod 2a mäts ämnets ångtryck indirekt med en nollindikator. Därvid beaktas att densiteten av vätskan i U-röret ändrar sig vid stora temperaturförändringar. Följande vätskor är lämpliga som nollindikatorer i U-röret och väljs med hänsyn till tryckområdet och testämnets kemiska egenskaper: silikonvätskor och ftalater. Testämnet får inte kunna lösas väsentligt i eller reagera med vätskan i U-röret. I manometern kan man använda kvicksilver i området från normalt lufttryck till 102 Pa, medan silikonvätskor och ftalater är lämpliga från 102 Pa ned till 10 Pa. Värmebeständiga membrankondensatormanometrar kan till och med användas under 10-1 Pa. Det finns även andra tryckmätare som kan användas under 102 Pa.
1.6.2.2 Mätförfarande Före mätningen ska alla delar av apparaten i figur 2 rengöras och torkas noggrant. Vid metod 2a fylls U-röret med önskad vätska, som avgasas vid förhöjd temperatur före avläsning. Testämnet placeras i apparaten som sedan stängs, varvid temperaturen sänks tillräckligt för avgasning. Temperaturen måste vara så pass låg att luften sugs ut, men i fråga om flerkomponentsystem får det inte ske någon ändring av materialets sammansättning. Vid behov kan jämvikt erhållas snabbare genom omrörning. Provet kan underkylas med t.ex. flytande kväve (varvid försiktighet iakttas för att undvika kondensering av luft eller pumpvätska) eller en blandning av etanol och kolsyresnö. Vid mätning av låga temperaturer används ett temperaturreglerat bad som är anslutet till en ultrakryomat. Med ventilen över provkammaren i öppet läge pumpas därefter den inneslutna luften ut ur apparaten i flera minuter. Därefter stängs ventilen och provet kyls till lägsta vald temperatur. Vid behov upprepas avgasningsproceduren. När provet värms upp ökar ångtrycket. Detta ändrar jämvikten hos vätskan i U-röret. För att kompensera detta leds kväve eller luft in i apparaten via en ventil tills tryckindikatorvärskan åter är på noll. Det tryck som krävs för detta avläses på en precisionsmanometer vid rumstemperatur. Detta tryck motsvarar ämnets ångtryck vid den särskilda mättemperatur. Metod 2b är en liknande metod, men ångtrycket avläses direkt. Ångtryckets temperaturberoende bestäms med tillräckligt små temperaturintervall (omkring 5 till 10 mätpunkter totalt) upp till önskat maximum. Lågtemperaturmätningar måste upprepas i kontrollsyfte. En eventuell avvikelse mellan de nya värdena och den kurva som erhållits vid stigande temperatur kan bero på att
1.6.2.2
1. provet fortfarande innehåller luft (t.ex. ämnen med hög viskositet) eller lågkokande ämnen, som frigjorts under uppvärmningen och kan avlägsnas genom ytterligare underkylning,
2. nedkylningstemperaturen inte är tillräckligt låg, varvid flytande kväve används som kylmedel; om antingen 1 eller 2 är fallet måste mätningarna upprepas;
3. det sker en kemisk reaktion i ämnet i det undersökta temperaturområdet (t.ex. dekomposition eller polymerisation).
1.6.3 Isoteniskop En fullständig beskrivning av denna metod finns i hänvisning 7. Mätanordningens princip framgår av figur 3. I likhet med den statiska metoden, som beskrivits i 1.6.2, lämpar sig isoteniskopet för undersökning av fasta ämnen eller vätskor. Vid mätning av vätskor fungerar själva ämnet som hjälpmanometervätska. Den mängd ämne som behövs för att fylla klotet och manometersektionens korta arm placeras i isoteniskopet. Isoteniskopets förbinds med ett vakuumsystem, evakueras och fylls med kväve. Evakueringen och rensningen av systemet upprepas två gånger så att alla kväverester avlägsnas. Det fyllda isoteniskopet placeras horisontellt så att provet fördelas i ett tunt lager i provkolven och manometersektionen (U-delen). Trycket i systemet minskas till 133 Pa och provet värms försiktigt upp tills det nästan kokar (avlägsnande av upplösta fixerade gaser). Isoteniskopet placeras sedan så att provet återgår till klotet och manometerns korta arm och båda är helt fyllda med vätska. Samma tryck som vid avgasning upprätthålls. Provkolvens utdragna topp värms försiktigt upp med en liten låga tills den ånga som bildas utvidgas tillräckligt för att pressa ut en del av provet från klotets översta del och manometerarm till isoteniskopets manometersektion, varvid ett ångfyllt, kvävefritt område skapas. Isoteniskopet placeras sedan i ett bad med konstant temperatur och kvävetrycket ställs in tills det motsvarar provets tryck. Att tryckjämvikt föreligger framgår av isoteniskopets manometersektion. Vid jämvikt motsvarar kvävets ångtryck ämnets ångtryck. När det gäller fasta ämnen används, beroende på tryck och temperaturområde, de manometervätskor som anges i 1.6.2. Den avgasade manometervätskan fylls in i utbuktningen på isoteniskopets långa arm. Därefter placeras det fasta testämnet i klotet och avgasas vid förhöjd temperatur. Sedan lutas isoteniskopet så att manometer-vätskan kan flyta in i U-röret. Mätningen av ångtrycket som en funktion av temperaturen utförs enligt 1.6.2.
1.6.4 Effusionsmetod: Ångtrycksvåg
1.6.4
1.6.4.1 Apparatur I litteraturen (se hänvisning 1) beskrivs flera olika apparaturutformningar. Den apparat som beskrivs här illustrerar de principer som används (se figur 4). Figur 4 visar apparaturens huvudkomponenter: en högvakuumbehållare av rostfritt stål eller glas, utrustning för att producera och mäta vakuum och inbyggda komponenter för mätning av ångtrycket på en våg. Apparaturen innehåller följande inbyggda komponenter:
En förångningsugn med fläns och roterande intag. Förångningsugnen är en cylindrisk behållare gjort av t.ex. koppar eller en kemiskt beständig legering med god värmeledningsförmåga. Man kan också använda en glasbehållare med kopparvägg. Ugnen har en diameter av ca 3 till 5 cm och en höjd av 2 till 5 cm. Det finns en till tre öppningar av olika storlek för ångströmmen. Ugnen värms upp antingen av en värmeplatta nedtill eller av en värmeslinga runt utsidan. För att undvika avledning av värme till bottenplattan är värmeaggregatet fastgjort i denna med en metall med låg värmeledningsförmåga (nickel-silver eller kromnickelstål), t.ex. ett nickel-silverrör fastsatt i ett roterade intag, om man använder en ugn med flera öppningar. En sådan uppställning har den fördelen att det möjliggör införande av en kopparstång, vilket tillåter kylning från utsidan med ett vattenbad,
Om ugnslocket, som är gjort av koppar, har tre öppningar med olika tvärsnitt, inbördes förskjutna 90 oC, kan olika ångtrycksområden inom den totala mätområdet täckas (öppningar med diametrar på ca 0,30 till 4,50 mm). Stora öppningar används för lågt ångtryck och vice versa. Genom att vrida ugnen kan önskadugnsöppning eller ett mellanläge i ångströmmen (ugnsöppning – skärm – vågskål) ställas in och molekylstrå-len riktas eller avledas genom ugnsöppningen mot vågskålen. För att kunna mäta ämnets temperatur mon-teras ett termoelement eller en motståndstermometer på lämpligt ställe.
Ovanför skärmen finns en vågskål med en mycket känslig mikrovåg (se nedan). Vågskålen är omkring30 mm i diameter. Guldpläterad aluminium är ett lämpligt material.
Vågskålen omges av en cylindrisk kylbox av mässing eller koppar. Beroende på typ av våg är den förseddmed öppningar för vågbalken och en skärmöppning för molekylströmmen och den ska garantera total kon-densation av ångan på vågskålen. Värmen leds bort till utsidan av t.ex. en kopparstång ansluten till kyl-boxen. Stången leds genom bottenplattan och är värmeisolerad från denna med t.ex. ett rör av kromnick-elstål. Stången sänks ned i ett dewarkärl med flytande kväve under bottenplattan, eller så leds flytande kvävegenom stången. Temperaturen i kylboxen hålls på så sätt vid omkring –120 oC. Vågskålen kyls ned uteslu-tande genom strålning, vilket är lämpligt för det tryckområde som undersöks (nedkylning omkring 1 timmeinnan mätning påbörjas).
Vågen placeras ovanför kylboxen. Lämpliga vågar är t.ex. en högkänslig 2-armad elektronisk mikrovåg (sehänvisning 8) eller ett högkänsligt vridspoleinstrument (se OECD Test Guideline 104, Edition 12.05.81).
På bottenplattan finns också elektriska anslutningar för termoelement (eller motståndstermometrar) och vär-meslingor.
Ett vakuum erhålls i kärlet med hjälp av en partiell vakuumpump eller en högvakuumpump (krävt vakuumomkring 1 till 2 × 10-3 Pa, erhållet efter 2 timmars pumpning). Trycket regleras med en lämplig joniserings-manometer.
1.6.4.2 Mätförfarande Kärlet fylls med testämnet och locket stängs. Skärmen och kylboxen skjuts på plats över ugnen. Apparaten stängs och vakuumpumparna sätts på. Sluttrycket innan mätningen påbörjas ska vara ungefär 10-4 Pa. Nedkylning av kylboxen sätts igång vid 10-2 Pa . När tillräckligt vakuum har uppnåtts inleds kalibreringsserien vid den lägsta temperaturen. Den nödvändiga öppningen öppnas och ångstrålen passerar skärmen, som är direkt monterad över locket, och träffar sedan den nedkylda vägskålen. Vågskålen ska vara så stor att hela den ångsträle som leds genom skärmen träffar den. Ång-strålens impuls överför en kraft på vågskålen och molekylerna kondenseras på dess nedkylda yta. Impulsen och den samtida kondensationen frambringar en signal på skrivaren. Utvärdering av denna signal ger två upplysningar: p = G 2 π RT×103M där: G avdunstningshastig het (kg s-1 m-2) M molekylvikt (g mol-1) T temperatur (K) R universell gaskonstant Jmol-1 K-1) p ångtryck (Pa) När tillräckligt vakuum har uppnåtts börjar serien av mätningar vid den lägsta önskade mättemperaturen. För ytterligare mätningar ökas temperaturen med små intervaller tills den högsta önskade temperaturen är uppnådd. Därefter kyls provet ned igen och en andra ångtryckskurva kan registreras. Om den andra testomgången inte bekräftar resultaten från den första omgången kan detta bero på att ämnet bryts ned i det undersökta temperaturområdet.
1.6.4.2
1. Med den särskilda apparat som beskrivs här bestäms ångtrycket direkt från den impuls som överförs till vågskålen (molekylvikten behöver inte vara känd [se hänvisning 2]). Vid utvärdering av avläsningarna måsteman ta hänsyn till geometriska faktorer, såsom ugnsöppning och molekylstrålens vinkel.
2. Samtidigt kan den kondenserade vikten mätas och avdunstningshastigheten beräknas utifrån detta. Ång-trycket kan även beräknas utifrån avdunstningshastigheten och molekylvikten med användning av Hertzekvation (se hänvisning 2):
1.6.5 Effusionsmetod: Viktförlust
1.6.5
1.6.5.1 Apparatur En effusionsapparat består av följande baskomponenter: En elektriskt uppvärmd vakuumbehållare av aluminium med 4 effusionsceller av rostfritt stål visas i figur 5 som ett exempel. Den rostfria folien som är omkring 0,3 mm tjock har en effusionsöppning med en diameter av 0,2 till 1,0 mm och är ansluten till effusionscellen med ett skruvlock.
En behållare som kan termostatregleras och evakueras och i vilken effusionscellerna placeras.
En högvakuumpump (t.ex. diffusionspump eller turbomolekylärpump) med vakuummätare.
En kylfålla med flytande kväve eller kolsyresnö.
1.6.5.2 Mätförfarande Referens- och testämnet tillsätts i varje effusionscell, metallmembranet med öppningarna sätts fast med skruvlocket, och varje cell vägs till 0,1 mg noggrannhet. Cellen placeras i den termostatreglerade apparaten som sedan evakueras till mindre än en tiondedel av det förväntade trycket. Med i förväg fastställda intervaller på mellan 5 och 30 timmar tillförs luft i apparaten och viktförlusten i effusionscellerna bestäms genom vägning. För att säkerställa att resultaten inte påverkas av flyktiga orenheter vägs cellerna vid fastställda tidsintervaller för att kontrollera att avdunstningshastigheten är konstant under minst två sådana tidsintervaller. Ångtrycket p i effusionscellen beräknas genom p = mKAt2 π R TM där: p ångtrycket (Pa) m massan av den mängd ämne som lämnar cellen under tiden t (kg) t tiden (s) A öppningens area (m2) K korrektionsfaktor R universell gaskonstant Jmol-1 Kh-1) T temperaturen (K) M molekylvikten (kg mol-1) Korrektionsfaktorn K beror på förhållandet mellan den cylindriska öppningens längd och radie: Förhållande: 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0 K 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514 Ovanstående ekvation kan också skrivas som p = E mtTM där E = 1KA2πR är effusionseelkonstanten. Denna effusionscellkonstant E kan bestämmas med referensämnen (2,9) med användning av följande ekvation: E = p(r)tmM(r)T där: p(r) referensämnets ångtryck (Pa) M(r) referensämnets molekylvikt (kg mol-1)
1.6.6 Gasmättnadsmetod
1.6.6
1.6.6.1 Apparatur En typisk apparat som används till detta test består av de komponenter som visas i figur 6a och beskrivs nedan (se hänvisning 1).
1.6.6.1 Inert gas:
Bärargasen får inte reagera kemiskt med testämnet. Normalt är det tillräckligt att använda kväve för detta syfte men ibland kan andra gaser krävas (se hänvisning 10). Den använda gasen ska vara torr (se figur 6a, position 4: Givare. Relativ fuktighet).
Flödesreglering:
Ett lämpligt gasregleringssystem krävs för att säkerställa ett konstant och väljbart flöde genom mättnadskolonnen.
Fällor för uppsamling av ånga:
Dessa är beroende av det aktuella provets egenskaper och den valda analysmetoden. Ångan ska infångas kvantitativt och i en form som medger efterföljande analys. För vissa provämnen lämpar sig fällor innehållande vätskor som hexan eller etylenglykol. För andra kan fasta absorptionsmedel användas. Som alternativ till uppsamling av ånga och efterföljande analys kan in-line analystekniker, t.ex. kromatografi, användas för kvantitativ bestämning av den mängd material som en känd mängd bärargas för med sig. Dessutom kan provets förlust av massa mätas.
Värmeväxlare:
För mätning vid olika temperaturer kan det vara nödvändigt att inkludera en värmeväxlare i utrustningen.
Mättnadskolonn:
Provämnet appliceras i form av losningsbeläggning på ett lämpligt inert bärarmatenal. Det belagda bärarmaterialet packas i mättnadskolonnen, vars dimensioner och flödeshastighet ska vara sådana att en fullständig mättnad av bärargasen säkerställs. Mättnadskolonnen ska vara termostatreglerad. För mätningar över rumstemperatur ska stycket mellan mättnadskolonnen och fällorna uppvärmas för att förhindra kondensation av provämnet. För att minska masstransport genom diffusion kan ett kapillärrör placeras efter mättnadskolonnen (se figur 6b).
1.6.6.2 Mätförfarande
1.6.6.2 Förberedelse av mättnadskolonnen:
En upplösning av provämnet i ett mycket flyktigt lösningsmedel tillsätts till en lämplig mängd bärarmaterial. Tillräckligt med provämne ska tillsättas för att upprätthålla mättnaden så länge testet pågår. Lösningsmedlet avdunstar helt i luft eller i en roterande förångare och det noggrant blandade materialet tillsätts till mättnadskolonnen. Efter termostatreglering av provet leds kväve genom apparaten.
Mätning:
Fällorna eller in-line detektoren ansluts till kolonnens utlopp och tiden registreras. Flödeshastigheten kontrolleras i början och med jämna mellanrum under testet med en bubbelmätare (eller kontinuerligt med en massflö-desmätare). Trycket vid mättnadskolonnens utgångsöppning ska mätas. Detta kan göras Den tid som krävs till uppsamling av den mängd provämne som behövs för de olika analysmetoderna, bestäms vid preliminära försök eller genom uppskattningar. Som ett alternativ till uppsamling av ämnet för senare analys kan kvantitativa in-line analystekniker användas (t.ex. kromatografi). För beräkning av ångtrycket vid en given temperatur utförs preliminära försök för att bestämma den maximala flödeshastigheten vid vilken bärargasen mättas fullständigt med ämnets ånga. Detta säkerställs om bärargasen leds genom mättnadskolonnen så pass sakta att en lägre hastighet inte ger ett större beräknat ångtryck. Valet av analysmetod bestäms av arten av det ämne som ska undersökas (t.ex. gaskromatografi eller gravime-tri). Den mängd ämne som en känd volym bärargas transporterar bestäms.
a)
genom att en tryckmätare insätts mellan mättnadskolonnen och fällorna (vilket kan vara otillfredsställandeeftersom det ökar dödvolymen och adsorptionsytan), eller
b)
genom att bestämma tryckfallet över det använda systemet av fällor som funktion av flödeshastigheten i ettseparat test (eventuellt inte så lyckat för vätskefällor).
1.6.6.3 Beräkning av ångtryck Ångtrycket beräknas utifrån ångans densitet, W/V, genom ekvationen: p = WV × RTM där; p ångtrycket (Pa) W vikten av adsorberat provämne (g) V volymen mättad gas (m3) R universell gaskonstanten (Jmol-1 K-1) T temperaturen (K) M testämnets molekylvikt (g mol-1). De mätta volymerna ska korrigeras för tryck- och temperaturskillnader mellan flödesmätaren och den termostatreglerade mättnadskolonnen. Om flödesmätaren är placerad nedströms från ångfällan kan det vara nödvändigt med korrektioner för att ta hänsyn till eventuella avdunstade beståndsdelar från fällorna (se hänvisning 1).
1.6.7 Rotormetod (se hänvisning 8, 11, 13)
1.6.7
1.6.7.1 Apparatur Rotormetoden kan utföras med en viskocitetsmätare med en roterande kula enligt figur 8. En schematisk ritning av försöksuppställningen visas i figur 7. Mätapparaten består typiskt av ett mäthuvud med roterande kula placerad i en termostatreglerad inhägnad (reglerad inom 0,1 oC). Provbehållaren placeras i en termostatreglerad inhägnad (reglerad inom 0,01 oC) och alla andra delar i utrustningen hålls vid en högre temperatur för att förhindra kondensation. En högvakuumpump-anordning ansluts till systemet genom högvakuumventiler. Mäthuvudet består av en stålkula (4 till 5 mm i diameter) i ett rör. Kulan hålls stabilt svävande av ett magnetfält, normalt genom en kombination av permanentmagneter och styrspolar. Kulan sätts i rörelse med hjälp av roterande fält som produceras av spolarna. Rotationshastigheten mäts med detektorspolar, som mäter den alltid närvarande svaga tvärmagnetiseringen av kulan.
1.6.7.2 Mätförfarande När kulan har nått en bestämd rotationshastighet v(o) (normalt omkring 400 varv per sekund), avbryts energitillförseln, och gasfriktionen börjar retardera kulans rotation. Minskningen av rotationshastighet mäts som en funktion av tiden. När den friktion som orsakats av den magnetiska suspensionen är försumbar i jämförelse med gasfriktionen, bestäms gastrycket p genom: p = π c—r ρσ 10 t × ln v(t)v(o) där: c— gasmolekylernas medelhastighet r kulans radie p kulans massdensitet o koefficient av tangentiell impulsöverföring (ε = 1 för en ideal sfärisk kulyta) t tid v(t) rotationshastighet efter tid t v(o) initial rotationshastighet Denna ekvation kan även skrivas p = π c—r ρ10 σ × tn - tn-1tn × tn-1 där tn, tn.-1 är den tid som krävs för ett givet antal N varv. Dessa tidsintervaller tn, tn-1 följer på varandra och tn>tn-1. Gasmolekylens medelhastighet c— bestäms genom c— = 8 RTπ M12 där: T temperaturen R universella gaskonstanten M molekylvikten
2. DATA Ångtrycket från någon av föregående metoder ska bestämmas vid minst två temperaturer. För att kontrollera ångtryckskurvans linearitet är det önskvärt med tre eller flera bestämningar i området 0–50 oC.
3. RAPPORTERING Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: Om en övergång (tillståndsändring, nedbrytning) iakttas, ska följande uppgifter antecknas: Alla uppgifter och upplysningar av betydelse för tolkningen av resultaten ska rapporteras, särskild vad gäller orenheter och ämnets fysiska tillstånd.
Använd metod.
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter) och eventuella inledande reningsåtgärder.
Minst två värden för ångtryck och temperatur, helst i området 0–50 oC.
Alla rådata.
En kurva över log p, som funktion av l/T.
En beräkning av ångtrycket vid 20–25 oC.
Förändringens art.
Temperatur vid vilken förändringen inträffar vid atmosfäriskt tryck.
Ångtryck vid 10 och 20 oC under övergångstemperaturen och 10 och 20 oC över denna temperatur (såvidainte övergången sker från fast ämne till gas)
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.
HÄNVISNINGAR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, rådets beslut K(81) 30 slutlig. Ambrose, D. i B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London,1975, vol. II. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,kapitel IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, del 1. Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, s. 593. NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressureof solids and liquids within range from 10-1 tu 105 Pa – Static method. NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressureof solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. G. Messer, P. Röhl, G. Grosse, W. Jitschin, J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), s. 2440. Ambrose, D.; Lawrenson, I. J.; Sprake, C. H. S, J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, s. 1173. B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, s. 435. G. Comsa, J. K. Fremerey och B. Lindenau, J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), s. 642. G. Reich, J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), s. 1148. J. K. Fremerey, J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, vol. 3 (3), s. 1715.
A.5 YTSPÄNNING
A.5
1. METOD De beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlinjer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinciperna anges i hänvisning 2.
1.
1.1 INLEDNING De beskrivna metoderna används för matning av ytspänningen hos vattniga lösningar. Vid utförande av dessa test är det värdefullt att ha förhandskunskap om ämnets löslighet i vatten, dess struktur, hydrolysegenskaper och kritiska koncentrationer för micellbildning. Följande metoder kan tillämpas på de flesta kemiska ämnen, oavsett renhetsgrad. Mätning av ytspänning med ringtensiometermetoden är begränsad till vattniga lösningar med en dynamisk viskositet på mindre än 200 m Pa s.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Den fria entalpinytan per ytareaenhet betecknas som ytspänning. Ytspänningen anges som: N/m (SI-enhet) eller mN/m (SI-underenhet). 1 N/m = 103 dyn/cm 1 mN/m = dyn/cm i det gamla cgs-systemet.
1.3 REFERENSÄMNEN Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder. I hänvisningarna 1 och 3 anges referensämnen som täcker ett stort antal ytspänningar.
1.4 TESTMETODSPRINCIPER Metoderna är baserade på mätning av den största kraft som ska utövas vertikalt på en bygel eller ring i kontakt med vätskeytan av ett prov som ska undersökas i ett mätkärl för att bryta denna kontakt, eller den vertikala kraft som behöver utövas på en platta vars ena kant har kontakt med vätskeytan, för att lösgöra film som har bildats. Ämnen vars löslighet i vatten är minst 1 mg/liter testas i en vattnig lösning vid en enda koncentration.
1.5 KVALITETSKRITERIER Dessa metoder kan ge större noggrannhet än vad som kan förväntas krävas vid miljöbetingade undersökningar.
1.6 METODBESKRIVNING En lösning av ämnet framställs i destillerat vatten. Koncentrationen av denna lösning ska vara 90 % av ämnets mättnadskoncentration i vatten. Om denna koncentration är större än 1 g/1 används en koncentration av 1 g/l för testet. Ämnen med en löslighet i vatten på mindre än 1 mg/l behöver inte testas.
1.6
1.6.1 Plattmetoden Se ISO-304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
1.6.2 Bygelmetoden Se ISO 304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
1.6.3 Ringmetoden Se ISO 304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
1.6.4 OECD-harmoniserad ringmetod
1.6.4
1.6.4.1 Apparatur Denna mätning kan göras med kommersiellt tillgängliga tensiometrar och består av följande delar:
flyttbart provbord,
kraftmätningssystem,
mätkropp (ring),
mätkärl.
1.6.4.1
1.6.4.1.1 Flyttbart provbord Det flyttbara provbordet används som stöd till det temperaturreglerade mätkärl som innehåller den vätska som ska undersökas. Det är monterat på ett stativ tillsammans med kraftmätningssystemet.
1.6.4.1.2 Kraftmätnings system Kraftmätningssystemet (se figur) är placerat över provbordet. Osäkerheten vid kraftmätningen får inte vara större än ± 10-6 N, motsvarande en felmarginal på ±0,1 mg viktmätning. Oftast är mätskalan på kommersiellt tillgängliga tensiometrar indelad i mN/m så att ytspänningen kan avläsas direkt i mN/m med en noggrannhet på 0,1 mN/m.
1.6.4.1.3 Mätkropp (ring) Ringen är vanligtvis gjord av en tråd av platina-indium, ungefär 0,4 mm tjock och med en medelomkrets på 60 mm. Trådringen är upphängd horisontellt på en metallstång och en bärarm av tråd, som utgör anslutningen till kraftmätningssystemet (se figur).
1.6.4.1.3 Figur Mätkropp
(Alla mått är angivna i mm) Stång Bärarm Ring
1.6.4.1.4 Mätkärl Mätkärlet som innehåller den testlösning som ska mätas ska vara ett temperaturreglerat glaskärl. Det ska vara så utformat att temperaturen på provlösningen och på gasfasen ovanför dess yta förblir konstant under mätningen så att provet inte kan avdunsta. Cylindriska glaskärl med en innerdiameter på minst 45 mm kan användas.
1.6.4.2 Iordningställande av apparaturen
1.6.4.2
1.6.4.2.1 Rengöring Glaskärl ska rengöras noggrant. Vid behov ska de diskas med varm kromsvavelsyra och därefter med tjockflytande fosforsyrelösning (83–98 % per vikt H3PO4), sedan noggrant sköljas i kranvatten och slutligen diskas i omdestillerat vatten tills en neutral reaktion erhålls. Slutligen ska de torkas eller sköljas med en del av den provvätska som ska mätas. Ringen ska först sköljas noggrant i vatten för att avlägsna eventuella vattenlösliga ämnen. Därefter ska den nedsänkas hastigt i kromsvavelsyra, tvättas i omdestillerat vatten tills en neutral reaktion erhålls och slutligen upphettas hastigt över en metanollåga. Anmärkning: Förorening med ämnen som inte löses eller förstörs av kromsvavelsyra eller fosforsyra, t.ex. silikonpreparat, ska avlägsnas med hjälp av lämpligt organiskt lösningsmedel.
1.6.4.2.2 Kalibrering a v apparaten Kalibreringen av apparaten består i att nollpunkten kontrolleras och justeras så att instrumentets indikering medger en tillförlitlig avläsning i mN/m.
1.6.4.2.2 Montering;
Apparaten ska planriktas, t.ex med användning av ett vattenpass på tensiometerns fot, varefter nivåskruvarna på foten justeras.
Nollpunktsjustering:
När ringen har monterats på apparaten men innan den nedsänks i vätskan, ska tensiometerindikeringen justeras till noll och ringen kontrolleras så att den är parallell med vätskeytan. För detta ändamål kan vätskeytan användas som spegel.
Kalibreringar:
Själva provkalibreringen kan utföras genom en av följande två metoder:
a)
Användning av en vikt: detta är ett förfarande där ryttare av känd vikt mellan 0,1 och 1,0 g placeras på ringen. Kalibreringsfaktorn Φa, med vilken alla instrumentavläsningar ska multipliceras, bestäms enligt följande ekvation (se hänvisning 1): Φa=σrσa (1) där: σr=mg2b (mN/m) m ryttarens vikt (g) g tyngdaccelerationen (981 cm s-2 vid havsytan) b ringens medelomkrets (cm) σ4 tensiometeravläsningen efter placering av ryttaren på ringen (mN/m).
b)
Användning av vatten: detta är ett förfarande där det används rent vatten vars ytspänning vid, t.ex. 23 oC, är lika med 72,3 mN/m. Denna metod är snabbare att utföra än viktkalibreringen men risken finns alltid att vattnets ytspänning har ändrats genom förorening av ytaktiva substanser. Kalibreringsfaktorn Φb med vilken alla instrumentavläsningar ska multipliceras, bestäms enligt följande ekvation (2): Φb=σoσg (2) där: σo i litteraturen angivet värde för vattens ytspänning (mN/m) σg mätt värde för vattnets ytspänning (mN/m) båda vid samma temperatur.
1.6.4.3 Iordningställande av prov Vattniga lösningar framställs med passande koncentrationer av de ämnen som ska undersökas. Lösningarna får inte innehålla några olösta ämnen. Lösningarna ska hållas vid en konstant temperatur (±0,5 oC). Eftersom en lösnings ytspänning i mätkärlet ändras med tiden ska flera mätningar göras vid olika tidpunkter och en kurva ritas över ytspänning som en funktion av tiden. När ytspänningen inte längre ändras har ett jämviktstillstånd uppnåtts. Damm och gasformig förorening av andra ämnen påverkar mätningen. Arbetet ska därför utföras under en skyddskåpa.
1.6.5 Testbetingelser Mätningen ska göras vid ungefär 20 oC och hållas inom ±0,5 oC.
1.6.6 Testförfarande De lösningar som ska mätas fylls i det noggrant rengjorda kärlet varvid skumbildning ska undvikas. Mätkärlet placeras på apparatens provbord. Bordsytan med mätkärlet ska höjas tills ringen är helt nedsänkt i den lösning som ska mätas. Därefter ska bordsytan sänkas gradvis och jämt (med en hastighet av ungefär 0,5 cm/min) för att lösgöra ringen från ytan tills den största kraften har uppnåtts. Det vätskelager som vidhäftar ringen får inte avlägsnas från ringen. När mätningen är gjord ska ringen åter nedsänkas helt i lösningen och mätningen upprepas till dess att ett konstant ytspänningsvärde erhålls. Den tid som går åt från överföring av lösningen till mätkärlet och tills mätningen görs ska antecknas för varje bestämning. Avläsningar ska göras vid den största kraft som behövs för att lösgöra ringen från vätskans yta.
2. Tabell Korrektion av den mätta ytspänningen Endast för vattniga lösningar, ρ = 1 g/cm3
DATA För att beräkna ytspänningen ska det på apparaten i mN/m avlästa värdet först multipliceras med kalibreringsfaktor Φa, eller Φb (beroende på vilken kalibreringsmetod som används). Detta ger endast ett ungefärligt värde som ska korrigeras. Harkins och Jordan (se hänvisning 4) har empiriskt bestämt korrektionsfaktorer för ytspänningsvärden som är bestämda med ringmetoden. Dessa faktorer är beroende av ringens mått, vätskans densitet och dess ytspänning. Eftersom det är besvärligt att för varje enskild mätning bestämma korrektionsfaktorn utifrån Harkins och Jordans tabeller, kan man vid beräkning av ytspänningen hos vattenlösningar använda den förenklade metoden att avläsa de korrigerade ytspänningsvärdena direkt i tabellen. (Interpolation ska användas för avläsningar som ligger mellan tabellvärdena.) r 9,55 mm (genomsnittlig ringradie) r 0,185 mm (ringtrådens radie) Experimentellt värde (mN/m) Korrigerat värde (mN/m) Viktkalibrering (se 1.6.4.2.2 a) Vattenkalibrering (se 1.6.4.2.2 b) 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57,0 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — Denna tabell är utarbetat efter Harkins-Jordans korrektion och liknar den som finns i DIN-standarden (DIN 53914) för vatten och vattniga lösningar (densitet p = 1 g/cm3) och är avsedd för en kommersiellt tillgänglig ring med mitten R = 9,55 mm (genomsnittlig ringradie) och r = 0,185 mm (ringtrådens radie). Tabellen ger korrigerade värden för ytspänning som mätts efter kalibrering med vikt eller vatten. Alternativt kan ytspänningen utan föregående kalibrering beräknas enligt följande formel: σ=fxF4πR där: F kraften mätt på dynamometern när hinnan bryts R ringens radie f korrektionsfaktorn (se hänvisning 1)
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Använd metod.
Använd typ av vatten eller lösning.
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
Mätresultat: ytspänning (avläsning) med uppgift om både enskilda avläsningar och deras aritmetiska medelvärde och det korrigerade medelvärdet (med hänsyn tagen till apparaturfaktorn och korrektionstabellen).
Lösningens koncentration.
Testtemperaturen.
Den använda lösningens ålder, särskilt tidsåtgången mellan framställning och mätning av lösningen.
Beskrivning av ytspänningens tidsberoende efter överföring av lösningen till mätkärlet.
Alla uppgifter och upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten ska rapporteras, i synnerhet med avseende på orenheter och ämnets fysiska tillstånd.
3.2 TOLKNING AV RESULTAT Med tanke på att destillerat vatten har en ytspänning av 72,75 mN/m vid 20 oC anses ämnen med en ytspänning på mindre än 60 mN/m bestämd genom denna metod vara ytspänningsaktiva ämnen.
4.1.2.3.4. HÄNVISNINGAR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, rådets beslut K(S1) 30 slutligt. R. Weissberg ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Inter-science Publ., New York, 1959, vol. I, del I, kapitel XIV. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, s. 511. Harkins, W. D., Jordan, H. R, J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 52, s. 1751.
A.6 VATTENLÖSLIGHET
A.6
1. METOD De beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlinjer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1).
1.
1.1 INLEDNING Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap om ämnets strukturformel, ångtryck, dissociationskonstant och hydrolys (som en funktion av pH-värdet). Det finns inte någon enskild metod som kan användas över hela vattenlöslighetsområdet. De två testmetoderna som beskrivs nedan täcker hela löslighetsområdet men kan inte tillämpas på flyktiga ämnen: Det undersökta ämnets vattenlöslighet kan i hög grad påverkas av närvaron av orenheter.
Den ena metoden, som tillämpas på väsentligen rena ämnen med låg löslighet (< 10-2 gram per liter) som ärstabila i vatten, kallas kolonnelueringsmetoden.
Den andra metoden, som tillämpas på väsentligen rena ämnen med högre löslighet (> 10-2 gram per liter)som är stabila i vatten, kallas kolvmetoden.
1.2 DEFINITION OCH ENHETER Ett ämnes löslighet i vatten anges av mättnadskoncentrationen av ämnet i vatten vid en viss temperatur. Lösligheten i vatten anges i viktenhet per volym lösning. SI-enheten är kg/m3 (gram per liter kan också användas).
1.3 REFERENSÄMNEN Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Den ungefärliga mängd som behövs av provet och tiden som krävs för att uppnå mättnadskoncentrationen ska bestämmas i ett enkelt förberedande test.
1.4
1.4.1 Kolonnelueringsmetoden Denna metod är baserad på eluering av provämnet med vatten från en mikrokolonn, som innehåller ett inert bärarmaterial, t.ex. glaspärlor eller sand, belagt med överskott av provämnet. Vattenlösligheten bestäms när eluatets viktkoncentration är konstant. Detta framkommer som en koncentrationsplatå som en funktion av tiden.
1.4.2 Kolvmetoden Med denna metod löses ämnet (fasta ämnen pulvriseras) i vatten vid en temperatur något över testtemperaturen. När mättnad har uppnåtts avkyls blandningen och hålls under omrörning vid testtemperaturen så länge som krävs för att uppnå jämvikt (se hänvisning 2). Alternativt kan mätningen utföras direkt vid testtemperaturen, om man genom lämplig provtagning ser till att mättnadsjämvikt uppnås. Därefter bestäms ämnets viktkoncentration i vattenlösningen, som inte får innehålla olösta partiklar, med lämplig analysmetod.
1.5 KVALITETSKRITERIER
1.5
1.5.1 Repeterbarhet För kolonnelueringsmetoden är det möjligt att uppnå < 30 %, och för kolvmetoden bör den vara < 15 %.
1.5.2 Sensitivitet Sensitiviteten är beroende av analysmetoden, men det är möjligt att bestämma så låga viktkoncentrationer som 10-6 gram per liter.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Testbetingelser Testet ska helst utföras vid 20 ±0,5 oC. Om man misstänker att lösligheten är temperaturberoende (> 3 % per oC), ska man även utföra tester vid två andra temperaturer, som ligger minst 10 oC över respektive under den först valda temperaturen. I detta fall ska temperaturen regleras till ±0,1 oC. Den valda temperaturen ska hållas konstant i alla relevanta delar av utrustningen.
1.6.2 Förberedande test Till cirka 0,1 g av provet (fasta ämnen måste pulvriseras) i ett 10 ml graderat mätglas med glaspropp tillsätts stegvis ökade mängder destillerat vatten vid rumstemperatur enligt tabellen nedan: 0,1 g lösligt i x ml vatten 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Ungefärlig löslighet (gram/l) > 1000 1000–200 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1 Efter varje tillsättning av angiven mängd vatten skakas blandningen kraftigt i 10 minuter och kontrolleras visuellt så att det inte finns några olösta delar av provet. Om provet eller delar av det efter tillsättning av 10 ml vatten fortfarande inte är löst, ska experimentet upprepas i ett 100 ml mätglas med en större mängd vatten. Vid lägre löslighet kan det ta avsevärt längre tid att lösa upp ett ämne (24 timmar bör medges). Den ungefärliga lösligheten anges i tabellen under den volym av tillsatt vatten i vilken fullständig lösning av provet inträffar. Om ämnet fortfarande inte verkar vara löst ska 24 timmar tillåtas (högst 96 timmar) eller ytterligare utspädning göras för att säkerställa att kolonneluerings- eller kolvmetoden kan användas.
1.6.3 Kolonnelueringsmetoden
1.6.3
1.6.3.1 Bärarmaterial, lösningsmedel och elueringsmedel Till kolonnelueringsmetoden ska ett inert bärarmaterial användas, t.ex. glaspärlor och sand. Ett lämpligt flyktigt lösningsmedel av analytisk reagenskvalitet ska användas till att överföra provämnet till bärarmaterialet. Som eluerings- eller lösningsmedel används vatten som omdestillerats i glas- eller kvartsapparaten. Anmärkning: Vatten direkt från en organisk jonbytare får inte användas.
1.6.3.2 Laddning av bärarmatenal Ungefär 600 mg bärarmaterial vägs upp och överförs till en 50 ml rundbottnad kolv. En lämplig, beräknad mängd av provämnet löses i det valda lösningsmedlet. En lämplig mängd av provlösningen tillsätts bärarmaterialet. Lösningsmedlet ska avdunstas fullständigt i t.ex. en rotationsindunstare; i annat fall uppnås inte vattenmättnad av bäraren till följd av fördelningseffekter pä bärarmaterialets yta. Laddningen av bärarmaterial kan orsaka problem (felaktiga resultat) om provämnet avsätts som en olja eller i en annan kristallfas. Problemet ska undersökas experimentellt och rapporteras. Det laddade bärarmaterialet ska ligga i blöt i ungefär två timmar i cirka 5 ml vatten, och därefter tillsätts suspensionen till mikrokolonnen. Alternativt kan det torra laddade bärarmaterialet tillsättas mikrokolonnen, som har fyllts med vatten, och därefter får det vila i ungefär två timmar tills jämvikt har uppnåtts.
1.6.3.2 Testförfarande:
Elueringen av ämnet från bärarmaterialet kan utföras på ett av två olika sätt:
Med cirkulationspump (se figur 1).
Med nivåkärl (se figur 4).
1.6.3.3 Kolonnelueringsmetoden med recirkulationspump
1.6.3.3 Apparatur
En schematisk uppställning av ett typiskt system visas i figur 1. En lämplig mikrokolonn visas i figur 2, även om valfri storlek kan användas, förutsatt att den uppfyller kriterierna för reproducerbarhet och sensitivitet. Kolonnen ska ha ett tomt utrymme på minst fem bäddvolymer vatten plus minst fem prover. Alternativt kan storleken minskas om mer lösningsmedel tillsätts som ersättning för de första fem bäddvolymerna, som avlägsnas med orenheter. Kolonnen ska anslutas till en cirkulationspump med kapacitet att styra flöden på cirka 25 ml/timme. Pumpen ansluts med kopplingar av fluoretenplast (PTFE) och/eller glas. När kolonnen och pumpen kopplats ihop ska det vara möjligt att ta prover av eluatet och att hålla det tomma utrymmet i jämvikt vid atmosfäriskt tryck. Kolonnmaterialet stöds med en liten (5 mm) glasullspropp, som även fungerar som filter för partiklar. Recirkulationspumpen kan t.ex. vara en peristaltisk pump (noggrannhet ska iakttas så att slangmaterialet inte utsätts för förorening och/eller adsorption) eller en membranpump.
Mätförfarande
Flödet genom kolonnen startas. Flödeshastigheten bör vara ungefär 25 ml/timme (cirka 10 bäddvolymer/timme för den beskrivna kolonnen). De första fem bäddvolymerna (minimum) kasseras för att avlägsna vattenlösliga orenheter. Därefter körs cirkulationspumpen tills jämvikt har uppnåtts, dvs. när fem på varandra följande prover ger koncentrationer som slumpmässigt inte avviker mer än ± 30 %. Dessa prov ska vara åtskilda från varandra med tidsintervaller som motsvarar genomloppet av minst 10 bäddvolymer elueringsmedel.
1.6.3.4 Kolonnelueringsmetod med nivåkärl
1.6.3.4 Apparatur (se figur 4 och 3)
Nivåkärl: Anslutningen till nivåkärlet görs med användning av ett slipat glasövergångsstycke som kopplas med en PTFE-slang. Flödeshastigheten bör vara ungefär 25 ml/timme. Successiva fraktioner av eluatet ska samlas och analyseras efter den valda metoden.
Mätförfarande
Fraktioner från det mittersta elueringsområdet, där koncentrationerna är konstanta (± 30 %) vid minst fem på varandra följande fraktioner, används for att bestämma lösligheten i vatten. I båda fallen (användning av recirkulationspump eller nivåkärl) utförs ännu ett försök med hälften så hög flödeshastighet som vid det första försöket. Om resultaten från de två försöken överensstämmer är testet tillfredsställande. Om lösligheten är större vid testet med lägre flödeshastighet, ska man fortsätta att halvera flödeshastigheten tills två på varandra följande test ger samma löslighet. I båda fallen (användning av recirkulationspump eller nivåkärl) ska fraktionernas innehåll av kollodialt material kontrolleras med hjälp av Tyndall-effekten (ljusspridning). Förekomst av sådana partiklar innebär att resultaten är ogiltiga och testet måste upprepas efter förbättringar av kolonnens filtreringsfunktion. Varje provs pH-värde ska registreras. Ytterligare ett försök utförs vid samma temperatur.
1.6.4 Kolvmetoden
1.6.4
1.6.4.1 Apparatur Till kolvmetoden behövs följande material:
vanliga laboratorieglas och -instrument,
lämplig anordning för omskakning av lösningar under reglerade konstanta temperaturer,
en centrifug (helst termostatreglerad), om detta behövs för emulsioner, och
utrustning för analytisk bestämning.
1.6.4.2 Mätförfarande Den mängd material som behövs för att mätta den önskade volymen vatten beräknas utifrån det förberedande testet. Den volym vatten som behövs är beroende av analysmetoden och löslighetsområdet. Ungefär fem gånger den materialmängd som bestämts enligt ovan beräknas för var och en av tre glasbehållare med glasproppar (t.ex. centrifugglas, kolvar). Den valda volymen vatten tillsätts i varje kärl, och kärlen tillsluts helt. De tillslutna kärlen omskakas därefter vid 30 oC. (En skaknings- eller omrörningsanordning som kan fungera vid konstant temperatur ska användas, t.ex. magnetomrörning i ett termostatreglerat bad.) Efter en dag tas det ena kärlet bort och får stå i 24 timmar vid testtemperaturen och ska omskakas då och då för att återuppnå jämvikt. Därefter centrifugeras innehållet i kärlet vid rumstemperatur och föreningens koncentration i den klara vattenfasen bestäms enligt lämplig analysmetod. De två andra kolvarna ska, efter att i två respektive tre dagar ha uppnått en första jämvikt vid 30 oC, behandlas likadant. Om koncentrationsresultaten från minst två av kärlen överensstämmer med den erforderliga reproducerbarheten, är testet tillfredsställande. Om resultaten från kärl 1, 2 och 3 visar en tendens att ge stigande värden, ska hela testet upprepas med användning av längre tider for uppnående av jämvikt. Mätförfarandet kan också utföras utan föregående inkubation vid 30 oC. För att kunna bedöma graden av mättnadsjämvikt tas prover tills omrörningstiden inte längre påverkar testämnets koncentration. Varje provs pH-värde ska registreras.
1.6.5 Analys Helst ska en ämnesspecifik analysmetod användas till dessa bestämningar, eftersom små mängder av lösliga orenheter kan orsaka stora fel i den uppmätta lösligheten. Exempel på sådana metoder är: gas- eller vätskekromatografi, titreringsmetoder, fotometriska metoder och voltametriska metoder.
2. DATA
2.
2.1 KOLONNELUERINGSMETODEN Medelvärdet och standardavvikelsen ska beräknas for minst fem på varandra följande prov, tagna vid mättnadsplatån. Resultaten ska anges i viktenheter per volymenhet lösning. Genomsnittet från två tester med olika flödeshastigheter jämförs och repeterbarheten ska ligga under 30 %.
2.2 KOLVMETODEN De enskilda resultaten ska anges för var och en av de tre kolvarna, och för de resultat som bedöms vara konstanta (repeterbarhet mindre än 15 %), ska medelvärdet beräknas och anges i viktenheter per volymenhet lösning. Om lösligheten ar mycket hög (> 100 gram per liter) kan det vara nödvändigt att omvandla viktenhet till volymenhet med hjälp av densiteten.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 KOLONNELUERINGSMETODEN Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Resultaten av det förberedande testet.
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
Koncentration, flödeshastighet och pH-värde för varje prov.
Medelvärde och standardavvikelse för minst fem prov från mättnadsplatån från varje försök.
Genomsnittet av de två successiva, acceptabla försöken.
Vattentemperaturen under mättnadsprocessen.
Använd analysmetod.
Arten av det använda bärarmaterialet.
Laddning av bärarmaterialet.
Använt lösningsmedel.
Tecken på eventuell kemisk instabilitet hos ämnena under testet och den använda metoden.
Alla upplysningar av betydelse för tolkningen av resultaten, särskilt i fråga om orenheter och ämnets fysiska tillstånd.
3.2 KOLVMETODEN Rapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Resultaten av det förberedande testet.
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
Enskilda analytiska bestämningar och, om fler än ett värde bestämdes, genomsnittet för varje kolv.
Varje provs pH-värde.
Genomsnittet av värdet för de olika kolvar som överensstämde.
Testtemperaturen.
Använd analysmetod.
Tecken på eventuell kemisk instabilitet hos ämnena under testet och den använda metoden.
Alla uppgifter och upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten, särskilt i fråga om orenheter och ämnets fysiska tillstånd.
4.1.2.3. HÄNVISNINGAR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, rådets beslut K(81) 30 slutligt. NF T 20-045 AFNOR (Sept., 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubilityof solids and liquids with low solubility – Column elution method. NF T 20-045 AFNOR (Sept., 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubilityof solids and liquids with high solubility – Flask method.
A.8 FÖRDELNINGSKOEFFICIENT
A.8
1. METOD Den beskrivna skakkolvmetoden är baserade på OECD:s riktlinjer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1).
1.
1.1 INLEDNING Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap om ämnets strukturformel, dissociationskonstant, hydrolys, löslighet i n-oktansyra och ytspänning. Mätningar på joniserbara ämnen utförs på den icke-joniserade formen (fri syra eller fri bas), dvs. genom användning av en passande buffert med ett pH-värde av minst 1 enhet under (fri syra) eller över (fri bas) ämnets pK-värde. Testmetoden omfattar två särskilda förfaranden: skakkolvmetoden och högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Den första metoden är användbar när värden av log Pow (se definitionerna nedan) ligger mellan - 2 och 4, och den andra metoden i området mellan 0 och 6. Innan endera försöksmetoden inleds ska en preliminär uppskattning av fördelningskoefficienten erhållas. Skakkolvmetoden kan endast användas för väsentligen rena ämnen som är lösliga i vatten och n-oktan. Den kan inte användas för ytaktiva ämnen (för vilka ett beräknat värde eller en uppskattning grundad på lösligheten i vatten respektive n-oktan bör finnas). HPLC-metoden kan inte användas för starka syror och baser, metallkomplexer, ytaktiva ämnen och ämnen som reagerar med elueringsmedlet. För sådana material används ett beräknat eller uppskattat värde på grundval av lösligheten i n-oktan respektive vatten. HPLC-metoden är mindre känslig än skakkolvmetoden för närvaron av orenheter i ämnet. Trots detta kan orenheter i vissa tillfällen göra det svårt att tolka resultaten eftersom toppvärden blir osäkra. För blandningar med ett oupplöst band anges en övre och nedre gräns för log P.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Fördelningskoefficienten (P) definieras som förhållandet mellan jämviktskoncentrationerna (ci) för ett ämne som lösts i ett tvåfassystem bestående av två i stort sett icke blandbara lösningsmedel. För n-oktansyra och vatten är pow=cn-octanolcwater Fördelningskoefficienten (P) är således ett förhållande mellan två koncentrationer och uttrycks vanligtvis i form av dess logaritm för basen 10 (log P).
1.3 REFERENSÄMNEN
1.3 Skakkolvmetoden
Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder.
HPLC-metoden
För att kunna korrelera uppmätta HPLC-data för ett ämne med dess P-värde måste en kalibreringskurva för log P mot kromatografiska data fastställas med användning av minst 6 referenspunkter. Det är upp till användaren att välja lämpliga referensämnen. När så är möjligt ska minst ett referensämne ha en Pow-värde som ligger över testämnets, och minst ett med ett Pow-värde under testämnets. För värden av log P under 4 kan kalibreringen baseras på data som erhållits genom skakkolvmetoden. För värden av log P över 4 kan kalibreringen baseras på validerade hänvisningsvärden om dessa motsvarar beräknade värden. För bättre noggrannhet är det att föredra att välja referensämnen som strukturmässigt liknar testämnet. Det finns omfattande listor av värden av log Pow för många grupper av kemikalier (se hänvisningar 2 och 3). Om det inte finns data om fördelningskoefficienter för strukturmässigt besläktade ämnen kan en mer allmän kalibrering, upprättad med andra referensföreningar, användas. I tillägg 2 finns en lista med rekommenderade referensämnen och deras Pow-värden.
1.4 TESTMETODSPRINCIPER
1.4
1.4.1 Skakkolvmetoden För att kunna bestämma fördelningskoefficienten måste jämvikt uppnås mellan alla samverkande komponenter i systemet, och koncentrationerna av de ämnen som lösts i de två faserna måste bestämmas. En genomgång av litteraturen i detta ämne visar att man kan använda flera olika tekniker för att lösa detta problem, dvs. noggrann blandning av två faserna för bestämning av det undersökta ämnets jämviktskoncentration efter separation av faserna.
1.4.2 HPLC-metoden HPLC utförs på analytiska kolonner packade med en kommersiellt tillgänglig fast fas innehållande långa kedjor av kolväte (t.ex. C8, C18) kemiskt bundna till kisel. Om kemikalier insprutas på en sådan kolonn kommer de att vandra genom den med olika hastigheter, eftersom deras fördelning mellan den mobila och den stationära fasen inte är densamma. Kemikalieblandningar elueras i ordningsföljd efter hydrofobicitet, varvid de vattenlösliga kemikalierna elueras först och de oljeupplösliga sist, i proportion till deras kolväte-/vattenfördelningskoefficient. Därefter kan sammanhanget mellan retentionstiden på en sådan kolonn (med omvänd fas) och n-oktan/vattenfördelningskoefficienten fastställas. Fördelningskoefficienten utleds av kapacitetsfaktorn k, som fås genom k=tR-toto där tR är testämnets retentionstid och to den genomsnittliga tid det tar för en lösningsmedelsmolekyl att komma igenom kolonnen (kolonnens dödtid). Det krävs inga kvantitativa analysmetoder och det är endast nödvändigt att bestämma retentionstiden.
1.5 KVALITETSKRITERIER
1.5
1.5.1 Repeterbarhet
1.5.1 Skakkolvmetoden
För att säkerställa en exakt fördelningskoefficient ska dubbla bestämningar göras under tre olika testbetingelser, varvid såväl mängden av det angivna ämnet som förhållandet mellan lösningsmedlens volymer kan varieras. Bestämningen av fördelningskoefficientens värden uttryckta som deras allmänna logaritmer ska ligga inom ±0,3 logaritmenheter.
HPCL-metoden
För att öka tilltron till mätningen görs dubbla bestämningar. Värdena av log P beräknade på grundval av de individuella mätningarna ska ligga inom ett intervall av ±0,1.
1.5.2 Sensitivitet
1.5.2 Skakkolvmetoden
Metodens mätområde bestäms av analysförfarandets detektionsgräns. Denna bör vara tillräcklig för att medge bestämning av värden för log Pow i området - 2 till 4 (under vissa omständigheter kan detta område ökas till log Pow upp till 5) när koncentrationen av det lösta ämnet i endera fasen inte är större än 0,01 mol per liter.
HPLC-metoden
Med HPLC-metoden kan man uppskatta fördelningskoefficienter i log Pow-området från 0 till 6. Normalt kan en förenings fördelningskoefficient uppskattas med en avvikelse av mindre än ± 1 från det värde som uppnås med skakkolvmetoden. Typiska korrelationer framgår i hänvisningarna (4, 5, 6, 7 och 8). Man upnår normalt större noggrannhet om man använder korrelationskurvor baserade på strukturmässigt besläktade referensämnen {se hänvisning 9).
1.5.3 Specificitet
1.5.3 Skakkolvmetoden
Nernsts fördelningslag gäller endast för utspädda lösningar vid konstant temperatur, tryck och pH-värde. Den gäller endast för ett rent ämne som fördelats mellan två rena lösningsmedel. Om flera olika lösta ämnen förekommer i den ena eller i båda faserna samtidigt, kan detta påverka resultaten. Dissociation eller association av de lösta molekylerna resulterar i avvikelser från Nernsts fördelningslag. Sådana avvikelser framgår av det faktum att fördelningskoefficienten blir beroende av lösningens koncentration. På grund av de många inblandade jämvikterna ska denna metod inte användas på joniserbara föreningar utan korrektion. För sådana föreningar kan man överväga att använda buffertlösningar i stället för vatten. I så fall ska buffertlösningens pH-värde ligga minst 1 enhet från ämnets pKa och detta pH-värdes inverkan på miljön ska beaktas.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Preliminär uppskattning av fördelningskoefficienten. Fördelningskoefficientens värde kan företrädesvis uppskattas genom en enkel beräkning (se tillägg 1) eller, vid behov, på grundval av testämnenas löslighet i de rena lösningsmedlen (se hänvisning 10).
1.6.2 Skakkolvmetoden
1.6.2
1.6.2.1 Förberedelser n-oktansyra: Fördelningskoefficienten ska bestämmas med användning av reagenser med mycket hög analytisk renhetsgrad. Vatten: Destillerat eller omdestillerat vatten från glas- eller kvartsapparat ska användas. För joniserbara föreningar används buffertlösmngar i stället för vatten, om detta är motiverat. Anmärkning: Vatten som hämtats direkt från en jonbytare får inte användas.
1.6.2.1
1.6.2.1.1 Förmättnad a v lösningsmedlen Innan en fördelningskoefficient bestäms mättas var och en av de faser som ingår i lösningsmedelssystemet ömsesidigt genom omskakning vid testtemperatur. För detta är det praktiskt att använda en mekanisk skakapparat, och låta den i 24 timmar skaka två stora stamkolvar med n-oktansyra med mycket hög analytisk renhetsgrad eller vatten, vardera innehållande tillräcklig mängd av det andra lösningsmedlet, varefter flaskorna får stå tillräckligt länge för att medge separation av faserna och för att uppnå ett mättnadstillstånd.
1.6.2.1.2 Testförberedelse Testkärlet ska vara nästan helt fyllt av tvåfassystemet. Detta förhindrar materialförlust till följd av avdunstning. Förhållandet mellan volym och mängder ämne fastställs på grundval av följande: Tre test ska göras. I det första tillsätts det beräknade volymförhållandet av n-oktansyra till vatten; i det andra tillsätts dubbla volymen n-oktansyra; och i det tredje tillsätts halva volymen n-oktansyra (dvs. 1:1, 1:2, 2:1).
Den preliminära uppskattningen av fördelningskoefficienten (se ovan).
Den minsta mängden testämne som behövs för analysförfarandet.
Begränsningen av en högsta koncentration i endera fasen på 0,01 mol per liter.
1.6.2.1.3 Testämne En stamlösning framställs i n-oktansyra förmättad med vatten. Innan stamlösningen används för bestämning av fördelningskoefficienten ska dess faktiska koncentration bestämmas exakt. Denna lösning ska förvaras under stabila betingelser.
1.6.2.2 Testbetingelser Testtemperaturen ska hållas konstant (± 1 oC) och ligga i området 20–25 oC.
1.6.2.3 Mätförfarande
1.6.2.3
1.6.2.3.1 Uppnående a v fördelningsjämvikt För varje testbetingelse används två testkärl som vart och ett innehåller erforderliga, exakt mätta mängder av de två lösningsmedlen och den erforderliga mängden stamlösning. Delarna n-oktansyra ska mätas per volym. Testkärlen ska antingen placeras i en lämplig skakapparat eller skakas för hand. Nar ett centrifugeringsglas används rekommenderas att snabbt vrida centrifugglaset 180o kring dess tväraxel så att all instängd luft stiger upp genom de två faserna. Erfarenheten visar att 50 sådana vridningar normalt är tillräckligt för att erhålla fördelningsjämvikt. För att vara säker på detta rekommenderas 100 vridningar under fem minuter.
1.6.2.3.2 Fasseparation Vid behov kan blandningen centrifugeras för att separera faserna. Detta görs i en laboratoriecentrifug som hålls vid rumstemperatur, eller, om en centrifug utan temperaturreglering används, ska centrifugglasen minst en timme före analysen bringas i jämvikt med testtemperaturen.
1.6.2.4 Analys För bestämningen av fördelningskoefficienten är det nödvändigt att bestämma koncentrationerna av testämnet i båda faserna. Detta kan man göra genom att för varje testbetingelse ta ett delprov av varje fas från varje glas och analysera dessa enligt det valda förfarandet. Den totala mängden ämne i båda faserna beräknas och jämförs med den mängd ämne som ursprungligen tillsattes. Proven från vattenfasen ska tas på så sätt att risken att den innehåller spår av n-oktansyra minimeras: en glasspruta med avtagbar kanyl kan användas till att ta prov från vattenfasen. Sprutan ska först fyllas delvis med luft. Luften ska försiktigt pressas ut medan kanylen förs genom n-oktansyrafasen. En lämplig volym av vattenfasen dras upp i sprutan. Sprutan dras snabbt bort från lösningen och kanylen avlägsnas. Innehållet i sprutan kan sedan användas som vattenprovet. Koncentrationen i de två separerade faserna ska helst bestämmas med en ämnesspecifik metod. Exempel på fysisk-kemiska bestämningar som kan vara lämpliga är
fotometriska metoder,
gaskromatografi,
högpresterande vätskekromatografi (HPLC).
1.6.3 HPLC-metoden
1.6.3
1.6.3.1 Förberedelser
1.6.3.1 Apparatur
Det krävs en vätskekromatograf med pulsfri pump och passande detektionssystem. Användning av insprutningsventil med insprutningsspole rekommenderas. Närvaro av polära grupper i den stationära fasen kan väsentligt nedsätta HPLC-kolonnernas prestation. Till följd av detta måste de stationära faserna ha lägsta möjliga procentuella innehåll av polära grupper (se hänvisning 11). Ett kommersiellt mikroniserat fyllningsmaterial med omvänd fas eller färdigfyllda kolonner kan användas. Eventuellt kan en förkolonn placeras mellan insprutnings-systemet och den analyskolonnen.
Mobil fas
Metanol och vatten av HPLC-kvalitet används för att framställa elueringsvätskan, vilken avgasas innan användning. Isokratisk eluering används. Den använda metanol/vattenblandningen ska innehålla minst 25 % vatten. För eluering av föreningar med ett log P av 6 på en timme med en flödeshastighet av 1 ml/m räcker det vanligtvis med en blandning av metanol och vatten i förhållandet 3:1 (v/v). För föreningar med ett högt log P-värde kan det vara nödvändigt att minska elueringstiden (även för referensämnena) genom att utnyttja en mindre polär mobil fas eller en kortare kolonn. Ämnen med mycket låg löslighet i n-oktan har en tendens att ge onormalt låga värden för log Pow med HPLC-metoden. Ibland följer sådana föreningars toppar lösningsmedelsfronten. Detta beror sannolikt på att fördelningsprocessen är för långsam för att jämvikt ska kunna uppnås inom tiden för en HPLC-separation. I detta fall kan en minskning av flödeshastigheten och/eller en minskning av metanol/vattenförhållandet vara effektivt för att erhålla ett pålitligt värde. Både testämnet och referensämnen ska vara lösliga i den mobila fasen i en så hög koncentration att detta kan påvisas. Endast i undantagsfall får tillsättningsämnen användas till metanol/vattenblandningen, eftersom tillsättningsämnen kommer att ändra kolonnens egenskaper. För kromatografer med tillsättningsämnen ska man alltid använda en separat kolonn av samma slag. Om metanol/vatten inte är lämpligt kan man använda andra blandningar av vatten och organiska lösningsmedel, t.ex. etanol/vatten eller acetonitril/vatten. För joniserbara ämnen är elueringsvätskans pH-värde kritiskt. Det ska ligga innanför kolonnens driftsområde, vilket normalt är från 2 till 8. Användning av buffert rekommenderas. Det är viktigt att undvika saltutfällning och försämring av kolonnen, vilket kan förekomma med vissa blandningar av organisk fas och buffert. HPLC-mätningar med kiselbaserade faser med pH över 8 rekommenderas inte eftersom alkalisk mobil fas kan leda till att kolonnens prestation hastigt försämras.
Lösningar
Referensämnen ska vara av renast möjliga kvalitet. För testning och kalibrering ska ämnena om möjligt lösas i den mobila fasen.
Försöksbetingelser
Temperaturen under mätningarna bör inte variera med mer än 2 K.
1.6.3.2 Mätningar
1.6.3.2 Beräkning av dödtiden t0
Dödtiden t0 kan bestämmas antingen med en homolog serie (t.ex. n-alkylmetylketoner) eller med organiska ämnen som inte hålls kvar (t.ex. thiourea eller formamid). För att beräkna dödtiden t0 pä grundval av en homolog serie insprutas minst sju element av en homolog serie, och retentionstiderna bestäms. Bruttoretentionstiderna tr(nc+1) avbildas mot tr(nc), och i regressionsekvationen tr(nc + 1) = a + b tr(nc) bestäms avskärningen a och hållningskoefficienten b (nc = antalet kolatomer). Dödtiden ges då genom to = a/(l – b)
Kalibreringskurva
Nästa steg består i att konstruera en korrelationskurva av log k mot log P för passande referensämnen. I praktiken insprutas det samtidigt mellan fem och tio standardreferensämnen, om log P ligger i det förväntade området, och retentionstiderna bestäms, helst med en integrationsskrivare som är kopplad till detektionssystemet. Motsvarande logaritmer för kapacitetsfaktorerna, log k, beräknas och avsätts mot den log P som är bestämd genom skakkolvmetoden. Kalibreringen företas regelbundet, minst en gång om dagen, för att ta hänsyn till för eventuella ändringar i kolonnens prestation.
Bestämning av testämnets kapacitetsfaktor
Testämnet sprutas in som en så liten mängd mobil fas som möjligt. Retentionstiden bestäms (dubbla bestämningar), varefter kapacitetsfaktorn k kan beräknas. På grundval av korrelationskurvan över referensämnena kan testämnets fördelningskoefficient interpoleras. Vid mycket låga och mycket höga fördelningskoefficienter är det nödvändigt att extrapolera. I sådana fall måste man vara särskilt uppmärksam på regressionslinjens konfidens-gränser.
2. DATA
2. Skakkolvmetoden
Tillförlitligheten av de bestämda P-värdena kan prövas genom en jämförelse mellan medelvärdena för de dubbla bestämningarna och det totala medelvärdet.
3. RAPPORTERING Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
Om metoderna inte kan användas (t.ex. ytaktiva material), en beräknat värde eller en uppskattning på grundval av individuella n-oktan och vattenlöslighet.
Alla uppgifter och upplysningar av betydelse för tolkningen av resultaten, särskild i fråga om orenheter i ämnet och ämnets fysiska tillstånd.
Resultatet från en eventuell preliminär uppskattning.
Temperatur vid bestämningen.
Data om de analysförfaranden som används vid bestämning av koncentrationerna.
Eventuell centrifugeringstid och -hastighet.
De mätta koncentrationerna i båda faserna för varje bestämning. (Detta innebär att totalt 12 koncentrationer ska anges.)
Vikten på testämnet, den använda volymen av varje fas i varje testkärl och den totala beräknade mängden testämne som finns i varje fas efter uppnående av jämvikt.
De beräknade värdena för fördelningskoefficienten (P) och medelvärdet för varje uppsättning testbetingelser, liksom medelvärdet för alla bestämningar. Eventuella tecken på att fördelningskoefficienten är koncentrationsberoende ska anges i rapporten.
De enskilda P-värdenas standardavvikelse från genomsnittet.
Genomsnittsvärdet för P från alla bestämningar anges också som dess logaritm (bas 10).
Det beräknade teoretiska värdet av Pow, när detta värde är bestämt eller när det mätta värdet är > 104.
pH-värdet i vattnet som har använts och i vattenfasen under testet.
Motivering för användning av buffertlösningar i stället för vatten, deras sammansättning, koncentration och pH-värde samt vattenfasens pH-värde före och efter testet.
Resultatet av en eventuell preliminär uppskattning.
Test- och referensämnen, och deras renhetsgrad.
Temperaturområde vid bestämningen.
Det pH-värde vid vilket bestämningarna gjorts.
Detaljerade uppgifter om analys- och förkolonn, rörlig fas och detektionssystem.
Retentionsdata och hänvisningsvärden för log P för referensämnen som använts vid kalibrering.
Detaljerade uppgifter om anpassning av retentionslinjen (log k mot log P).
Genomsnittliga retentionsdata och interpolerat log P-värde för testämnet.
Beskrivning av utrustning och driftsbetingelser.
Elueringsprofiler.
Den mängd test- och referensämne som tillförts kolonnen.
Dödtiden och hur den är uppmätt.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.
HÄNVISNINGAR OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, rådets beslut K(81) 30 slutligt. C. Hansch och A. j. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. Log P and Parameter Database, A took for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hasch, chairman, A. J. Leo, dir.) – Tillgänglig från Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pornona College, Claremont, California 91711. L. Renberg, G. Sundström och K. Sundh-Nygård, Chemosphere, 1980, vol. 80, s. 683. H. Ellgehausen, C. D'Hondt och R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol, 12, s. 219. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, s. 73. W. E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, s. 1. J. E. Haky och A. M. Youg, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, s. 675. S. Fujisawa och E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, s. 787. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (editerad av E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, band I/l, s. 223–339. R. F. Rekker och H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem,. 1979, vol. 14., s. 479. A. Leo, C. Hansch och D. Elkins, artition coefficients and their uses. Chem. Rev. 1971, vol. 71, s. 525. R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shake method. C. V. Eadsforth och P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, s. 1459. A. Leo, C. Hansch och D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, s. 525. C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Dim, D. Nikaitani och E. J. Lien, J. Med. Chem, 1973, vol. 16, s. 1207. W. B. Neely, D. R. Branson och G. E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, s. 1113. D. S. Brown och E. W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, s. 382. J. K. Seydel och K. J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemiw, Weinheim, New York, 1979. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, s. 615.
A.9 FLAMPUNKT
A.9
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap om ämnets brandfarlighet. Testförfarandet kan tillämpas på flytande ämnen vars ångor kan antändas av antändningskällor. De testmetoder som beskrivs i denna text är endast tillförlitliga för de flampunktsområden som anges för de enskilda metoderna. Vid val av försöksmetod ska man ta hänsyn till en eventuell kemisk reaktion mellan ämnet och provbehållaren.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Flampunkten är den lägsta temperatur, korrigerad vid ett tryck av 101,325 kPa, vid vilken testvätskan i ett slutet testkärl, under de betingelser som definieras för testmetoden, utvecklar ånga i sådan mängd att en brandfarlig ång-luftblandning bildas i testkärlet. Enheter: oC t = T – 273,15 (t i oC och T i K)
1.3 REFERENSÄMNEN Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder.
1.4 TESTMETODSPRINCIPER Ämnet placeras i ett testkärl och värms upp eller kyls ned till testtemperaturen i enlighet med det beskrivna förfarandet för de individuella testmetoderna. Antändningsförsök utförs för att fastställa om provet antänds vid testtemperaturen.
1.5 KVALITETSKRITERIER
1.5
1.5.1 Repeterbarhet Repeterbarheten varierar med flampunktsområde och använd testmetod: högst ± 2 oC.
1.5.2 Sensitivitet Sensitiviteten är beroende av använd testmetod.
1.5.3 Specificitet Vissa testmetoders specificitet är begränsad till vissa flampunktsområden och avhängiga av ämnesrelaterade egenskaper (t.ex. hög viskositet).
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Förberedelser Ett prov av testämnet placeras i en testapparat enligt 1.6.3.1 och/eller 1.6.3.2. Av säkerhetsskäl rekommenderas att man för energiska eller toxiska ämnen endast använder en metod med en liten provstorlek, ca 2 cm3.
1.6.2 Testbetingelser Apparaten ska, såvida detta är förenligt med säkerhetskraven, placeras fritt från drag.
1.6.3 Testförfarande
1.6.3
1.6.3.1 Jämviktsmetoden Se ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
1.6.3.2 Icke-jämviktsmetoden
1.6.3.2 Abel-apparat:
Se BS 2000 del 170, NF M07-011, NF T66-009.
Abel-Pensky-apparat:
Se (EN 57), DIN 51755 del 1 (för temperaturer från 5 till 65 oC), DIN 51755 del 2 (för temperaturer under 5 oC), NF M07-036.
Tag-apparat:
Se ASTM D 56.
Pensky-Mårtens-apparat:
Se ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
Anmärkningar:
Om flampunkten, bestämd med en icke-jämviktsmetod enligt 1.6.3.2, konstateras vara 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC eller 55 ± 2 oC, ska den bekräftas med en jämviktsmetod med samma apparat. Endast de metoder som kan utvisa flampunktstemperaturen får användas till en anmälan. För att bestämma flampunkten för viskösa vätskor (färger, lim och liknande) som innehåller lösningsmedel, får endast apparatur och testmetoder som lämpar sig för bestämning av flampunkten för viskösa vätskor användas. Se ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 del 1.
2. DATA
3. RAPPORTERING Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter:
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
Den använda metoden ska anges liksom eventuella avvikelser.
Resultaten och kompletterande uppgifter av betydelse för tolkningen av resultaten.
4. HÄNVISNINGAR Inga.
A.10 ANTÄNDLIGHET (FASTA ÄMNEN)
A.10
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap om ämnets eventuella explosiva egenskaper. Testet utförs endast på pulverformiga, granulära och pastaaktiga ämnen. För att inte ta med alla ämnen som kan antändas, utan endast de som brinner snabbt eller de som på ett eller annat sätt har särskilt farliga egenskaper vid förbränning, anses endast de ämnen vars förbränningshastighet överstiger ett visst gränsvärde vara lättantändliga. Det kan vara särskilt farligt om glödningen fortsätter genom metallpulver eftersom en brand är mycket svår att släcka. Metallpulver anses lättantändliga om glödningen kan breda ut sig i provet inom en viss tid.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Förbränningstiden uttrycks i sekunder.
1.3 REFERENSÄMNEN Inte angivna.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Ämnet formas till ett 250 mm långt obrutet band och det företas ett preliminärt screeningtest för att bestämma om det, efter antändning med en gaslåga, sker en förbränning som breder ut sig med öppen låga eller genom glödning. Om glödningen breder ut sig mer än 200 mm av bandet inom en bestämd tid ska ett fullständigt testprogram utföras för bestämning av förbränningshastigheten.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inte angivna.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Preliminärt screeningtest Ämnet formas till ett obrutet band som är omkring 250 mm långt, 20 mm brett och 10 mm högt på en ickebrännbar, icke-porös dåligt värmeledande plats. En gaslåga (minsta diameter 5 mm) hålls vid den ena änden av pulverbandet tills pulvret fattar eld, dock högst 2 minuter (5 minuter för metallpulver och metallegeringar). Man noterar om förbränningen breder ut sig 200 mm över bandet under testperiodens 4 minuter (40 minuter för metallpulver). Om ämnet inte fattar eld eller förbränning med öppen låga eller genom glödning inte breder ut sig 200 mm över bandet under testperiodens 4 minuter (40 minuter) anses ämnet inte vara lättantändligt och ytterligare försök är inte nödvändiga. Om förbränningen i ämnet breder ut sig 200 mm över bandet på mindre än 4 minuter eller mindre än 40 minuter för metallpulver utförs nedanstående test (1.6.2).
1.6.2 Test för förbränningshastighet
1.6.2
1.6.2.1 Förberedelse Pulverformiga eller granulära ämnen fylls löst packat i en form som har en längd av 250 mm och en triangelformad tvärsnittssektion med en invändig höjd av 10 mm och en invändig bredd av 20 mm. På ömse sidor om formen monteras i längdriktningen en sidoavgränsande metallplatta, som skjuter ut 2 mm ovanför den triangelformade tvärsnittssektionen (se figuren). Därefter låter man formen falla tre gånger från 2 cm höjd på ett fast underlag. Om så behövs fylls formen på igen. Därefter tas de sidoavgränsande metallplattorna bort och överskottsämne skrapas bort. En icke-brännbar, icke-porös dåligt värmeledande platta läggs över formen, apparaten vänds upp och ned och formen avlägsnas. Pastaaktiga ämnen breds ut på en icke-brännbar, icke-porös dåligt värmeledande platta som en 250 mm lång korv med ett tvärsnitt av ungefär 1 cm2.
1.6.2.2 Testbetingelser Om ämnet är fuktkänsligt ska testet utföras sä snabbt som möjligt efter det att ämnet har avlägsnats från behållaren.
1.6.2.3 Testförfarande Anordna testhögen längs draget i ett dragskåp. Luftdraget ska vara tillräckligt för att förhindra rök från att ta sig in i laboratoriet och ska inte ändras under testet. Ett dragskydd bör ställas upp runt apparaten. En het flamma från en gasbrännare (minsta diameter 5 mm) används för att antända ena änden av högen. När 80 mm av högen har bränts ska förbränningshastigheten över de nästa 100 mm mätas. Testet ska utföras sex gånger, varje gång på ett rent kallt underlag, såvida inte ett positivt resultat erhållits tidigare.
2. DATA Bränntiden från det preliminära screeningtestet (1.6.1) och den kortaste förbränningstiden som bestämts i upp till sex test (1.6.2.3) är nödvändiga för utvärderingen.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Exakt specificering av ämnet (identifiering och orenheter).
En beskrivning av ämnet som ska undersökas, dess fysiska tillstånd, inklusive fukthalt.
Resultat från det preliminära screeningtestet och från test av brännhastighet om sådant utförts.
Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten.
3.2 TOLKNING AV RESULTATEN Pulverformiga, granulära eller pastaaktiga ämnen ska anses vara mycket brandfarliga om bränntiden vid en av testerna, som utförts enligt det i 1.6 beskrivna testförfarandet, är kortare än 45 sekunder. Metallpulver eller metallegeringar anses mycket lättantändliga om de kan antändas och lågan eller reaktionszonen breder ut sig över hela provet inom 10 minuter.
4. HÄNVISNINGAR NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
A.11 ANTÄNDLIGHET (GASER)
A.11
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Denna metod gör det möjligt att bestämma om en gas blandad med luft vid rumstemperatur (cirka 20 oC) och atmosfäriskt tryck kan antändas och i så fall i vilket koncentrationsområde. Blandningar med ökande koncentrationer av testgasen i luft utsätts för en elektrisk gnista varvid iakttas om antändning sker.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Området för antändlighet är koncentrationsområdet mellan den nedre och övre explosionsgränsen. De nedre och övre explosionsgränserna är de koncentrationsgränser för den brandfarliga gasen i en blandning med luft vid vilken en flamma inte breder ut sig.
1.3 REFERENSÄMNEN Inte angivet.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Koncentrationen av gasen i luft ökas stegvis och för varje steg utsätts blandningen för en elektrisk gnista.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inte angivna.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Apparatur Testkärlet består av en upprättstående glascylinder med en inre diameter på minst 50 mm och en höjd på minst 300 mm. Antändningselektroderna är placerade 3–5 mm från varandra och 60 mm ovanför cylinderns botten. Cylindern är utrustad med en tryckutlösningsöppning. Apparaten ska avskärmas för att begränsa eventuell explosionsskada. Som antändningskälla används en stående induktionsgnista med en varaktighet på 0,5 sek. Denna gnista genereras av en högspänningstransformator med en utgångsspänning på 10–15 kV (högsta ingångseffekt 300 W). I hänvisning 2 visas ett exempel på en lämplig apparat.
1.6.2 Testbetingelser Detta test ska utföras vid rumstemperatur (cirka 20 oC).
1.6.3 Testförfarande Med användning av doseringspumpar införs en känd koncentration av gas i luft i glascylindern. En gnista förs genom blandningen och därvid iakttas om en flamma lösgör sig från antändningskällan och självständigt breder ut sig. Gaskoncentrationen varieras i steg på 1 % volym tills antändning sker enligt beskrivningen ovan. Om man utifrån kännedom om gasens kemiska struktur kan förmoda att gasen inte kan antändas och att sammansättningen av den stökiometriska blandningen med luft kan beräknas, behöver man endast testa blandningar från 10 % under till 10 % över det stökiometriska blandningsförhållandet.
2. DATA Förekomsten av flamutbredning är den enda datauppgiften av betydelse för bestämning av denna egenskap.
3. RAPPORTERING Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
En beskrivning av den använda apparaturen med måttangivelser.
Temperaturen vid vilken testet gjordes.
Undersökta koncentrationer och erhållna resultat.
Testresultaten: inte antändlig gas eller lättantändlig gas.
Om slutsatsen blir inte antändlig, ska man ange det koncentrationsområde inom vilket provning med 1 % intervaller har skett.
Alla uppgifter och upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten ska rapporteras.
4.1.2. HÄNVISNINGAR NF T 20-041 (Sept. 85), Chemical products for industrial use. Determination of flammability of gases. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewser, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker och H. Schake. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, s. 126–127.
A.12 ANTÄNDLIGHET (KONTAKT MED VATTEN)
A.12
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Denna testmetod kan användas till att bestämma om ett ämne vid reaktion med vatten eller fuktig luft utvecklar farliga mängder gas som eventuellt är lättantändliga. Testmetoden kan tillämpas på både fasta och flytande ämnen. Denna metod kan inte tillämpas på ämnen som antänds spontant i kontakt med luft.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Lättantändliga: Ämnen som vid kontakt med vatten eller fuktig luft utvecklar lättantändliga gaser i farliga mängder med en lägsta hastighet på 1 liter/kg per timme.
1.3 TESTMETODSPRINCIP Ämnet testas enligt det stegförfarande som beskrivs nedan. Testet kan avbrytas vid antändning. Om man vet att ämnet inte reagerar våldsamt med vatten kan man börja med steg 4 (1.3.4).
1.3
1.3.1 Steg 1 Testämnet placeras i ett tråg innehållande destillerat vatten vid 20 oC och därvid iakttas om den utvecklade gasen antänds eller inte.
1.3.2 Steg 2 Testämnet placeras på ett filtrerpapper som flyter på ytan av en skål innehållande destillerat vatten vid 20 oC, och man iakttar om den utvecklade gasen antänds eller inte. Filtrerpapperet fyller endast funktionen att hålla ämnet kvar på plats för att öka möjligheten till antändning.
1.3.3 Steg 3 Testämnet formas till en hög, ungefär 2 cm hög och med 3 cm diameter. Ett par droppar vatten tillförs högen och man iakttar om den utvecklade gasen antänds eller inte.
1.3.4 Steg 4 Testämnet blandas med destillerat vatten vid 20 oC och gasutvecklingshastigheten mäts varje timme under sju timmar. Om utvecklingshastigheten efter sju timmar är oregelbunden eller ökande ska mättiden förlängas till högst fem dagar. Testet kan avbrytas om hastigheten vid något tillfälle överstiger 1 liter/kg per timme.
1.4 REFERENSÄMNE Inte angivet.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inte angivna.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Steg 1
1.6.1
1.6.1.1 Testbetingelser Testet utförs vid rumstemperatur (ca 20 oC).
1.6.1.2 Testförfarande En liten mängd (ungefär 2 mm diameter) av testämnet ska placeras i ett tråg innehållande destillerat vatten. Det iakttas om a) gas utvecklas och b) om gasen antänds. Om gasen antänds behöver ämnet inte undersökas ytterligare eftersom ämnet betraktas som farligt.
1.6.2 Steg 2
1.6.2
1.6.2.1 Apparatur Ett filtrerpapper placeras flytande på ytan av destillerat vatten i lämpligt kärl, t.ex. en avdunstningsskål med 100 mm diameter.
1.6.2.2 Testbetingelser Testet utförs vid rumstemperatur (ca 20 oC).
1.6.2.3 Testförfarande En liten mängd av testämnet (ungefär 2 mm diameter) placeras i mitten av ett filtrerpapper. Det iakttas om a) gas utvecklas och b) om gasen antänds. Om gasen antänds behöver ämnet inte undersökas ytterligare eftersom ämnet betraktas som farligt.
1.6.3 Steg 3
1.6.3
1.6.3.1 Testbetingelser Testet utförs vid rumstemperatur.
1.6.3.2 Testförfarande Testämnet formas till en hög, ungefär 2 cm hög och med 3 cm diameter, med en liten fördjupning i toppen. Ett par droppar vatten tillsätts i fördjupningen och man iakttar om a) gas utvecklas och b) om gasen antänds. Om gasen antänds behöver ämnet inte undersökas ytterligare eftersom ämnet betraktas som farligt.
1.6.4 Steg 4
1.6.4
1.6.4.1 Apparatur Apparaturen monteras enligt figuren.
1.6.4.2 Testbetingelser Undersök om behållaren, i vilken testämnet finns, innehåller pulver < 500 μm (partikelstorlek). Om pulvret utgör mer än 1 % viktprocent av den totala mängden, eller om provet är sprött, ska hela ämnet malas till pulver innan det undersöks för att medge en minskning av partikelstorleken under lagring och hantering. I övrigt ska ämnet användas i det tillstånd det togs emot. Testet ska utföras vid rumstemperatur (20 oC) och atmosfäriskt tryck.
1.6.4.3 Testförfarande 10 till 20 ml vatten tillsätts i apparatens dropptratt, och 10 g av ämnet placeras i den koniska kolven. Den gasvolym som utvecklas kan mätas med lämplig metod. Kranen på dropptratten öppnas för att släppa in vattnet i den koniska kolven och ett stoppur startas. Gasutvecklingen mäts varje timme under en sjutimmarsperiod. Om gasutvecklingen är oregelbunden under denna period, eller om hastigheten för gasutvecklingen ökar vid slutet av denna period, fortsätter mätningarna i upp till fem dagar. Om gasutvecklingen vid någon tidpunkt överstiger 1 liter/timme kan testet avbrytas. Detta test ska utföras tre gånger. Om gasens kemiska identitet är okänd ska gasen analyseras. Om gasen innehåller mycket brandfarliga komponenter och det är okänt om hela blandningen är mycket farlig, ska en blandning med samma sammansättning framställas och undersökas enligt testmetod A.11.
2. DATA Ämnet anses farligt om
spontan antändning sker under testförfarandet, eller
brandfarlig gas utvecklas i högre mängd än 1 liter/kg substans per timme.
3. RAPPORTERING Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
Uppgifter om eventuell inledande behandling av testämnet.
Testresultaten (steg 1, 2, 3 och 4).
Den utvecklade gasens kemiska sammansättning.
Gasens utvecklingshastighet och steg 4 (1.6.4) utfördes.
Eventuella ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten.
4.1.2. HÄNVISNINGAR Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York. NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
A.13 PYROFORISKA EGENSKAPER HOS FASTA OCH FLYTANDE ÄMNEN
A.13
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Testförfarandet kan tillämpas på fasta och flytande ämnen som i små mängder antänds spontant kort tid efter det att de har kommit kontakt med luft vid rumstemperatur (cirka 20 oC). Ämnen som kräver timmar eller dagar vid rumstemperatur eller förhöjd temperatur innan de självantänds omfattas inte av denna testmetod.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Ämnen anses vara mycket brandfarliga om de antänds eller förkolnar under de betingelser som beskrivs i 1.6. Det kan även vara nödvändigt att undersöka vätskors självantändlighet med metod A.15: Självantändlighetstemperatur (vätskor och gaser).
1.3 REFERENSÄMNEN Inte angivna.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Ämnet, fast eller flytande, blandas med en inaktiv bärare och får under fem minuter vara i kontakt med luften vid rumstemperatur. Flytande ämnen som inte fattar eld absorberas sedan de på filterpapper och utsätts under fem minuter för luftens påverkan vid rumstemperatur (cirka 20 oC). Fasta och flytande ämnen som fattar eld och vätskor som fattar eld eller får filterpappret att förkolna anses vara självantändliga.
1.5 KVALITETSKRITERIER Repeterbarhet: Av säkerhetsskäl räcker det med ett positivt resultat för att ämnet ska bedömas vara självantändligt.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Apparatur En porslinskopp, diameter ca 10 cm, fylls med kiselgur upp till ungefär 5 mm höjd vid rumstemperatur (ca 20 oC). Anmärkning: Kiselgur eller annat jämförbart inert ämne som är allmänt tillgängligt ska anses vara representativt för jord på vilken testämnet kan spillas ut vid en olyckshändelse. Det behövs ett torrt filterpapper för att testa vätskor som inte fattar eld vid kontakt med luften när de blandas med en inaktiv bärare.
1.6.2 Testförfarande
1.6.2 a)
Pulverformiga fasta ämnen 1–2 cm3 av det pulverformiga testämnet hälls från cirka 1 m höjd på en icke brännbar yta, varvid iakttas om ämnet antänds under fallet eller innan det har gått fem minuter efter det att det har lagt sig. Testet utförs sex gånger såvida inte antändning sker.
b)
Vätskor Cirka 5 cm3 av testvätskan hälls i den förberedda porslinskoppen, varvid iakttas om ämnet antänds inom fem minuter. Orn inte antändning sker i något av de sex testerna utförs följande test: Med en injektionsspruta sprutas 0,5 ml av provet på ett böjt filterpapper och det observeras om antändning eller förkolning av filterpappret sker inom fem minuter. Testet utförs tre gånger såvida inte antändning eller förkolning sker.
2. DATA
2.
2.1 TOLKNING AV RESULTAT Testet kan avbrytas så snart som ett av testen ger positivt resultat.
2.2 UTVÄRDERING Om ämnet fattar eld inom fem minuter efter det har tillsatts till en inaktiv bärare och exponeras för luft, eller en vätska får en bit filterpapper att förkolna eller fatta eld inom fem minuter efter det att ämnet tillsatts och utsatts för luftens påverkan anses ämnet självantändligt.
3. RAPPORTERING Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter).
Testresultaten.
Eventuella ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten.
4.1.2. HÄNVISNINGAR NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New York.
A.14 EXPLOSIVA EGENSKAPER
A.14
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Metoden innefattar ett testschema för att bestämma om ett fast, flytande eller pastaaktigt ämne eller preparat utgör en explosionsfara om det utsätts för påverkan av en öppen låga (värmesensitivitet) eller slag- eller friktionspåverkan (sensitivitet för mekanisk påverkan) och om ett flytande ämne utgör en explosionsfara om det utsätts för påverkan av en öppen låga eller slag. Metoden består av tre delar: Metoden ger data för att utvärdera sannolikheten att det vid vissa ovanliga påverkningar framkallas en explosion. Metoden är inte avsedd att säkerställa om ett ämne över huvud taget kan explodera. Metoden är lämplig för att bestämma om ett ämne innebär en explosionsfara (värme- och mekanisk känslighet) under de särskilda betingelser som anges i direktivet. Metoden grundas på ett antal apparater som är allmänt använda internationellt (se hänvisning 1) och som vanligtvis ger användbara resultat. Det erkänns att metoden inte är definitiv. Alternativ apparatur kan användas förutsatt att den är internationellt erkänd och att de erhållna resultaten kan korreleras med de resultat som erhållits med den angivna apparaturen. Testen behöver inte utföras om det enligt föreliggande termodynamiska uppgifter (t.ex. bildningsvärme, nedbrytningsvärme) och/eller frånvaro av vissa reaktiva grupper (se hänvisning 2) i strukturformeln är ställt utom rimligt tvivel att ämnet inte kan brytas ned, bilda gaser och frigöra värme mycket snabbt (dvs. materialet utgör inte någon explosionsrisk). Ett test av mekanisk sensitivitet avseende friktion krävs inte för flytande ämnen.
1.1 a)
test av värmesensitiviteten (se hänvisning 1),
b)
test av mekanisk sensitivitet avseende slagpåverkan (se hänvisning 1),
c)
test av mekanisk sensitivitet avseende friktionspåverkan (se hänvisning 1).
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Explosiva: Ämnen som kan explodera när de utsätts för en öppen låga eller som är känsliga för slag och friktion i den angivna apparaturen (eller är mer mekaniskt känsliga än 1,3-dinitrobensen i alternativ apparatur).
1.3 REFERENSÄMNE 1,3-dinitrobensen, teknisk kristallinprodukt som siktats genom 0,5 mm, för friktions- och slagpåverkanmetoden. Perhydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin (RXD, hexogen, cyclonit – CAS 121-82-4), omkristalliserad från vattnigt cyclohexanon, våtsiktad genom en 250 μm och bibehållen i en 150 μm sil, torkad vid 103 ± 2 oC (i 4 timmar) för den andra serien av friktions- och slagtester.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Förberedande tester är nödvändigt för att fastställa säkra betingelser för utförandet av de tre sensitivitetstestet:
1.4
1.4.1 Test för säkerhet vid hantering (se hänvisning 3) Av säkerhetsskäl ska, innan huvudtestet inleds, mycket små prov (cirka 10 mg) av ämnet utsättas för upphettning, utan att vara inneslutna, med en gaslåga, för slagpåverkan i lämplig typ av apparatur och friktionspåverkan genom användning av en hammare mot ett städ eller någon typ av friktionsmaskin. Syftet är att fastställa om ämnet är så sensitivt och explosivt att de föreskrivna sensitivitetstesterna, särskilt test av värmekänsligheten, ska utföras med särskilda försiktighetsåtgärder för att undvika att den som utför testen skadas.
1.4.2 Värmekänslighet Metoden innebär att ämnet värms upp i ett stålrör som stängs med en strypfläns med olika håldiametrar. På detta sätt kan man bestämma om ämnet är benäget att explodera under intensiv värmepåverkan vid väl definierad inneslutning.
1.4.3 Mekanisk känslighet (slagpåverkan) Metoden innebär att ämnet utsätts för slagpåverkan från en bestämd massa från en bestämd höjd.
1.4.4 Mekanisk känslighet (friktion) Metoden innebär att ämnet eller preparatet utsätts för friktion mellan standardytor under specificerade betingelser för belastning och relativ rörelse.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inte angivna.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Värmekänslighet (effekt av öppen liga)
1.6.1
1.6.1.1 Apparatur Apparaturen består av ett engångsstålrör med en återanvändbar stängningsanordning (se figur 1) som placeras i en uppvärmnings- och skyddsanordning. Röret är tillverkat av djupdragen stålplåt (se tillägg) och har en innerdiameter av 24 mm, en längd av 75 mm och en väggtjocklek av 0,5 mm. I den öppna änden är röret flänsat så att det kan slutas med strypflänsanordningen (figur 1). Detta består av en tryckmotståndskraftig skyddsfläns med ett hål i mitten, som är stadigt förankrad till ett rör genom ett tvådelat skruvförband (mutter och gängad krage). Muttern och den gängade kragen är tillverkade av krom-manganstål (se tillägg), vilket är gnistfritt upp till 800 oC. Det finns strypflänsar med en rad olika håldiametrar, som är gjorda av 6 mm tjockt värmebeständigt stål (se tillägg).
1.6.1.2 Testbetingelser Normalt testas ämnet i den form det är mottaget, men i vissa fall, t.ex. om det är pressat, gjutet eller på annat sätt sammanpressat, kan det vara nödvändigt att testa ämnet efter sönderdelning. För fasta ämnen bestäms den mängd material som ska användas för varje test genom ett förfarande i två steg. I det första steget fylls ett tarterat rör med 9 cm 3av ämnet som sammanpressas med en kraft av 80 N fördelat över hela rörtvärsnittet. Av säkerhetsskäl, eller om ämnet kan ändra fysisk form vid kompression, kan andrapåfyllningsförfaranden användas. Sammanpressning är t.ex. inte lämpligt om ämnet är mycket friktionskänsligt. Om materialet kan komprimeras tillsätts och sammanpressas mera tills röret är fyllt till en höjd av 55 mm från överkanten. Den totala mängd som har använts för att fylla röret till denna höjd bestäms och ytterligare 2 portioner som sammanpressas med en kraft av 80 N tillsätts. Därefter tillsätts material genom sammanpressning eller så avlägsnas material tills röret är fyllt till 15 mm från överkanten. Det andra steget består i att en tredjedel av den samlade mängd som användes i det första steget tillsätts och sammanpressas. Därefter tillsätts ytterligare 2 portioner som sammanpressas med en kraft av 80 N och materialets höjd i röret justeras till 15 mm från överkanten genom tillsättning eller avlägsnande av material. Vid varje försök används den mängd fast ämne som har fastställts i detta andra steg. Påfyllningen sker i tre lika stora portioner som var och en komprimeras till 9 cm3 med den kraft som krävs. (Detta är lättast att göra genom användning av avståndsringar.) Vätskor och geléaktiga ämnen fylls i röret till en höjd av 60 mm varvid försiktighet iakttas med geléaktiga ämnen för att undvika luftbubblor under påfyllning. Den gängade kragen förs upp på röret underifrån, den valda strypflänsen sätts in och muttern åtstramas efter smörjning med ett molybdensulfidbaserat smörjmedel. Det är viktigt att kontrollera att inget ämne har fastnat mellan flänsen och plattan eller i gängorna. Uppvärmningen sker med propan, som från en industriell cylinder med tryckreglator (60–70 mbar) leds genom en mätare och fördelas jämnt till fyra brännare genom en anslutning (vilket kontrolleras genom visuell inspektion av brännarnas lågor).
1.6.1.3 Testförfarande Varje test pågår tills röret antingen sönderdelas eller har varit uppvärmt i 5 minuter. Ett test vid vilket röret sönderdelas i tre eller flera fragment, som eventuellt hänger ihop med smala metallstrimlor enligt figur 2, betraktas som en explosion. Ett test som leder till färre fragment eller ingen fragmentering betraktas inte som en explosion. Först utförs tre tester med en strypfläns med ett 6 mm hål, och om ingen explosion sker utförs ytterligare tre test med en strypfläns med ett 2 mm hål. Om explosion sker under ett av dessa tester är ytterligare testning inte nödvändig.
1.6.1.4 Utvärdering Testresultatet anses positivt om en explosion inträffar i en av ovan nämnda testserier.
1.6.2 Mekanisk sensitivitet (slagpåverkan)
1.6.2
1.6.2.1 Apparatur (figur 4) En typisk fallhammarapparatur består i huvudsak av ett gjutstålsblock med fot, städ, pelare, gejder, fallvikter, utlösningsmekanism och provhållare. Stålstädet, 100 mm (diameter) × 70 mm (höjd) är fastskruvat ovanpå ett stålblock, 230 mm (längd) × 250 mm (bredd) × 200 mm (höjd) med gjuten fot, 450 mm (längd) × 450 mm (bredd) × 60 mm (höjd). En pelare bestående av en heldraget stålrör är fastsatt i en hållare som är fastskruvad bak på stålblocket. Apparaten är förankrad i ett massivt betongblock, 60 x 60 x 60 cm med fyra skruvar, så att gejderna är fullständigt lodräta och fallvikterna kan falla fritt. Det finns fallvikter på 5 och 10 kg framställda i massivt stål. Slagvikternas slagyta är av härdat stål, HRC 60–63, och har en diameter av minst 25 mm. Provet placeras i en slaganordning som består av två massiva stålcylindrar som är placerade koaxialt ovanför varandra i en ihålig cylindrisk styrring av stål. Stålcylindrarna ska ha en diameter av 10 (–0,003, –0,005) mm och en höjd av 10 mm och ha polerade ytor, rundade kanter (kurvradie 0,5 mm) och en hårdhet av HRC 58–65. Den ihåliga cylindern ska ha en utvändig diameter av 16 mm, en polerad urborrning av 10 (+0,005, +0,010) mm och en höjd av 13 mm. Slaganordningen samlas på ett mellanstäd (diameter 26 mm, höjd 26 mm) av stål och centreras med en ring i vilken det finns perforeringar för att leda bort rökgaser.
1.6.2.2 Testbetingelser Provet ska ha en volym på 40 mm3 eller en volym som passar till en alternativ apparatur. Fasta ämnen testas i torrt tillstånd och förbereds enligt följande: Ämnen som normalt förekommer i pastaform bör om möjligt testas i torrt tillstånd och under alla omständigheter efter borttagning av så mycket upplösningsmedel som möjligt. Vätskor testas med ett avstånd av 1 mm mellan den översta och den nedersta stålcylindern.
1.6.2.2 a)
Pulverformiga ämnen siktas (siktstorlek 0,5 mm); allt som har passerat sikten används till testet.
b)
Pressade, gjutna eller på annat sätt sammanpressade ämnen sönderdelas och siktas, siktfraktioner från 0,5–1 mm i diameter används vid testet.
1.6.2.3 Testförfarande En serie av sex tester utförs i vilka den 10 kg tunga massan får falla från 0,40 m (40 J). Om en explosion erhålls under de sex testerna vid 40 J måste en andra serie bestående av sex tester utföras i vilka en 5 kg tung massa får falla från 0,15 m (7,5 J). I andra apparaturer jämförs provet med det valda referensämnet med användning av ett fastställt förfarande (tvåslagsteknik osv.).
1.6.2.4 Utvärdering Testresultatet anses positivt om en explosion (eldutveckling och knall är likvärdiga med explosion) inträffar minst en gång i ett av testerna med den beskrivna slagapparaturen eller provet är mer sensitivt än 1,3-dinitrobensen eller RXD i en alternativt slagpåverkantest.
1.6.3 Mekanisk sensitivitet (friktion)
1.6.3
1.6.3.1 Apparatur (figur 5) Friktionsapparaturen består av en bottenplatta av gjuten stål på vilken själva friktionsanordningen är monterad. Denna består av en fast porslinspinne och rörliga porslinsplåtar. Porslinsplåten är fäst i en glidbar vagga som rör sig mellan två skenor. Vaggan drivs via en drivstång, en excentrisk trissa och en överföringsväxel av en elektrisk motor på sådant sätt att porslinsplåten rörs under porslinspinnen med en bakåt- och framåtgående rörelse på 10 mm. Porslinspinnen ska belastas med t.ex. 120 eller 360 newton. Porslinsplattorna är tillverkade av vitt tekniskt porslin (uppruggningsdjup 9–32 μm) och har dimensionerna 25 mm (längd) × 25 mm (bredd) × 5 mm (höjd). Även den cylindriska porslinspinnen är tillverkad av vitt tekniskt porslin, är 15 mm lång, har en innerdiameter på 10 mm och uppruggade sfäriska ändytor med en rundningsradie på 10 mm.
1.6.3.2 Testbetingelser Provet ska ha en volym av 10 mm3 eller en volym som passar till en alternativ apparatur. Fasta ämnen testas i torrt tillstånd och förbereds enligt följande: Ämnen som normalt förekommer i pastaform bör om möjligt testas i torrt tillstånd. Om ämnet inte kan testas i torrt tillstånd ska pastan (efter borttagning av så mycket upplösningsmedel som möjligt) testas som en 0,5 mm tjock, 2 mm bred och 10 mm lång film, som framställs med en speciell form.
1.6.3.2 a)
Pulverformiga ämnen siktas (siktstorlek 0,5 mm); allt som har passerat sikten används till testet.
b)
Pressade, gjutna eller på annat sätt sammanpressade ämnen sönderdelas och siktas, siktfraktioner < 0,5 mm i diameter används vid testet.
1.6.3.3 Testförfarande Porslinspinnen anbringas på testprovet och vikten hängs på. När testet utförs ska slipmärkena på porslinsplattan ligga tvärs emot rörelseriktningen. Kontrollera noggrant att pinnen vilar på provet, att tillräckligt med testämne ligger under pinnen och att plattan rör sig korrekt under pinnen. För pastaaktiga ämnen används en 0,5 mm tjock form med en hål av 2 × 10 för att anbringa ämnet på plattan. Porslinsplattan ska flytta sig 10 mm fram och tillbaka under porslinspinnen under 0,44 sekunder. Varje del av porslinsplattan och porslinspinnen får endast användas en gång. Varje pinnes två ändar räcker till två försök och de två ytorna på en platta räcker vardera för tre försök. Sex försök med en belastning av 360 N utförs. Om en explosion förekommer i ett av dessa sex försök utförs en ny serie med sex försök med en belastning av 120 N. I andra apparater jämförs proven med det valda referensämnet med hjälp av ett fastställt förfarande (t.ex. up- and down-teknik).
1.6.3.4 Utvärdering Testresultatet anses positivt om en explosion (krepitation, eldutveckling och knall är likvärdiga med explosion) inträffar minst en gång i ett av testerna med den beskrivna friktionsapparaturen eller de motsvarande kriterierna i ett alternativ friktionstest är uppfyllda.
2. DATA Ett ämne anses i princip vara explosionsfarligt i direktivets bemärkelse om ett positivt resultat erhålls i testet av värmesensitivitet, slagpåverkantest eller friktionspåverkantest.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Testämnets beteckning, sammansättning, renhet, fukthalt osv.
Provets fysiska form och om det har krossats, brutits eller siktats.
Iakttagelser under värmesensitivitetstestet (t.ex. provmassa, antal fragment).
Iakttagelser under testet av mekanisk känslighet (t.ex. avsevärd rökutveckling eller fullständig nedbrytning utan knall, lågor, gnistor, sprakning).
Resultat för varje test.
Vetenskapliga grunder för eventuell användning av alternativ apparatur, samt tecken på korrelation mellan resultat som erhållits med beskriven apparatur och de som erhållits med likvärdig apparatur.
Alla relevanta kommentarer, t.ex. hänvisning till test med liknande produkter, som kan vara av betydelse för en korrekt tolkning av resultaten.
Alla ytterligare kommentarer som är relevanta för tolkning av resultaten.
3.2 TOLKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT I testrapporten ska alla resultat som anses vara falska, avvikande eller icke representativa anges. Om något resultat ska bortses från ska en förklaring ges och resultaten av ett alternativt eller kompletterande test anges. Om ett avvikande resultat inte kan förklaras på detta sätt ska det godtas för vad det är och i enlighet därmed användas vid klassificering av ämnet.
4.1.2.3.4. HÄNVISNINGAR Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Test and criteria., 1990, Förenta nationerna, New York. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750- 60103-5, 1990. Koenen, H., Ide, K. och Swart, K. H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, s. 6–13 och 30–42. NF T 20-038 (Sept. 85), Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.
A.15 SJÄLVANTÄNDNINGSTEMPERATUR (VÄTSKOR OCH GASER)
A.15
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Explosiva ämnen och ämnen som antänds spontant vid kontakt med luft vid omgivningstemperatur, ska inte användas vid detta test. Testförfarandet får tillämpas på gaser, vätskor och ångor som i närvaro av luft kan antändas av en varm yta. Självantändningstemperaturen kan sänkas avsevärt vid förekomst av katalytiska orenheter, av ytmaterialet eller av en större volym på testkärlet.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Graden av självantändlighet uttrycks som självantändningstemperaturen. Självantändningstemperaturen är den lägsta temperatur vid vilken testämnet antänds när det blandas med luft under de betingelser som definierats för testmetoden.
1.3 REFERENSÄMNEN Referensämnen återges i standarderna (1.6.3). De ska först och främst användas till att emellanåt kalibrera metoden och till att möjliggöra en jämförelse av resultaten från andra metoder.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Med denna metod bestäms den lägsta temperaturen hos den invändiga ytan i ett slutet rum, vid vilken en gas, ånga eller vätska som sprutas in i rummet, fattar eld.
1.5 KVALITETSKRITERIER Repeterbarheten varierar beroende på självantändlighetens temperaturområde och den använda testmetoden. Sensitiviteten och specificiteten beror på den använda testmetoden.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Apparatur Apparaturen finns beskriven i den metod som avses i 1.6.3.
1.6.2 Testbetingelser Ett prov av testämnet undersöks enligt den metod som avses i 1.6.3.
1.6.3 Testförfarande Se IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
2. DATA Testtemperaturen, atmosfäriskt tryck, mängden använt prov och tidsintervall registreras innan antändning sker.
3. RAPPORTERING Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Exakt specifikation av ämnet (beteckning och orenheter).
Mängden använt prov, atmosfäriskt tryck.
Använd apparatur.
Mätresultaten (testtemperaturer, resultat beträffande antändning, motsvarande tidsintervall).
Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten.
4. HÄNVISNINGAR Inga.
A.16 RELATIV SJÄLVANTÄNDNINGSTEMPERATUR (FASTA ÄMNEN)
A.16
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Explosiva ämnen och ämnen som antänds spontant vid kontakt med luft vid omgivningstemperatur ska inte användas vid detta test. Syftet med detta test är att få preliminära uppgifter om fasta ämnens självantändlighet vid förhöjda temperaturer. Om den värme som utvecklas, antingen genom ämnets reaktion med syre eller genom exoterm nedbrytning, inte avges tillräckligt snabbt till omgivningen inträffar en självuppvärmning som leder till självantändning. Självantändning inträffar således när värmeproduktionens hastighet överstiger värmeförlustens hastighet. Tcstförfarandet är värdefullt som ett förberedande screentest för fasta ämnen. Med tanke på det komplicerade förhållandet vid antändning och förbränning av fasta ämnen, ska självantändningstemperaturen som bestäms enligt denna metod endast användas i jämförande syfte.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Den självantändningstemperatur som erhållits med denna metod är den lägsta omgivningstemperatur, uttryckt i oC, vid vilken en viss volym av ett ämne självantänds under definierade betingelser.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP En viss volym av testämnet placeras i en ugn vid rumstemperatur; temperatur-/tidskurvan avseende betingelserna i provets mitt registreras medan temperaturen i ugnen ökas till 400 oC, eller till smältningspunkten om denna är lägre, med en hastighet av 0,5 oC per minut. Den ugnstemperatur vid vilken provets temperatur uppnår 400 oC genom självuppvärmning kallas i detta test självantändningstemperaturen.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Apparatur
1.6.1
1.6.1.1 Ugn En temperaturprogrammerad laboratorieugn (volym ca 2 liter) utrustad med naturlig luftcirkulation och explosionssäkring. För att undvika eventuell explosionsrisk ska det säkerställas att nedbrytningsgaser inte kan komma i kontakt med de elektriska värmeelementen.
1.6.1.2 Kub av ståltrådsnät En bit rostfritt ståltrådsnät med 0,045 mm maskor skärs till enligt mallen i figur 1. Nätet viks och fästs ihop med tråd till kuber som är öppna på ovansidan.
1.6.1.3 Termoelement Passande termoelement.
1.6.1.4 Skrivare Valfri tvåkanalsskrivare som ar kalibrerad från 0 till 600 oC eller motsvarande spänning.
1.6.2 Testbetingelser Ämnen testas i sin kommersiella form.
1.6.3 Testförfarande Kuben fylls med testämnet och slås med lätta slag varefter ytterligare ämne tillsätts tills kuben är helt fylld. Provet hängs därefter upp i mitten av ugnen vid rumstemperatur. Ugnstemperaturen registreras med ett termoelement som är placerat mitt i kuben och ett annat som är placerat mellan kuben och ugnsväggen. Ugnens och provets temperaturer avläses fortlöpande medan ugnstemperaturen ökas till 400 oC eller till smältpunkten, om denna är lägre, med en hastighet av 0,5 oC per minut. När ämnet antänds visar termoelementet i provet en mycket kraftig temperaturhöjning över ugnstemperaturen.
2. DATA Den ugnstemperatur vid vilken provets temperatur uppnår 400 oC genom självuppvärmning är av betydelse för utvärderingen (se figur 2).
3. RAPPORTERING Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
En beskrivning av testämnet.
Mätresultaten inklusive temperatur/tidskurvor.
Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten.
4. HÄNVISNINGAR NF T 20-036 (September 1985). Chemical products for industrial use. Determination of the relative tempe-rature of the spontaneous flammability of solids.
4.
Figur 1 Mall till 20 mm testkub
Figur 2 Typisk temperatur/tidskurva
provets temperatur ugns-temperatur antandnings-temperatur tid
A.17 OXIDERANDE EGENSKAPER (FASTA ÄMNEN)
A.17
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap om ämnets potentiellt explosiva egenskaper och toxicitet. Testet får inte tillämpas på vätskor och gaser, explosiva eller mycket brandfarliga ämnen eller organiska peroxider. Detta test behöver inte utföras om en undersökning av strukturformeln fastslår utom rimligt tvivel att ämnet inte kan reagera exotermt med ett brännbart material. För att säkerställa om testet ska utföras med iakttagande av särskilda försiktighetsåtgärder, ska ett förberedande test utföras.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Bränntid: Den reaktionstid, i sekunder, som krävs för att reaktionszonen breder ut sig längs en hög, enligt det förfarande som beskrivs i 1.6. Brännhastighet: Uttrycks i mm per sekund. Maximal brännhastighet: det högsta värdet för brännhastigheter som erhållits för blandningar innehållande 10–90 viktprocent av det oxiderande ämnet.
1.3 REFERENSÄMNE Bariumnitrat (analytisk kvalitet) används som referensämne för testet och det inledande screeningtestet. Referensblandningen är den blandning av bariumnitrat och cellulosapulver som framställts enligt 1.6 och som har den maximala brännhastigheten (vanligtvis en blandning med 60 viktprocent bariumnitrat).
1.4 TESTMETODSPRINCIP Av säkerhetsskäl utförs ett inledande screeningtest. Detta test är tillräckligt om det klart utvisar att testämnet eller testpreparatet har oxiderande egenskaper. Om så inte är fallet ska ämnet eller preparatet underkastas ett fullständigt test. Vid det fullständiga testet ska testämnet och en definierat brännbart ämne blandas i olika proportioner. Varje blandning formas sedan till en hög som antänds i ena änden. Den maximala brännhastigheten bestäms därefter och jämförs med referensblandningens maximala brännhastighet.
1.5 KVALITETSKRITERIER Om så behövs kan valfri malnings- och blandningsmetod användas, förutsatt att skillnaden mellan den maximala brännhastigheten i de sex separata testen inte avviker mer än 10 % från det aritmetiska medelvärdet.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Förberedelser
1.6.1
1.6.1.1 Testämne Testprovet reduceras till en partikelstorlek < 0,125 mm enligt följande förfarande: Sikta testämnet; mal återstående fraktion, upprepa förfarandet tills hela testfraktionen har passerat sikten. Valfri malnings- och siktningsmetod som uppfyller kvalitetskriterierna får användas. Innan blandningen framställs ska ämnet torkas vid 105 oC tills konstant vikt har uppnåtts. Om testämnets nedbrytningstemperatur är lägre än 105 oC ska ämnet torkas vid en passande lägre temperatur.
1.6.1.2 Brännbart ämne Cellulosapulver används som brännbart ämne. Cellulosan ska vara av den typ som används vid tunnskiktskromatografi eller kolonnkromatografi. En typ där mer än 85 % av fiberlängderna ligger mellan 0,020 och 0,075 mm har visat sig vara lämplig. Cellulosapulvret passerar genom en sikt med en maskstorlek på 0,125 mm. Samma blandning ska användas i hela testet. Innan blandningen framställs ska ämnet torkas vid 105 oC tills konstant vikt har uppnåtts. Om trämjöl används i det förberedande testet ska ett barrvedsmjöl tillredas genom att den del som passerar en sikt med maskstorleken 1,6 mm insamlas, blandas noggrant och sedan torkas vid 105 oC i fyra timmar i ett högst 25 mm tjockt lager. Efter avkylning ska det förvaras i en lufttät behållare, fylld till brädden, tills det ska användas, helst inom 24 timmar efter torkning.
1.6.1.3 Antändningskälla Som antändningskälla används lågan från en gasbrännare (minsta diameter 5 mm). Om en annan antändningskälla används (t.ex. vid testning i en inert atmosfär) ska en beskrivning och en motivering bifogas.
1.6.2 Testförfarande Anmärkning: Blandningar av oxiderande ämnen med cellulosa eller trämjöl ska behandlas som potentiellt explosiva och hanteras med vederbörlig försiktighet.
1.6.2
1.6.2.1 Förberedande test Det torkade ämnet blandas med det torkade cellulosapulvret eller trämjöl i proportionerna 2 viktdelar av testämnet till 1 viktdel cellulosa eller träm)öl och blandningen formas till en liten konformad hög med måtten 3,5 cm (basens diameter) × 2,5 cm (höjd) genom att en konliknande form (t.ex. ett laboratorieglastratt vars pip är tillsluten) fylls, utan att packas. Högen placeras på en kall, icke ledande, ogenomtränglig basplatta. Testet ska utföras i ett dragskåp som i 1.6.2.2. Antändningskällan sätts i kontakt med konen. Kraften och varaktigheten av den påföljande reaktionen iakttas och registreras. Ämnet anses vara oxiderande om reaktionen är kraftfull. Om resultaten på något sätt är tvetydiga ska det nedan beskrivna fullständiga testförfarandet utföras.
1.6.2.2 Fullständigt test En blandning av oxiderande ämne och cellulosa, innehållande 10–90 viktprocent oxiderande ämne, framställs i steg om 10 viktprocent. I gränsfall ska mellanblandningar av oxiderande ämne och cellulosa användas för att få fram en noggrannare maximal brännhastighet. Högen byggs upp med användning av en form. Formen är tillverkad av metall, har en längd på 250 mm, och en triangelformad tvärsnittssektion med en inre höjd på 10 mm och en inre bredd på 20 mm. På båda sidor om formen monteras i längdriktningen två sidoavgränsande metallplåtar som skjuter upp 2 mm ovanför den triangelformade tvärsnittssektionens övre kant (se figuren). Denna anordning fylls löst och med råge av blandningen. Efter det att formen har fatt falla en gång från 2 cm höjd på en fast yta skrapas återstående överskottsämne bort med en skråställd platta. Därefter avlägsnas sidoavgränsningarna och resterande pulver slätas ut med en kavel. En icke-brännbar plåt placeras sedan ovanpå formen, apparaturen vänds och formen avlägsnas. Högen placeras i dragskåpet tvärs över luftdragets riktning. Lufthastigheten ska vara så hög att den förhindrar att rökgaser släpps ut till laboratoriet och ska inte varieras under testet. En dragskärm ska placeras runt apparaturen. Eftersom cellulosan och testämnena är hygroskopiska ska testet utföras så snabbt som möjligt. Ena änden av högen tänds på genom beröring av lågan. När reaktionszonen har förflyttat sig de första 30 mm mäts reaktionstiden över följande 200 mm. Testet utförs med referensämnet och minst en gång med varje serie av blandningar av testämnet och cellulosa. Om den maximala brännhastigheten konstateras vara signifikant högre än referensämnets, kan testet avbrytas. I annat fall ska testet upprepas fem gånger med de tre blandningar som gav de högsta brännhastigheterna. Om man misstänker att resultatet är felaktigt positivt upprepas testet med ett inert ämne med motsvarande partikelstorlek, t.ex. kiselgur, i stället för cellulosa. Alternativt kan den blandning av testämne och cellulosa som har den snabbaste reaktionshastigheten testas i inert atmosfär (< 2 % v/v syreinnehåll).
2. DATA Av säkerhetsskäl ska den maximala brännhastigheten – inte medelvärdet – anses vara testämnets karakteristiska oxiderande egenskap. Det högsta värdet för brännhastighet som erhålls vid en testomgång med sex test av en given blandning är relevant for utvärderingen. Rita en kurva över det högsta värdet för brännhastighet för varje blandning som en funktion av dess innehåll av oxiderande medel. Bestäm den maximala brännhastigheten utifrån kurvan. De sex matta värdena för brännhastighet, som vid en testomgång erhållits för blandningen med den maximala brännhastigheten, får inte avvika mer än 10 % från det aritmetiska medelvärdet. I annat fall ska malnings- och blandningsmetoderna förbättras. Jämför den erhållna maximala brännhastigheten med referensblandningens maximala brännhastighet (se 1.3). Om testen utförs i en inert atmosfär jämförs den maximala brännhastigheten med den från referensblandningen i en inert atmosfär.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Testämnets beteckning, sammansättning, renhet, fukthalt osv.
Eventuell behandling av testprovet (t.ex. malning eller torkning).
Använd antändningskälla.
Mätresultaten.
Reaktionssättet (t.ex. brinnande låga vid ytan, genombränning av hela massan och alla uppgifter om för bränningsprodukter).
Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten, inbegripet en beskrivning av kraften (lågor, gnistor, rök, långsamt pyrande glöd osv.) och ungefärlig varaktighet som iakttagits vid det för beredande säkerhets-screeningtestet för både test- och referensämne.
Resultat av eventuella tester med ett inert ämne.
Resultat av eventuella tester i inert atmosfär.
3.2 TOLKNING AV RESULTATEN Ett ämne ska anses vara ett oxiderande ämne om För att undvika falska positiva resultat ska de resultat som erhålls vid test av ämnet med ett inert material och vid test i inert atmosfär också beaktas vid tolkning av resultaten.
3.2 a)
en kraftig reaktion inträffar under det inledande screeningtestet
b)
den maximala brännhastighet av de blandningar som undersökts vid fullständig testning är högre än eller lika med den maximala brännhastigheten för referensblandningen av cellulosa och bariumnitrat.
4. HÄNVISNINGAR NF T 20-035 (september 85), Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
A.18 MOLEKYLÄR MEDEL VIKT OCH MOLEKYLÄR VIKTFÖRDELNING AV POLYMERER
A.18
1. METOD Denna kromatografiska metod (genomträngning i gelé) är en kopia på OECD TG 118 (1996). Grundläggande principer och annan teknisk information finns under hänvisning 1.
1.
1.1 INLEDNING Eftersom polymerernas egenskaper är så varierande är det omöjligt att beskriva en enda metod som ger exakta förhållanden för separation och bedömning som täcker alla eventualiteter och särskilda företeelser vid separation av polymerer. Särskilt komplexa polymera system är ofta inte mottagliga för kromatografisk analys av genomträngning i gelé (GPC). När GPC inte är praktiskt genomförbart kan den molekylära vikten fastställas med andra metoder (se bilaga). I sådana fall ska fullständig information om och motivering för den använda metoden anges. Den beskrivna metoden grundas på DIN-standard 55672 (1). Detaljerad information om hur experimentet ska utföras och hur datan ska bedömas finns i denna DIN-standard. Om experimentförhållandena måste ändras, ska dessa förändringar motiveras. Andra standarder får tillämpas om full hänvisning därtill görs. I den beskrivna metoden används polystyrenprover med känd polydispertion för kalibrering, som kan behöva anpassas till vissa polymerer, t.ex. vattenlösliga och anpassade polymerer med långa molekylkedjor.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Den numerära medelmolekylvikten Mn och den viktmässigt molekylära medelvikten Mw fastställs med följande ekvationer: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi där: Hi är nivån på detektorsignalen från baslinjen för den kvarhållna volymen Vi, Mi är polymerfraktionens molekylvikt vid den kvarhållna volymen Vi, och n är antalet datapunkter. Bredden på den molekylära viktfördelningen, som är ett mått på systemdispertionen, fås med förhållandet Mw/Mn.
1.3 REFERENSÄMNEN Eftersom GPC är en relativ metod måste kalibrering göras. Normalt används tätt fördelad, linjärt konstruerad standardpolystyren med känd medelmolekylvikt Mn och Mw och en känd molekylviktfördelning för detta ändamål. Kalibreringskurvan kan bara användas för fastställande av molekylvikten för det okända provet om separationsförhållandena för provet och standardämnena valts på exakt samma sätt. Det fastställda förhållandet mellan molekylvikten och urlakningsvolymen gäller enbart under det aktuella experimentets specifika förhållanden. Dessa förhållanden omfattar framför allt temperatur, lösning eller lösningsblandning, kromatografiska förhållanden och separationskolonn eller kolonnsvstem. Den molekylvikt som fastställs för provet på detta sätt utgörs av relativa värden och beskrivs som polystyrenets molekylära ekvivalensvikt. Detta innebär att molekylvikterna, beroende på struktur och kemisk skillnad mellan provet och standardämnet, kan avvika från de absoluta värdena i större eller mindre utsträckning. Om andra standardämnen används, t.ex. polyetylenglykol, polyetylenoxid, poly-metylmetakrylat, polyakrylsyra, ska skälet därtill anges.
1.4 PRINCIPEN FÖR PROVNINGSMETODEN Både provets molekylviktfördelning och medelmolekylvikter (Mn, Mw) kan fastställas med hjälp av GPC. GPC är en särskild typ av vätskekromatografi där provet separeras beroende på de enskilda komponenternas hydrodynamiska volymer (2). Separationen utförs när provet passerar genom en kolonn fylld med poröst material, vanligtvis en organisk gelé. Små molekyler kan passera igenom porerna medan stora molekyler kvarhålls. De stora molekylernas passage blir därför kortare och dessa tas bort först. Medelstora molekyler passerar genom en del av porerna och/eller elueras senare. De minsta molekylerna, med en hydrodynamisk medelradie mindre än porerna i gelén, kan passera genom samtliga porer. Dessa elueras då sist. I idealsituationen styrs separeringen helt och hållet av molekylstorleken, men i praktiken är det svårt att förhindra att åtminstone en viss absorbtionseffekt inverkar störande. Ojämn packning i kolonnen och döda volymer kan förvärra situationen (2). Detektionen utförs med t.ex. reflektionsindex eller UV-absorbtion och ger en enkel fördelningskurva. För att kunna tillskriva kurvan den faktiska molekylvikten måste kolonnen kalibreras, genom att polymerer med känd molekylvikt och helst i stort sett liknande struktur, t.ex. olika standardpolysterener, tillåts passera genom kolonnen. Normalt fås en typisk Gaus-kurva, ibland utdragen i en mindre svans på sidan för den låga molekylvikten, om de vertikala axlarna anger mängden, i förhållande till vikten, för de olika molekylvikter som elueras, och den horisontella axeln står för den logaritmiska molekylvikten.
1.5 KVALITETSKRITERIER Repeterbarheten (relativ standardavvikelse: RSD) för elutionsvolymen ska vara bättre än 0,3 %. Nödvändig repeterbarhet för analysen måste säkerställas genom korrigering enligt intern standard om ett kromatogram bedöms vara tidsberoende och inte omfattas av ovannämnda kriterier (1). Spridningen beror på standardämnets molekylvikt. Följande värden är typiska för standardpolystyren: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 < Mp < 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp är standardämnets molekylvikt vid toppvärdet.)
1.6 BESKRIVNING AV PROVNINGSMETODEN
1.6
1.6.1 Beredning av lösningar med standardpolystyren Standardpolystyrenen löses noggrant genom blandning i vald eluent. Hänsyn måste tas till tillverkarens rekommendationer vid beredning av lösningarna. Koncentrationen av de standardämnen som väljs beror på olika faktorer, t.ex. injektionsvolym, lösningsviskositet och den analytiska detektorns känslighet. Maximal injektionsvolym måste anpassas till kolonnens längd för undvikande av överbelastning. Typiska injektionsvolymer för analytiska separationer med GPC och en kolonn på 30 cm × 7,8 mm ligger mellan 40 och 100 μl. Större volymer kan användas men bör inte överstiga 250 μl. Det optimala förhållandet mellan injektionsvolym och koncentration måste fastställas innan kolonnen kalibreras.
1.6.2 Beredning av provlösningen I princip gäller samma krav för beredning av provlösning. Provet löses upp i lämpligt lösningsmedel, t.ex. tetrahydrofuran (THF), genom omsorgsfull skakning. Det får under inga omständigheter lösas upp i ultraljudsbad. Vid behov kan provlösningen renas genom ett membranfilter, med en finhet på mellan 0,2 och 2 μm. Förekomst av oupplösta partiklar måste registreras i slutrapporten, eftersom dessa kan bero på högviktsmolekyler. Lämplig metod ska användas för fastställande av viktandelen oupplösta partiklar. Lösningen bör användas inom 24 timmar.
1.6.3 Apparater Det måste säkerställas att GPC-systemet är inert avseende använda lösningsmedel, t.ex. genom användning av stålkapilär för THF-lösningen.
Lösningsbehållare.
Avluftningsapparat (när så krävs).
Pump.
Pulsdämpare (när så krävs).
Injektionssystem.
Kromatografikolonner.
Detektor.
Flödesmätare (när så krävs).
Apparat för registrering/bearbetning av data.
Avfallskärl.
1.6.4 Injektions- och lösningstillförselsystem En definierad volym av lösningsprovet fylls i kolonnen, antingen automatiskt eller manuellt, i en tydligt definierad zon. Alltför snabb utdragning eller intryckning av kolven i sprutan, om fyllningen sköts manuellt, kan förorsaka förändringar i den observerade molekylviktfördelningen. Systemet för tillförsel av lösning ska så långt möjligt vara pulsfritt, helst med inbyggd pulsdämpning. Flödeshastigheten ska vara ca 1 ml/min.
1.6.5 Kolonn Polymeren kännetecknas, beroende på provet, antingen genom användning av enkel kolonn eller genom flera kolonner kopplade i serie. Ett antal porösa kolonnmaterial med definierade egenskaper, t.ex. porstorlek, exklutionsgränser osv., finns kommersiellt tillgängliga. Val av separationsgelé och kolonnlängd beror både på provets egenskaper (hydrodynamisk volym, molekylviktfördelning) och specifika förhållandena för separationen, som t.ex. lösning, temperatur och flödeshastighet (1) (2) (3).
1.6.6 Teoretiska plattor Den kolonn eller kolonnkombination som används för separationen måste karakteriseras av antalet teoretiska nivåer. Detta inkluderar, när THF används som elutionslösning, fyllning av en lösning av etylbensen eller annan lämplig icke-polär lösning i en kolonn med känd längd. Antalet teoretiska nivåer fås med följande ekvation: N=5,54VeW1/22 eller N=16VeW2 där: N är antalet teoretiska nivåer, Ve är elutionsvolymen vid toppvärdet, W är toppvärdets baslinjebredd, och W1/2 är toppbredden vid halva höjden.
1.6.7 Separationseffektivitet Förutom antalet teoretiska nivåer som styr bandbredden, spelar också separationseffektiviteten, som bestäms av lutningen på kalibreringskurvan, en viss roll. Separationseffektiviteten för en kolonn fås med följande förhållande: Ve,Mx-Ve,(10Mx)holonnens tvärsnittarea≥6,0 cm3cm2 där: Ve, Mx är elutionsvolymen för polystyren med molekylvikten Mx och Ve,(10Mx) är elutionsvolymen för polystyren med en tio gånger större molekylvikt. Systemets upplösning definieras normalt som: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 där: Ve1 och Ve2 är elutionsvolymerna för de två standardpolystyrenerna vid maximalt toppvärde, W1 och W2 är baslinjebredden vid toppvärde och M1 och M2 är molekylvikten vid maximalt toppvärde (bör skilja sig åt med en faktor på 10). R-värdet för kolonnsystemet bör vara större än 1,7 (4).
1.6.8 Lösningsmedel Samtliga lösningsmedel måste ha hög renhet (för THF används en renhet på 99,5 %). Lösningsmedelsbehållaren (om nödvändigt i en inert gasatmosfär) ska vara tillräckligt stor för kalibrering av kolonnen och flera provanalyser. Lösningsmedlet ska avgasas innan det via pumpen transporteras till kolonnen.
1.6.9 Temperaturövervakning Temperaturen i de kritiska interna komponenterna (injektionsslinga, kolonn, detektor och rörsystem) ska vara jämn och anpassad till valt lösningsmedel.
1.6.10 Detektor Syftet med detektorn är att kvantitativt registrera koncentrationen i det prov som elueras från kolonnen. För att undvika onödig breddning av toppvärden ska detektorcellens kuvettvolym hållas så liten som möjligt. Den bör inte vara större än 10 μl, utom för lättflyktiga och tunna detektorer Differentialrefraktometri används vanligtvis för detektion. Om provets eller elutionslösningens särskilda egenskaper så kräver kan emellertid andra detektortyper användas t.ex. UV/VIS, IR- eller viskositetsdetektorer.
2. DATA OCH RAPPORTERING
2.
2.1 DATA Detaljerade utvärderingskriterier och krav avseende insamling och bearbetning av data ska uppfylla kraven i DIN-standarden (1). Två sinsemellan oberoende experiment ska utföras för varje prov. Experimenten ska analyseras individuellt. Mn, Mw, Mw/Mn och Mp ska anges för varje mätning. Det är nödvändigt att uttryckligen ange att uppmätta värden är relativa värden, ekvivalenta mot molekylvikten för det standardämne som använts. Efter fastställande av retentionsvolymerna eller retentionstiderna (eventuellt korrigerade med en intern standard), plottas log Mp-värdena (Mp är maximalt toppvärde för kalibreringsämnet) mot en av nämnda mängder. Minst två kalibreringspunkter krävs per tiotal molekylvikter och minst fem mätpunkter för den totala kurvan, som ska täcka provets uppskattade molekylvikt. Kalibreringskurvans ändpunkt för den låga molekylvikten definieras av n-hexylbenzen eller annan lämplig icke-polär lösning. Medelantal och medelvikt för molekylvikterna fastställs allmänt med elektronisk databearbetning, baserad på formlerna i avsnitt 1.2. Om manuell digitalisering används kan råd hämtas från ASTM D 3536-91 (3). Fördelningskurvan ska presenteras i tabellform eller som ett diagram (differentialfrekvens eller summa procentandel mot log M). I den grafiska presentationen ska varje tiotal molekylvikter normalt ha en bredd på 4 cm, och maximalt toppvärde ska ligga på ungefär 8 cm höjd. Vid intregralfördelningskurvor ska skillnaderna mellan 0 och 100 % vara ungefär 10 cm.
2.2 PROVNINGSRAPPORT Provningsrapporten ska innehålla följande information:
2.2
2.2.1 Undersökt ämne
Tillgänglig information om det undersökta ämnet (identitet, tillsatser, föroreningar).
Beskrivning av hanteringen av provet, anmärkningar, problem.
2.2.2 Instrument
Eluentbehållare, inertgas, avgasning av eluenten, eluentens sammansättning, föroreningar.
Pump, pulsdämpare, injektionssystem.
Separationskolonner (tillverkare, all information om kolonnernas karakteristika, som porstorlek, typ av separationsmaterial osv., antal, längd och inbördes ordning på använda kolonner).
Antal teoretiska nivåer i kolonnen eller kolonnkombinationen, separationseffektivitet (systemupplösning).
Information om topparnas symmetri.
Kolonntemperatur, typ av temperaturövervakning.
Detektor (mätprincip, typ, kuvettvolym).
Flödesmätare om sådan används (tillverkare, mätprincip).
System för registrering och bearbetning av data (hårdvara och mjukvara).
2.2.3 Systemkalibrering
Detaljerad beskrivning av den metod som används för konstruktion av kalibreringskurvan.
Information om kvalitetskriterier för den aktuella metoden (t.ex. koordinationskoefficient, kvadraternas summeringsfel osv.).
Information om all extrapolering, alla antaganden och approximeringar gjorda under experimentproceduren samt om bedömning och bearbetning av data.
Alla mätningar som gjorts för konstruktion av kalibreringskurvan ska dokumenteras i en tabell som inkluderar följande information för varje kalibreringspunkt:
Provets namn.
Provets tillverkare.
Karakteristikvärden för standardämnena Mp, Mn, Mw, Mw/Mn, enligt tillverkaren eller från efterföljande mätningar, tillsammans med detaljerade uppgifter om bestämningsmetoden.
Insprutningsvolym och insprutningskoncentration.
Mp-värde för kalibrering.
Elueringsvolym eller korrigerad retentionstid mätt vid maximalt toppvärde.
Mp beräknat vid maximalt toppvärde.
Procentfel för beräknat Mp och kalibreringsvärde.
2.2.4 Bedömning
Bedömning på tidsbasis: metoder som används för att säkerställa önskad reproducerbarhet (korrektionsmetod, intern standard osv.).
Information om huruvida bedömningen gjorts på basis av elutionsvolymen eller retentionstiden.
Information om gränserna för bedömningen, om ett toppvärde inte analyserats fullständigt.
Beskrivning av utjämningsmetoder, om sådana används.
Beredning av och förbehandlingsprocedurer för provet.
Närvaro av oupplösta partiklar, om sådana förekommit.
Injektionsvolym (μl) och injektionskoncentration (mg/ml).
Anmärkningar om effekter som lett till avvikelser från den ideala GPC-profilen.
Detaljerad beskrivning av alla ändringar i provningsförfarandet.
Detaljerade uppgifter om felområden.
All övrig information och anmärkningar relevanta för tolkningen av resultatet.
3.1.2.3.4. HÄNVISNINGAR DIN 55672 (1995), Gelégenomträngningskromatografi (GPC) med tetrahydrofuran (THF) som elutionsmedel, del 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., och Bly, D.D. eds. (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (ung. Modern vätskeuteslutningskromatografi för uteslutning) ASTM D 3536-91, (1991), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning med vätskeuteslutningskromatografi (gelégenomträngningskromatografi – GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning i polystyren med storleksseparationskromatografi. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
A.19 INNEHÅLL AV LÅGMOLEKYLVIKTSPOLYMERER
A.19
1. METOD Denna kromatografiska metod (genomträngning i gelé) är en kopia på OECD TG 119 (1996). Grundläggande principer och annan teknisk information finns i hänvisningarna.
1.
1.1 INLEDNING Eftersom polymerernas egenskaper är så varierande är det omöjligt att beskriva en enda metod som ger exakta förhållanden för separation och bedömning som täcker alla eventualiteter och särskilda företeelser vid separation av polymerer. Särskilt komplexa polymera system är ofta inte mottagliga för kromatografisk analys av genomträngning i gelé (GPC). När GPC inte är praktiskt genomförbart kan den molekylära vikten fastställas med andra metoder (se bilaga). I sådana fall ska fullständig information om och motivering för den använda metoden anges. Den beskrivna metoden grundas på DIN-standard 55672 (1). Detaljerad information om hur experimentet ska utföras och hur datan ska bedömas finns i denna DIN-standard. Om experimentförhållandena måste ändras, ska dessa förändringar motiveras. Andra standarder får tillämpas om full hänvisning därtill görs. I den beskrivna metoden används polystyrenprover med känd polydispertion för kalibrering, som kan behöva anpassas till vissa polymerer, t.ex. vattenlösliga och anpassade polymerer med långa molekylkedjor.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Låg molekylvikt definieras som en molekylvikt under 1000 dalton. Den numerära medelmolekylvikten Mn och den viktmässigt molekylära medelvikten Mw fastställs med följande ekvationer: Mn=Σni=1HiΣni=1Hi/Mi Mw=Σni=1HixMiΣni=1Hi där: Hi är nivån på detektorsignalen från baslinjen för den kvarhållna volymen Vi, Mi är polymerfraktionens molekylvikt vid den kvarhållna volymen Vi, och n är antalet datapunkter. Bredden på den molekylära viktfördelningen, som är ett mått på systemdispertionen, fås med förhållandet Mw/Mn.
1.3 REFERENSÄMNEN Eftersom GPC är en relativ metod måste kalibrering göras. Normalt används tätt fördelad, linjärt konstruerad standardpolystyren med känd medelmolekylvikt Mn och Mw och en känd molekylviktfördelning för detta ändamål. Kalibreringskurvan kan bara användas för fastställande av molekylvikten för det okända provet om separationsförhållandena för provet och standardämnena valts på exakt samma sätt. Det fastställda förhållandet mellan molekylvikten och urlakningsvolymen gäller enbart under det aktuella experimentets specifika förhållanden. Dessa förhållanden omfattar framför allt temperatur, lösning eller lösningsblandning, kromatografiska förhållanden och separationskolonn eller kolonnsystem. Den molekylvikt som fastställs för provet på detta sätt utgörs av relativa värden och beskrivs som polystyrenets molekylära ekvivalensvikt. Detta innebär att molekylvikterna, beroende på struktur och kemisk skillnad mellan provet och standardämnet, kan avvika från absoluta värdena i större eller mindre utsträckning. Om andra standardämnen används, t.ex. polyetylenglykol, polyetylenoxid, poly-metylmetakrylat, polyakrylsyra ska skälet därtill anges.
1.4 PRINCIPEN FÖR PROVNINGSMETODEN Både provets molekylviktfördelning och medelmolekylvikter (Mn, Mw) kan fastställas med hjälp av GPC. GPC är en särskild typ av vätskekromatografi där provet separeras beroende på de enskilda komponenternas hydrodynamiska volymer (2). Separationen utförs när provet passerar genom en kolonn fylld med poröst material, vanligtvis en organisk gelé. Små molekyler kan passera igenom porerna medan stora molekyler kvarhålls. De stora molekylernas passage blir därför kortare och dessa tas bort först. Medelstora molekyler passerar genom en del av porerna och/eller elueras senare. De minsta molekylerna, med en hydrodynamisk medelradie mindre än porerna i gelén, kan passera genom samtliga porer. Dessa elueras då sist. I idealsituationen styrs separeringen helt och hållet av molekylstorleken, men i praktiken är det svårt att förhindra att åtminstone en viss absorbtionseffekt inverkar störande. Ojämn packning i kolonnen och döda volymer kan förvärra situationen (2). Detektionen utförs med t.ex. reflektionsindex eller UV-absorbtion och ger en enkel fördelningskurva. För att kunna tillskriva kurvan den faktiska molekylvikten måste kolonnen kalibreras genom att polymerer med känd molekylvikt och helst i stort sett liknande struktur, t.ex. olika standardpolysterener, tillåts passera genom kolonnen. Normalt fås en typisk Gaus-kurva, ibland utdragen i en mindre svans på sidan för den låga molekylvikten, om de vertikala axlarna anger mängden, i förhållande till vikten, för de olika molekylvikter som elueras, och den horisontella axeln står för den logaritmiska molekylvikten. Innehållet med låg molekylvikt härleds från denna kurva. Beräkningen kan bara bli korrekt om innehållet av lågmolekylviktarter är jämnt fördelat i polymermassan.
1.5 KVALITETSKRITERIER Repeterbarheten (relativ standardavvikelse: RSD) för elutionsvolymen ska vara bättre än 0,3 %. Nödvändig repeterbarhet för analysen måste säkerställas genom korrigering enligt intern standard om ett kromatogram bedöms vara tidsberoende och inte omfattas av ovannämnda kriterier (1). Spridningen beror på standardämnets molekylvikt. Följande värden är typiska för standardpolystyren: Mp < 2000 Mw/Mn < 1,20 2000 < Mp < 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp är standardämnets molekylvikt vid toppvärdet.)
1.6 BESKRIVNING AV PROVNINGSMETODEN
1.6
1.6.1 Beredning av lösningar med standardpolystyren Standardpolystyrenen löses noggrant genom blandning i vald eluent. Hänsyn måste tas till tillverkarens rekommendationer vid beredning av lösningarna. Koncentrationen av de standardämnen som väljs beror på olika faktorer, t.ex. injektionsvolym, lösningsviskositet och den analytiska detektorns känslighet. Maximal injektionsvolym måste anpassas till kolonnens längd för undvikande av överbelastning. Typiska injektionsvolymer for analytiska separationer med GPC och en kolonn på 30 cm × 7,8 mm ligger mellan 40 och 100 μl. Större volymer kan användas men bör inte överstiga 250 μl. Det optimala förhållandet mellan injektionsvolvm och koncentration måste fastställas innan kolonnen kalibreras.
1.6.2 Beredning av provlösningen I princip gäller samma krav för beredning av provlösning. Provet löses upp i lämpligt lösningsmedel, t.ex. tetrahydrofuran (THF), genom omsorgsfull skakning. Det får under inga omständigheter lösas upp i ultraljudsbad. Vid behov kan provlösningen renas genom ett membranfilter, med en finhet på mellan 0,2 och 2 μm. Förekomst av oupplösta partiklar måste registreras i slutrapporten, eftersom dessa kan bero på högviktsmolekyler. Lämplig metod ska användas för fastställande av viktandelen oupplösta partiklar. Lösningen bör användas inom 24 timmar.
1.6.3 Korrigering för innehåll av föroreningar och tillsatser Korrigering av artinnehållet av M < 1000 för bidraget från närvarande icke-po! ymera specifika komponenter (t.ex. föroreningar och/eller tillsatser) krävs normalt, med mindre det uppmätta innehållet redan är mindre än 1 %. Detta fås genom direkt analys av polymerlösningen eller GPC-eluaten. När eluaten efter passage genom kolonnen ska spädas för ytterligare analys, ska den vara koncentrerad. Det kan vara nödvändigt att evaporera eluaten till torrhet och lösa upp den igen. Eluatkoncentrationen ska göras under förhållanden som garanterar att inga förändringar uppstår i eluaten. Hanteringen av eluaten efter GPC-steget är beroende av den analysmetod som används för mängdbestämningen.
1.6.4 Apparater GPC-apparater består av följande komponenter: Det måste säkerställas att GPC-systemet är inert avseende använda lösningsmedel, t.ex. genom användning av stålkapilär för THF-lösningen.
Lösningsbehållare.
Avluftningsapparat (när så krävs).
Pump.
Pulsdämpare (när så krävs).
Injektionssystem.
Kromatografikolonner.
Detektor.
Flödesmätare (när så krävs).
Apparat för registrering/bearbetning av data.
Avfallskärl.
1.6.5 Injektions- och lösningstillförselsystem En definierad volym av lösningsprovet fylls i kolonnen, antingen automatiskt eller manuellt, i en tydligt definierad zon. Alltför snabb utdragning eller intryckning av kolven i sprutan, om fyllningen sköts manuellt, kan förorsaka förändringar i den observerade molekylviktfördelningen. Systemet för tillförsel av lösning ska så långt möjligt vara pulsfritt, helst med inbyggd pulsdämpning. Flödeshastigheten ska vara ca 1 ml/min.
1.6.6 Kolonn Polymeren kännetecknas, beroende på provet, antingen genom användning av enkel kolonn eller flera kolonner kopplade i serie. Ett antal porösa kolonnmaterial med definierade egenskaper, t.ex. porstorlek, exklutionsgränser osv. finns kommersiellt tillgängliga. Val av separationsgelé och kolonnlängd beror både på provets egenskaper (hydrodynamisk volym, molekylviktfördelning) och specifika förhållandena för separationen, som t.ex. lösning, temperatur och flödeshastighet (1) (2) (3).
1.6.7 Teoretiska nivåer Den kolonn eller kolonnkombination som används för separationen måste karakteriseras av antalet teoretiska nivåer. Detta inkluderar, när THF används som elutionslösning, fyllning av en lösning av etylbensen eller annan lämplig icke-polär lösning i en kolonn med känd längd. Antalet teoretiska nivåer fås med följande ekvation: N=5,54VeW1/22 där: N=16VeW2 eller, N är antalet teoretiska nivåer, Ve är elutionsvolymen vid toppvärdet, W är toppvärdets baslinjebredd, och W1/2 är toppbredden vid halva höjden.
1.6.8 Separationseffektivitet Förutom antalet teoretiska nivåer, som styr bandbredden, spelar också separationseffektiviteten, som bestäms av lutningen på kalibreringskurvan, en viss roll. Separationseffektiviteten för en kolonn fås med följande förhållande: Ve,Mx-Ve,(10Mx)kolonelės tvärsnittarea≥6,0cm3cm2 där: Ve, Mx är elutionsvolymen för polystyren med molekylvikten Mx, och Ve,(10Mx) är elutionsvolymen för polystyren med en tio gånger större molekylvikt. Systemets upplösning definieras normalt som: R1,2=2×Ve1-Ve2W1+W2×1log10M2/M1 där: Ve1 och Ve2 är elutionsvolymerna för de två standardpolystyrenerna vid maximalt toppvärde, W1 och W2 är baslinjebredden vid toppvärde, och M1 och M2 är molekylvikten vid maximalt toppvärde (bör skilja sig åt med en faktor på 10). R-värdet för kolonnsystemet bör vara större än 1,7 (4)
1.6.9 Lösningsmedel Samtliga lösningsmedel måste ha hög renhet (för THF används en renhet på 99,5 %). Lösningsmedelsbehållaren, om nödvändigt i en inert gasatmosfär ska vara tillräckligt stor för kalibrering av kolonnen och flera provanalyser. Lösningsmedlet ska avgasas innan det via pumpen transporteras till kolonnen.
1.6.10 Temperaturövervakning Temperaturen i de kritiska, interna komponenterna (injektionsslinga, kolonn, detektor och rörsystem) ska vara jämn och anpassad till valt lösningsmedel.
1.6.11 Detektor Syftet med detektorn är att kvantitativt registrera koncentrationen i det prov som elueras från kolonnnen. För att undvika onödig breddning av toppvärden ska detektorcellens kuvettvolym hållas sä liten som möjligt. Den bör inte vara större än 10 μl, utom for lattffyktiga och tunna detektorer. Differentialrefraktometri används vanligtvis för detektion. Om provets eller elutionslösningens särskilda egenskaper så kräver kan emellertid andra detektortyper användas, t.ex. UV/VIS, IR- eller viskositetsdetektorer osv.
2. DATA OCH RAPPORTERING
2.
2.1 DATA Detaljerade utvärderingskriterier och krav avseende insamling och bearbetning av data ska uppfylla kraven i DIN-standarden (1). Två sinsemellan oberoende experiment ska utföras för varje prov. Experimenten ska analyseras individuellt. Det är alltid viktigt att också ta fram data från blankprover, behandlade på samma sätt som det verkliga provet. Det är nödvändigt att uttryckligen ange att uppmätta värden är relativa värden, ekvivalenta mot molekylvikten för det standardämne som använts. Efter fastställande av retentionsvolymerna eller retentionstiderna (eventuellt korrigerade med en intern standard), plottas log Mp-värdena (Mp är maximalt toppvärde för kalibreringsämnet) mot en av nämnda mängder. Minst två kalibreringspunkter krävs per tiotal molekylvikter och minst fem mätpunkter för den totala kurvan, som ska täcka provets uppskattade molekylvikt. Kalibreringskurvans ändpunkt för den låga molekylvikten definieras av n-hexylbenzen eller annan lämplig icke-polär lösning. Den del av kurvan som svarar mot molekylvikter under 1000 bestäms och korrigeras för föroreningar och tillsatser efter behov. Elutionskurvorna bedöms i allmänhet med hjälp av elektronisk databehandling. Om manuell digitalisering används kan råd hämtas från ASTM D 3536-91 (3). Om någon olöslig polymer blir kvar i kolonnen är dess molekylvikt troligen högre än den upplösta fraktionen och om hänsyn inte tas därtill kommer den; att ge en för hög bedömning av innehållet lågmolekylvikter. Riktlinjer för korrigering av innehållet av lågmolekylvikten för olöslig polymer ges i bilagan. Fördelningskurvan ska presenteras i tabellform eller som ett diagram (differentialfrekvens eller summa procentandel mot log M). I den grafiska presentationen ska varje tiotal molekylvikter normalt ha en bredd på 4 cm, och maximalt toppvärde ska ligga på ungefär 8 cm höjd. Vid intregralfördelningskurvor ska skillnaderna mellan 0 och 100 % vara ungefär 10 cm.
2.2 PROVNINGSRAPPORT Provningsrapporten ska innehålla följande information.
2.2
2.2.1 Undersökt ämne
Tillgänglig information om det undersökta ämnet (identitet, tillsatser, föroreningar).
Beskrivning av hanteringen av provet, anmärkningar, problem.
2.2.2 Instrument
Eluentbehållare, inertgas, avgasning av eluenten, eluentens sammansättning, föroreningar.
Pump, pulsdämpare, injektionssystem.
Separationskolonner (tillverkare, all information om kolonnernas karakteristika, som porstorlek, typ av separationsmaterial osv., antal, längd och inbördes ordning på använda kolonner).
Antal teoretiska nivåer i kolonnen eller kolonnkombinationen, separationseffektivitet (systemupplösning).
Information om topparnas symmetri.
Kolonntemperatur, typ av temperaturövervakning.
Detektor (mätprincip, typ, kuvettvolym).
—Flödesmätare om sådan används (tillverkare, mätprincip).
System för registrering och bearbetning av data (hårdvara och mjukvara).
2.2.3 Systemkalibrering
Detaljerad beskrivning av den metod som används för konstruktion av kalibreringskurvan.
Information om kvalitetskriterier för den aktuella metoden (t.ex. koordinationskoefficient, kvadraternas summeringsfel osv.).
Information om all extrapolering, alla antaganden och approximeringar gjorda under experimentproceduren samt om bedömning och bearbetning av data.
Alla mätningar som gjorts för konstruktion av kalibrenngskurvan ska dokumenteras i en tabell som inkluderar följande information för varje kalibreringspunkt:
Provets namn.
Provets tillverkare.
Karakteristikvärden för standardämnena Mp, Mn, Mw och Mw/Mn, enligt tillverkaren eller från efterföljande mätningar, tillsammans med detaljerade uppgifter om fastställandemetoden.
Injektionsvolym och insprutningskoncentration.
Mp värde för kalibrering.
Elueringsvolym eller korrigerad retentionstid mätt vid maximalt toppvärde.
Mp beräknat vid maximalt toppvärde.
Procentfel för beräknat Mp och kalibreringsvärde.
2.2.4 Information om innehåll av lågmolekylvikt i polymer
Beskrivning av de metoder som används för analys och hur experimentet utfördes.
Information om andelen innehåll lågmolekylviktarter (w/w) för hela provet.
Information om föroreningar, tillsatser och andra icke-polymera arter, som viktandel i förhållande till hela provet.
2.2.5 Bedömning
Bedömning på tidsbasis: metoder som används för att säkerställa önskad reproducerbarhet (korrek tionsmetod, intern standard osv.).
Information om huruvida bedömningen gjorts på basis av elutionsvolymen eller retentionstiden.
Information om gränserna för bedömningen, om ett toppvärde inte analyserats fullständigt.
Beskrivning av utjämningsmetoder, om sådana används.
Beredning av och förbehandlingsprocedurer för provet.
Närvaro av oupplösta partiklar, om sådana förekommit.
Injektionsvolym (μ1) och injektionskoncentration (mg/ml).
Anmärkningar om effekter som lett till avvikelser från den ideala GPC-profilen.
Detaljerad beskrivning av alla ändringar i provningsförfarandet.
Detaljerade uppgifter om felområden.
All övrig information och anmärkningar relevanta för tolkningen av resultatet.
3.1.2.3.4. HÄNVISNINGAR DIN 55672 (1995), Gelégenomträngningskromatografi (GPC) med tetrahydrofuran (THF) som elutionsmedel, del 1. Yau, W.W., Kirkland, J.J., och Bly, D.D. eds. (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromato- graphy, J. Wiley och Sons. (ung. Modern vätskeuteslutningskromatografi för uteslutning). ASTM D 3536-91, (1991), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning med vätskeuteslutningskromatografi (gelégenomträngningskromatografi – GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. ASTM D 5296-92, (1992), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning i polystyren med storleksseparationskromatografi. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
A.20 POLYMERERS BETEENDE I VATTEN VID LÖSNING/EXTRAKTION
A.20
1. METOD Den beskrivna metoden är en kopia av en reviderad version av OECD TG 120 (1997). Ytterligare teknisk information finns i hänvisning 1.
1.
1.1 INLEDNING För vissa polymerer, som t.ex. emultionspolymerer, kan visst inledande förberedande arbete krävas innan nedanstående metod kan användas. Metoden är inte tillämplig på flytande polymerer och på polymerer som under provningsförhållandena reagerar med vatten. När metoden inte är praktisk eller möjlig kan beteendet vid lösning/extraktion undersökas med andra metoder. I så fall ska fullständiga detaljer och motivering för den använda metoden anges.
1.2. REFERENSÄMNEN Inga.
1.3. UNDERSÖKNINGSMETODENS PRINCIP Polymerernas beteende vid lösning/extraktion i vatten fastställs med flaskmetoden (se A.6 lösnings-barhet i vatten, flaskmetod) med nedan beskrivna ändringar.
1.4. KVALITETSKRITERIER Inga,
1.5. BESKRIVNING AV UNDERSÖKNINGSMETODEN
1.5.
1.5.1 Utrustning Följande utrustning krävs för denna metod:
Krossanordning, t.ex. kvarn för produktion av partiklar med känd storlek.
Apparater för skakning med möjlighet till temperaturövervakning.
Membranfiltersystem.
Lämplig analysutrustning.
Standardsil.
1.5.2 Beredning av prover Ett representativt prov ska först reduceras till en partikelstorlek på mellan 0,125 och 0,25 mm med lämplig sil. Kylning kan krävas för provets stabilitet eller för malningsprocessen. Material med gummiliknande natur kan krossas vid temperaturen på flytande kvävgas (1). Om den önskade partikelstorleksfraktionen inte kan skapas ska åtgärd vidtas för att i största utsträckning minska partikelstorleken och resultatet därav registreras. Det ska i rapporten anges på vilket sätt det krossade provet förvarats fram till undersökningen.
1.5.3 Förfarande Tre prover på 10 g av det undersökta ämnet ska vägas i vart och ett av tre kärl försedda med glaspropp, och därefter ska 1000 ml vatten tillsättas till varje kärl. Om hantering av 10 g polymer visar sig vara opraktiskt, ska den närmast högre mängd som kan hanteras användas och vattenvolymen justeras i enlighet därmed. Kärlen ska tillslutas noggrant och därefter upphettas till 20 oC. En skak- eller omrörningsanordning som kan arbeta vid konstant temperatur ska användas. Efter en period på 24 timmar ska innehållet i varje kärl centrifugeras eller filtreras och polymerkoncentrationen i den klara vätskefasen fastställas med lämplig analysmetod. Om ingen lämplig analysmetod för vätskefasen finns kan den totala lösbarheten/extraktionsbarheten uppskattas utifrån filterrestens eller centrifugrestens torra vikt. Det är vanligtvis nödvändigt att kvantitativt differentiera å ena sidan föroreningarna och tillsatserna och å andra sidan de med låg molekylvikt. Det är också viktigt att vid gravimetriskt fastställande göra ett blankprov utan undersökt ämne, för att kunna ta hänsyn till resterna från experimentet. Polymerernas beteende vid lösning/extraktion i vatten vid 37 oC och pH 2 samt pH 9 kan fastställas på samma sätt såsom beskrivet för utförandet av experimentet vid 20 oC. pH-värdena kan erhållas genom tillsats av antingen lämplig buffert eller syra eller bas, som t.ex. saltsyra, ättiksyra, analytiskt natrium eller kaliumhydroxid eller NH3. En eller två undersökningar ska göras, beroende på vilken analysmetod som används. När tillräckligt specifika metoder finns för direktanalys av vätskefasen avseende polymerkomponenten, är det tillräckligt med en sådan undersökning som beskrivits här ovan. När sådana metoder inte finns tillgängliga och fastställande av polymerens beteende vid lösning/extraktion begränsas till indirekt analys, genom fastställande enbart genom det totala innehållet organiskt kol (TOC) i vätskeextraktet, ska ytterligare en undersökning göras. Denna kompletterande undersökning ska också göras på tre prover, med tio gånger mindre polymer och samma mängd vatten som använts vid den första undersökningen.
1.5.4 Analys
1.5.4
1.5.4.1 Undersökningar utförda med en provstorlek Det kan finnas metoder tillgängliga för direktanalys av polymerkomponenter i vätskefasen. Alternativt kan eventuellt också indirekt analys av upplösta/extraherade polymerkomponenter, genom fastställande av det totala innehållet upplösningsbara delar och korrigering för ej polymerspecifika komponenter, göras. Analys av vätskefasen avseende totala polymeriska arter är möjlig antingen genom tillräckligt känslig metod, t.ex.: eller genom vakuumevaporation till torrhet av vätskeextraktet och spektroskopisk analys IR, UV, osv.) eller AAS/ICP-analys av resten. Om analys av vätskefasen som sådan inte är praktiskt genomförbar, ska vätskeextraktet extraheras med ett vattenoupplösligt organiskt lösningsmedel, t.ex. klorerat kolväte. Lösningsmedlet evaporeras därefter och resten analyseras enligt ovan avseende angivet polymerinnehåll. Komponenter i denna rest som identifieras som föroreningar eller tillsatser ska subtraheras för bestämning av polymerens egen upplösning/extraktion. När förhållandevis stora mängder sådant material finns närvarande, kan det vara nödvändigt att analysera resterna, t.ex. HPLC- eller GC-analys för att differentiera föroreningarna från monomera och monomerderiverade ämnen, så att det faktiska innehållet av det senare kan fastställas. I vissa fall kan vanlig evaporation av det organiska lösningsmedlet till torrhet och vägning av den torra resten vara tillräckligt.
TOC med hjälp av persulfat- eller dikromatupplösning för att producera CO2, följt av uppskattning med IR-analys eller kemisk analys,
Atomabsorbtionsspektrometri (AAS) eller dess induktivt kopplade plasmautsläpp (ICP) motsvarande den för kisel- eller metallinnehållande polymerer,
UV-absorbtion eller spektrofluorimetri för akrylpolymerer,
LC-MS för lågmolekylviktsprover,
1.5.4.2 Provning med två olika provstorlekar Alla vätskeextrakt analyseras avseende total mängd organiskt kol. Gravimetrisk bestämning ska göras på den oupplösta/ej extraherade delen av provet. Om polymer-resten, efter centrifugering eller filtrering av innehållet i varje kärl, sitter kvar på kärlväggen, ska kärlet sköljas med filtratet tills kärlet är rent från alla synliga rester. Därefter ska filtratet återigen centrifugeras eller filtreras. Kvarvarande rester på filtret eller i centrifugröret torkas vid 40 oC under vakuum och vägs. Torkningen ska fortsätta tills konstant vikt nås.
2. DATA
2.
2.1 PROVNING MED EN ENDA PROVSTORLEK De enskilda resultaten för var och en av de tre flaskorna samt medelvärdena ska anges och uttryckas i enheter för massa/volym lösning (normalt mg/l) eller massa/massa av polymerprovet (normalt mg/g). Dessutom ska provets viktförlust anges, beräknad som lösningens vikt dividerad med det ursprungliga provets vikt. Den relativa standardavvikelsen ska beräknas. Enskilda värden ska ges för hela ämnet (polymer plus väsentliga tillsatser osv.) och för polymeren ensam (dvs. efter subtraktion av bidraget från sådana tillsatser).
2.2 PROVNING MED TVÅ OLIKA PROVSTORLEKAR De enskilda värdena för total mängd organiskt kol i vätskeextrakten för de två trippelexperimenten och medelvärdet för varje experiment ska anges, uttryckt som massa per volym lösning (normalt mg C/l), samt som massa per vikt för det ursprungliga provet (normalt mg C/g). Om ingen skillnad föreligger mellan resultaten för stort respektive litet förhållande mellan prov och vatten, kan detta innebära att alla extraherbara komponenter faktiskt extraherats. I sådana fall krävs normalt ingen direkt analys. Resternas individuella vikter ska anges och uttryckas i procent av provernas initialvikt. Medelvärden ska beräknas för varje experiment. Skillnaderna mellan 100 och funnen procentandel representerar andelen lösningsbart och extraherbart material i ursprungsprovet.
3. RAPPORT
3.
3.1 PROVNINGSRAPPORT Provningsrapporten ska innehålla följande information:
3.1
3.1.1 Undersökt ämne
Tillgänglig information om ämnet, identitet, tillsatser, föroreningar, innehåll av varianter med låg molekylvikt.
3.1.2 Experimentella förhållanden
Beskrivning av tillämpat förfarande och experimentella förhållanden.
Beskrivning av analys- och detektionsmetoder.
3.1.3 Resultat
Resultatet avseende lösningsbarhet/extraktionsbarhet i mg/l, individuella värden och medelvärden för extraktionsprovet för de olika lösningarna, uppdelat i polymerinnehåll och föroreningar, tillsatser osv.
Resultatet av upplösningen/extraktionen av polymeren i mg/g.
Värden för det totala innehållet organiskt kol i vätskeextrakten, lösningens vikt och beräknade andel, om denna mäts.
pH-värde för varje prov.
Information om blankvärden.
Vid behov hänvisningar till det undersökta ämnets kemiska instabilitet, både under provnings- och analysprocessen.
All information som är viktig för tolkningen av resultaten.
4.1. HÄNVISNINGAR DIN 53733 (1976), Provtagning från plastprodukter för provningsändamål.
A.21 OXIDERANDE EGENSKAPER (VÄTSKOR)
A.21
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Denna provningsmetod är utformad för att mäta ett flytande ämnes potential att öka förbränningshastigheten eller förbränningsintensiteten hos ett brännbart ämne, eller att bilda en blandning med ett brännbart ämne som självantänds när de två blandas noggrant. Metoden är baserad på FN:s provningsmetod Provning för oxiderande vätskor (1) och är likvärdig med den. Då denna metod A.21 emellertid i första hand är utformad för att uppfylla kraven i förordning (EG) nr 1907/2006, krävs endast jämförelse med ett referensämne. Provning och jämförelse med ytterligare referensämnen kan bli nödvändiga om provningsresultaten förväntas användas för andra syften. Denna provning behöver inte utföras när en undersökning av strukturformeln kan fastställa att ämnet utan rimligt tvivel är oförmöget att reagera exotermiskt med ett brännbart material. Det är värdefullt att ha förhandsinformation om ämnets alla möjliga explosiva egenskaper innan denna provning utförs. Denna provning är inte tillämplig på fasta ämnen, gaser, explosiva eller mycket brandfarliga ämnen, eller peroxider. Denna provning behöver eventuellt inte utföras, om resultat för provsubstansen ifråga från provning enligt FN:s Provning för oxiderande vätskor (1) redan finns tillgängliga.
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER Med medeltid för tryckstegring avses medelvärdet av de uppmätta tiderna för att en blandning vid provning ska åstadkomma en tryckökning från 690 kPa till 2070 kPa över det atmosfäriska trycket.
1.3 REFERENSÄMNE 65 % (viktprocent) salpetersyra (analysgrad) ska användas som referensämne. Om den som utför försöken förutser att resultaten från denna provning eventuellt kommer att användas för andra syften, kan även provning med ytterligare referensämnen vara lämpligt.
1.4 PRINCIPEN FÖR PROVNINGSMETODEN Vätskan som ska provas blandas med fibercellulosa, i ett viktförhållande 1 till 1, och införs i ett tryckkärl. Om vid blandning eller fyllning självantändning inträffar krävs ingen ytterligare provning. Om självantändning inte inträffar ska hela provningen utföras. Blandningen upphettas i ett tryckkärl och medelvärdet fastställs för den tid det tar för trycket att stiga från 690 kPa till 2070 kPa över det atmosfäriska trycket. Denna medeltid jämförs med medeltiden för trycket att stiga för en 1:1-blandning av referensämnet (-ämnena) och cellulosa.
1.5 KVALITETSKRITERIER I en serie om fem försök med ett och samma ämne ska inget resultat avvika med mer än 30 % från det aritmetiska medelvärdet. Resultat som avviker med mer än 30 % från medelvärdet ska förkastas, tillvägagångssättet för blandning och fyllning förbättras och provningen upprepas.
1.6 BESKRIVNING AV METODEN
1.6
1.6.1 Preparering
1.6.1
1.6.1.1 Brännbart ämne Torkad fibercellulosa med en fiberlängd mellan 50 och 250 μm och en medeldiameter av 25 μm, används som brännbart material. Den torkas tills vikten inte ändras, i ett lager som är högst 25 mm tjockt vid 105 oC under fyra timmar, och förvaras i en exikator med torkmedel tills den svalnat och ska användas. Vattenhalten i den torkade cellulosan ska vara mindre än 0,5 % av torrsubstansen. Om det behövs ska torktiden förlängas för att uppnå detta. Samma parti cellulosa ska användas under hela provningen.
1.6.1.2 Apparat
1.6.1.2
1.6.1.2.1 Tryckkärl Ett tryckkärl krävs. Kärlet består av ett cylindriskt tryckkärl som är 89 mm långt med en ytterdiameter av 60 mm (se figur 1). Två plana ytor bearbetas fram på motstående sidor (minskar kärlets tvärsnitt till 50 mm) för att underlätta fasthållning när tändstift och urluftningsplugg monteras. Kärlet som har en urborrning med en diameter av 20 mm har falsats på insidan i båda ändar till ett djup av 19 mm och gängats till 1British Standard Pipe (BSP) eller metrisk motsvarighet. En tryckavlastare, i form av ett sidostycke, är inskruvad i den rundade delen av tryckkärlet 35 mm från ena änden och vinkelrätt mot de plana ytorna. Uttaget för detta borras till ett djup av 12 mm och gängas till 1/2 BSB (eller metrisk motsvarighet) för att passa till gängan på sidostyckets ände. Om så behövs kan en inert tätning anbringas för att se till att anslutningen blir gastät. Sidostycket sticker ut 55 mm från tryckkärlets huvuddel och har ett hål med en diameter av 6 mm. Sidostyckets ände är falsad och gängad för att passa en tryckgivare av membrantyp. Alla tryckmätningsanordningar kan användas under förutsättning att de inte påverkas av de heta gaserna eller upplösningsprodukterna och klarar att svara på tryckhöjningshastigheter motsvarande 690–2070 kPa på mindre än 5 ms. Tryckkärlets ände som är längst från sidostycket är förseglad med ett tändstift som är utrustat med två elektroder, den ena isolerad från och den andra ansluten till tändstiftets huvuddel. Den andra änden av tryckkärlet är förseglad med ett sprängbleck (sprängtryck cirka 2200 kPa) som hålls på plats av en fästplugg med ett hål med en diameter av 20 mm. Om så behövs kan en inert tätning användas tillsammans med tändstiftet för att garantera en gastät anslutning. En stödställning (figur 2) håller enheten i rätt läge vid användning. Denna omfattar vanligen en gjutstålsplatta med måtten 235 mm × 184 mm × 6 mm och ett 185 mm långt fyrkantsrör 70 mm × 70 mm × 4 mm. En sektion är bortskuren från motstående sidor i ena änden av fyrkantsrörets längd så att en struktur med två plansidiga ben som sticker ut från ett 86 mm långt helt fyrkantrör återstår. Ändarna på dessa plana sidor kapas av med en vinkel av 60o mot horisontalplanet och svetsas fast på bottenplattan. Ett urtag som är 22 mm brett och 46 mm djupt bearbetas fram på den ena sidan av den övre änden av fyrkantsröret, på så sätt att sidostycket passar in i urtaget när tryckkärlsenheten – med tändstiftsänden först – sänks ned i stödställningen. En stålbit som är 30 mm bred och 6 mm tjock svetsas fast på den undre inre sidan av fyrkantsröret för att fungera som en distans. Två 7 mm tumskruvar, gängade i motsatta sidor, håller tryckkärlet stadigt på plats. Två 12 mm breda band av 6 mm tjockt stål, svetsade på de sidobitar som sitter på fyrkantsrörets undre del, stödjer tryckkärlet från undersidan.
1.6.1.2.2 Tändsystem Tändsystemet består av en 25 cm lång Ni/Cr-tråd med en diameter av 0,6 mm och ett motstånd av 3,85 ohm/m. Tråden är lindad, med hjälp av en 5 mm tjock stång, till formen av en spiral och är fastsatt vid tändstiftets elektroder. Spiralen ska ha ett av de utseenden som visas i figur 3. Avståndet mellan tryckkärlets undersida och undersidan av tändspiralen ska vara 20 mm. Om elektroderna inte går att justera ska tändtrådens ändar mellan spiralen och kärlets undersida isoleras med ett keramiskt överdrag. Tråden värms upp av en kraftkälla med konstant spänning som kan ge minst 10 A.
1.6.2 Provningens utförande Apparaten, helt monterad med tryckgivare och uppvärmningssystem men utan sprängblecket på plats, stöds med tändstiftsänden nedåt. 2,5 g av den vätska som ska provas blandas med 2,5 g torkad cellulosa i dekanteringsglas med hjälp av en omrörningsstav av glas. För säkerhets skull ska blandningen utföras med en skyddsskärm mellan operatören och blandningen. Om vid blandning eller fyllning självantändning uppstår krävs ingen ytterligare provning. Blandningen tillsätts tryckkärlet i små portioner under knackning, så att blandningen säkert packas runt tändspiralen och är i god kontakt med den. Det är viktigt att spiralen inte förvrids under packningsprocessen då detta kan leda till oriktiga resultat. Sprängblecket sätts på plats och fästpluggen skruvas åt ordentligt. Det fyllda kärlet placeras, med sprängblecket överst, i stödställningen vilken ska stå i ett lämpligt, förstärkt dragskåp eller eldningsutrymme. Kraftförsörjningen ansluts till tändstiftets yttre anslutningar och 10 A läggs på. Tiden mellan det att blandningen påbörjas och inkopplingen av strömmen får inte överstiga 10 minuter. Signalen som avges av tryckgivaren registreras med ett lämpligt system som möjliggör både utvärdering och alstring av en permanent dokumentering av den tidtrycksprofil som erhålls (t.ex. en transientregistrerare kopplad till en skrivare). Blandningen upphettas tills sprängblecket går sönder eller tills minst 60 s har gått. Om sprängblecket inte går sönder, ska man låta blandningen svalna innan man försiktigt demonterar apparaten, med vidtagande av försiktighetsåtgärder för att hantera eventuellt övertryck. Fem försök utförs med provämnet och referensämnet (-ämnena). Den tid det tar för trycket att stiga från 690 kPa till 2070 kPa över det atmosfäriska trycket noteras. Medelvärdet för tryckstegringstiden beräknas. I vissa fall kan ämnen alstra en tryckstegring (alltför snabb eller alltför långsam) som orsakas av kemiska reaktioner och som inte är relaterad till ämnets oxiderande egenskaper. I dessa fall kan det vara nödvändigt att upprepa provningen med ett inert ämne, t.ex. diatomit (kiselgur), i stället för cellulosa för att klargöra reaktionens natur.
2. DATA Tryckstegringstiderna både för provämnet och referensämnet (-ämnena). Tryckstegringstiderna för provningarna med ett inert ämne, om sådana utförts.
2.
2.1 Tabell 1 Exempel på resultat
BEHANDLING AV RESULTAT Tryckstegringstiderna både för provämnet och referensämnet (-ämnena) beräknas. Medelvärdet för tryckstegringstiderna för provningarna med ett inert ämne (om sådana utförts) beräknas. I tabell 1 visas några exempel på resultat. Ämne Medeltryckstegringstid för en 1:1-blandning med cellulosa (ms) Ammoniumdikromat, mättad vattenlösning 20800 Kalciumnitrat, mättad vattenlösning 6700 Järn(III)nitrat, mättad vattenlösning 4133 Litiumperklorat, mättad vattenlösning 1686 Magnesiumperklorat, mättad vattenlösning 777 Nickelnitrat, mättad vattenlösning 6250 Salpetersyra, 65 % 4767 Perklorsyra, 55 % 121 Perchloric acid, 55 % 59 Kaliumnitrat, 30 % vattenlösning 26690 Silvernitrat, mättad vattenlösning Natriumklorat, 40 % vattenlösning 2555 Natriumnitrat, 45 % vattenlösning 4133 Inert ämne Vatten: cellulosa
3. RAPPORT
3.
3.1 PROVNINGSRAPPORT Provningsrapporten ska omfatta följande information:
Identiteten, sammansättningen, renheten, etc. för det ämne som provas.
Provämnets koncentration.
Torkprocessen för använd cellulosa.
Vattenhalten för använd cellulosa.
Resultatet av mätningarna.
Resultatet från provningar med ett inert ämne, om sådana utförts.
Det beräknade medelvärdet för tryckstegringstiden.
Alla avvikelser från denna metod och orsaken till dem.
All ytterligare information eller kommentarer som har betydelse för resultatets tolkning.
3.2 TOLKNING AV RESULTATET Provningsresultaten har bedömts på grundval av Ett flytande ämne anses vara ett oxidationsmedel om För att undvika falska positiva resultat ska, om så behövs, även de resultat som erhålls vid provning av ämnet med ett inert material beaktas då resultaten tolkas.
3.2 a)
huruvida blandningen av provämne och cellulosa självantänder, och jämförelse av medelvärdet för den tid det tar för trycket att stiga från 690 kPa till 2070 kPa
b)
med respektive referensämne (-ämnen).
a)
en 1:1-blandning, i viktdelar, av ämnet och cellulosa självantänder, eller
b)
en 1:1-blandning, i viktdelar, av ämnet och cellulosa uppvisar ett medelvärde för tryckstegringstiden som är mindre än eller lika med medelvärdet för tryckstegringstiden för en 1:1-blandning, i viktdelar, av 65 % (viktprocent) salpetersyra och cellulosa.
4.1. HÄNVISNINGAR FN:s rekommendationer om transport av farligt gods, manual för provningar och kriterier. 3:e reviderade utgåvan. FN:s publikation nr: ST/SG/AC.10/1 l/rev. 3, 1999, sid. 342. Provning O.2: Provning för oxiderande vätskor. Anm.: Endera av de här systemen kan användas.
4.1.
Figur 1 Tryckkärl
A. Tryckkärl, huvuddel B. Fästplugg för sprängbleck C. Tändstift D. Mjuk blybricka E. Sprängbleck F. Sidostycke G. Fäste för tryckgivare H. Bricka J. Isolerad elektrod K. Jordad elektrod L. Isolering M. Stålkon N. Tätningsspår för bricka
Figur 2 Stödställning
Figur 3 Tändsystem
(A) Tändspiral (B) Isolering (C) Elektroder (D) Tändstift
Tillägg Kompletterande tekniska upplysningar finns i följande standarder:
1. Kapillärmetoder
1.
1.1 Smältpunktsanordningar med vätskebad ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals BS 4634 Method for determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products
1.2 Smältpunktsanordningar med metallblock DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point
2. Värmebord
2.
2.1 Koflers värmebänk ANSI/ASTM D 3451 76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
2.2 Smältmikroskop DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
2.3 Meniskmetoden (polyamider) ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of melting point ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Determination du point de fusion Methode du ménisque
3. Metoder för bestämning av fryspunkt BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point
4. Termisk analys
4.
4.1 Differentiell termisk analys ASTM E 537-76 Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe
4.2 Differentiell scanningkalorimetri ASTM E 537-76 Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe
5. Bestämning av flytpunkt NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point.
Tillägg Kompletterande tekniska uppgifter finns, i följande standarder:
1. Ebulliometer ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
2. Destillationsprocess (kokpunktsintervall) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Field and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Lösungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siederverlaufes NF T 20-608 Distillation: determination du rendement et de l'intervalle de distillation
3. Differentiell termisk analys och differentiell scanningkalorimetri ASTM E 537-76 Standard method for assessine the thermal stability of chemicals by methods or differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe
Tillägg Kompletterande tekniska uppgifter finns i följande standarder:
1. Flottörmetoder
1.
1.1 Hydrometer DIN 12790, ISO 3S7 Hydrometer, general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, admjustment and use; Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids Aerometric method DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers
1.2 Hydrostatisk balans
1.2 För fasta ämnen
ISO 1183 Method A: Methods för determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastometers; determination of density
För vätskor
ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 och ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petro-leum products by hydrometer method
1.3 Metod med nedsänkt kula DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; lmmersed body method
2. Pyknometermetoder
2.
2.1 För vätskor ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 oC DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (för icke-flyktiga vätskor som inte är för viskösa) DIN 12798 Lipkin pycnometer (för vätskor med kinematisk viskositet under 100 × 10-6 m2s-1 vid 15 oC) DIN 12800 Sprengel pycnometer (för vätskor enligt DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (för vätskor med kinematisk viskositet under 100 × 10-6 m2s-1 vid 20 oC, särskilt lämplig även för kolväten och vattenlösningar samt för vätskor med högre ångtryck, cirka 1 bar vid 90 oC) DIN 12806 Hubbard pycnometer (för alla typer av viskösa vätskor som inte har för högt ångtryck, särskilt även för färg, lacker och bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (för vätskor enligt DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (särskilt för etanol-vattenblandningar) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tubes (för väts-kor som inte är för tjockflytande) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical analysis ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pykonometric method
2.2 För fasta ämnen ISO 1183 Metod B i Method for Determining the Density and Relative Density of Plastics excluding Cellular Plastics NF T 20-053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pycnometric method DIN 19683 Determination of the density of soils
3. Luftjämförelsepyknometer N Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen: Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung
Tillägg 1 Utvärderingsmetod
INLEDNING
Man kan använda beräknade värden av ångtrycket för att
bestämma vilken försöksmetod som är lämplig,
göra en bedömning eller fastställa ett gränsvärde om man av tekniska orsaker (inbegripet när ångtrycket är mycket lågt) inte kan använda försöksmetoder,
konstatera i vilket fall det är berättigat att avstå från försöksmätningar till följd av att ångtrycket sannolikt kommer att vara < 10-5 Pa vid omgivningstemperatur.
BEDÖMNINGSMETOD
Vätskors och fasta ämnens ångtryck kan bedömas genom användning av den modifierade Watson-korrelationen (se hänvisning a). De enda testdata som är nödvändiga är den normala kokpunkten. Metoden kan användas vid ett tryckområde från 105 Pa till 10-5 Pa. Närmare information om metoden finns i Handbook of Chemical Property Estimation Methods (se hänvisning b).
BERÄKNINGSFÖRFARANDE
I enlighet med hänvisning b beräknas ångtrycket enligt följande: ln Pvp ≈ Δ HvbΔ ZbRTb1-3-2 TTbmTTb-2m3-2 TTbm-1ln TTb där: T Den gällande temperaturen Tb Normal kokpunkt Pvp Ångtryck vid temperatur T Δ Hvh Förångningsvärme Δ Zb Kompressionsfaktor (beräknad till 0,97) m Empirisk faktor beroende av det fysiska tillståndet hos den gällande temperaturen Dessutom: Δ HvbTb=KF8,75+R ln Tb där KF är en empirisk faktor som beaktar ämnets polaritet. I hänvisning b finns det en förteckning med KF-faktorer för flera typer av föreningar. Det är ganska vanligt med data som anger kokpunkt vid sänkt tryck. I sådana fall kan man i enlighet med hänvisning b beräkna ångtrycket på följande sätt: ln Pvp ≈ ln P1+Δ Hv1Δ ZbRT11-3-2 TT1m T1T-2m3-2 TT1m-1 ln TT1 där T1 är kokpunkten vid sänkt tryck P1.
RAPPORT
När utvärderingsmetoden används ska rapporten inbegripa en omfattande dokumentation av beräkningen.
HÄNVISNINGAR
1. K. M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, s. 398.
2. W. J. Lyman, W. F. Reehl, D, H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods Mc Graw-Hill, 1982.
Tillagg 2
Figur 1 Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt den dynamiska metoden
1 = Termoelement 2 = Vakuumbuffertvolym 3 = Tryckmatare 4 = Vakuum 5 = Mätpunkt 6 = Varmeelement cirka 150 W
Figur 2a Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt den statiska metoden (med U-rörsmanometer)
1. Testämne 2. Ångfas 3. Högvakuumventil 4. U-rör (hjälpmanometer) 5. Manometer 6. Temperaturbad 7. Temperaturmätningsanordning 8. Till vakuumpump 9. Ventilation
Figur 2b Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt den statiska metoden (med tryckindikator)
1. Testämne 2. Ångfas 3. Högvakuumventil 4. Tryckmätare 5. Tryckindikator 6. Temperaturbad 7. Temperaturmätningsanordning
Figur 3 Isoteniskop (se hänvisning 7).
1. Till system för tryckreglering och tryckmätning 2. Rör med en ytterdiameter av 8 mm 3. Torrt kväve i trycksystemet 4. Ånga av provet 5. Liten spets 6. Flytande prov
Figur 4 Apparat för bestämning av ångtryckskurvan enligt ångtrycksvågsmetoden
1. Testämne 2. Ångfas med ångstrale 3. Förångningsugn med roterande intag 3a. Ugnslock med öppning 4. Uppvärmning (kylning) av ugn 5. Matning av provens temperatur 6. Kylbox 7. Skärm 8. Kylstång för kylbox 9. Vägskal 10. Mikrovåg 11. Till skrivare 12. Till högvakuumpump
Figur 5 Exempel på en apparat för förångning vid lågt tryck genom effusionsmetoden, med en effusionscellvolym av 8 cm
1 Anslutning till vakuum 2. Öppningar for platinamotståndstermometer eller för mätning och kontroll av temperatur (2) 3. Lock till vakuumbehållare 4. O-ring 5. Vakuumbehållare av aluminium 6. Anordning for införing och borttagande av effusionsceller 7. Skruvlock 8. Vingmuttrar (6) 9. Bultar (6) 10. Effusionsceller av rostfritt stal 11. Varmepatroner
Figur 6a Exempel på ett flödessystem för bestämning av ångtryck genom gasmättnadsmetoden
1. Flödesregulator 2. Värmeväxlare 3. Nålventiler 4. Givare för relativ fuktighet 5. Mättnadskolonner 6. Teflon PTFE-tätning 7. Flödesmätare 8. Fälla (absorber) 9. Oljefälla 10. Bubbelrör av glasfritta Vent Manifold
Figur 6b Exempel på ett system för bestämning av ångtryck genom gasmättnadsmetoden med kapillärrör placerat efter gasmättnadskammaren
1. Termisk massflödesmätare 2. Manometer 3. Temperaturkontrollerad kammare 4. Termostatspolar för bärargas 5. Termometer (Pt 100) 6. Gasmättnadskammare 7. Kapillärrorr 8. Absorptionskarl 9. Gasmätare 10. Kylfälla
Figur 7 Exempel på försöksanordning för rotormetoden
Ångtrycksapparat A. Mäthuvud med roterande kula B. Provcell C. Termostat D. Vakuumrör (turbopump) E. Lufttermostat
Figur 8 Exempel på mathuvud med roterande kula
1. Kula 2. Evakuerad rörformad förlängning av 6 3. Permanentmagneter (2) 4. Spolar (2) för vertikal stabilisering 5. Drivspolar (4) 6. Anslutningsfläns
Tillägg
Figur 1 Kolonnelueringsmetod med recirkulationspump
Atmosfärisk jämvikt Flödesmätare Mikrokolonn Termostatreglerad cirkulationspump Recirkulationspump Tvävägsventil för provtagning
Figur 2 En typisk mikrokolonn
(Alla mått anges i mm) Anslutning till övergångsstycke (slipat glas) Tomt utrymme Invändigt 5 Utvändigt 19 Glasullspropp Avstängningskran med tvåvägsfunktion
Figur 3 En typisk mikrokolonn
(Alla mått anges i mm) Anslutning till övergångsstycke (slipat glas) Tomt utrymme Invändigt 5 Utvändigt 19 Avstängningskran
Figur 4 Kolonnelueringsmetod med nivåkärl*
1 = Nivåkarl (t.ex. 2.5 l kolv) 2 = Kolonn (se figur 3) 3 = Fraktionssamlare 4 = Termostat 5 = Teflonslang 6 = Slipad glaspropp 7 = Vattenslang (mellan termostat och kolonn, innerdiameter: ca 8 mm)
Tillägg 1 Metoder för beräkning/uppskattning
INLEDNING
I Handbook of Chemical Property Estimation Methods finns en allmän introduktion till beräkningsmetoder, data och exempel (se hänvisning a). Beräknade värden av Pow kan användas
för att bestämma vilken testmetod som är lämplig (skakkolvområde: log Pow: 2 till 4, HPLC-område: log Pow: 0 till 6),
för val av lämpliga testbetingelser (t.ex. referensämnen för HPLC-förfaranden, volymratio n-oktanol/vatten för skakkolvmetoden),
som en intern laboratoriekontroll vid eventuella försöksfel,
för att få en uppskattning av Pow i fall där testmetoderna inte kan tillämpas av tekniska skäl.
UPPSKATTNINGSMETOD Preliminär uppskattning av fördelningskoefficient.
Fördelningskoefficientens värde kan uppskattas med hjälp av testsubstansens löslighet i rena lösningsmedel. För detta används: Puppskattning = mättnad cn-octanolmättnad cvatten
BERÄKNINGSMETODER Principen för beräkningsmetoderna
Alla beräkningsmetoder är baserade på formell fragmentering av molekylen i lämpliga understrukturer för vilka man har pålitlig kännedom om log Pow-inkrementer. Log Pow för hela molekylen beräknas sedan som summan av dess motsvarande fragmentvärden plus summan av korrektionsuttrycken för intramolekylär växelverkan. En lista med fragmentkonstanter och korrektionsuttryck finns i hänvisningarna b, c, d och e. Vissa av dem uppdateras regelbundet (hänvisning b).
Kvalitetskriteria
Normalt avtar beräkningsmetodens pålitlighet i takt med komplexiteten hos den testade föreningen. För enkla molekyler med låg molekylvikt och en eller två funktionsgrupper kan en avvikelse av 0,1 till 0,3 förväntas mellan resultatet av olika fragmenteringsmetoder och det mätta värdet för log Pow. Felmarginalen kan vara ännu större för mer komplexa molekyler. Detta beror på pålitligheten och förekomsten av fragmentkonstanter, liksom möjligheten att känna igen intramolekylära växelverkningar (t.ex. väteförbindelser) och om korrektionstermen används korrekt (detta är inte ett lika stort problem med programvaran CLOGP-3). 1 fråga om joniserbara föreningar är det av stor betydelse att laddningen eller joniseringsgraden bedöms korrekt.
Beräkningsmetoder
Hansch Π-metoden
Den ursprungliga konstanten för hydrofoba substituenter, π, som införts av Fujita m.fl. (se hänvisning f) definieras genom πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH) I enlighet med dess definition är -metoden lämplig för aromatisk substitution. Det finns tabeller med -värden för ett stort antal substitutioner (se hänvisningar b, c och d). De används för beräkning av log Pow för aromatiska molekyler och understrukturer. (e.g. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71). där Pow (PhX) är fördelningskoefficienten av ett aromatiskt derivat och Pow (PhH) är moderföreningens fördelningskoefficient
Rekkers metod
I enlighet med Rekker (se hänvisning g) beräknas värdet av log Pow på följande sätt: log Pow=Σi ai fi+Σj där fi representerar olika molekylfragmentkonstanter och ai är den frekvens med vilken de förekommer i den molekyl som testas. Korrektionstermerna kan uttryckas som en integral multipel av en enda konstant Cm (den s.k. magiska konstanten). Fragmentkonstanterna fi ch Cm bestäms på grundval av en tabell med 1054 experimentellt bestämda värden av Pow (825 föreningar) med användning av flerdimensionell regressionsanalys (se hänvisningar c och h). Växelverkningsuttrycken bestäms efter fastställda regler som beskrivs i hänvisningslitteraturen (se hänvisningar e, h och i).
Hansch-Leos metod
I enlighet med Hansch och Leo (se hänvisning c) beräknas värden av log Pow på följande sätt: log Pow=Σi ai fi+Σj bj Fj där fi representerar de olika molekylfragmentkonstanterna, Fi är korrektionsuttrycken och ai och bj är de motsvarande uppträdandefrekvenserna. På grundval av experimentellt bestämda värden av Pow har man genom att prova sig fram kunnat ställa upp en lista över atom- och gruppfragmentvärden och en lista över korrektionsuttryck Fj (s.k. faktorer). Korrektionsuttrycken har delats in i olika klasser (se hänvisningar a och c). Det är relativt komplicerat och tidsödande att ta hänsyn till alla regler och korrektionsuttryck. Programvarupaket har utvecklats för detta (se hänvisning b).
Kombinerad metod
Beräkningen av log Pow för komplexa molekyler kan förbättras betydligt om molekylen delas upp i större delstrukturer för vilka pålitliga log Pow-värden finns tillgängliga, antingen från tabeller (se hänvisningar b och c) eller från egna mätningar. Sådana fragment (t.ex. heterocykler, anthraquinon, azobensen) kan sedan kombineras med Hanschs Π-värden eller med Rekkers eller Leos fragmentkonstanter.
Anmärkningar
i)
Beräkningsmetoderna kan endast användas på helt eller delvis joniserade föreningar om det är möjligt att beakta de nödvändiga korrektionsfaktorerna.
ii)
Om intramolekylära väteförbindelser kan antas förekomma måste motsvarande korrektionstermer (ca +0,6 till +1,0 log Pow-enheter) läggas till (se hänvisning a). Indikationer av närvaron av sådana förbindelser kan erhållas från stereomodeller eller spektroskopiska data av molekylen.
iii)
Om flera tautomeriska former är möjliga används den mest sannolika formen som bas för beräkningen.
iv)
Revisioner av listor med fragmentkonstanter ska följas noggrant.
Rapportering
Vid användning av beräknings-/uppskattningsmetoder ska testrapporten om möjligt innehålla följande information:
Beskrivning av ämnet (blandning, orenheter etc).
Indikation av eventuella intramolekylära väteförbindelser, dissociation, laddning och andra eventuella särskilda förhållanden (t.ex. tautomeri).
Beskrivning av beräkningsmetoden.
Identifiering eller tillhandahållande av databas.
Särskilda val av fragment.
Fullständig dokumentation av beräkningen.
HÄNVISNINGAR
1. W. J. Lyman, W. F. Reehl och D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
2. Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 92711, USA, Log P Database och Med. Chem. Software (Program CLOGP - 3).
3. C. Hansch och A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
4. A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, s. 525.
5. R. F. Rekker och H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem,. 1979, vol. 14, s. 479.
6. 6. T. Fujita, J. Iwasa och C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, s. 5175.
7. R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
8. C. V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, s. 1459.
9. R. A. Scherrer, ACS, American Chemical Sociery, Washington D. C, 19S4, Symposium Senes 255, s. 225.
Tillägg 2 Rekommenderade referensämnen för HPLC-metoden
Nr Referensämne Log Pow pKa 1 2-butanon 0,3 2 4-acetylpyndin 0,5 3 Anilin 0,9 4 Acetanilid 1,0 5 Bensylalkohol 1,1 6 p meloxilenol 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoxyättiksyra 1,4 pKa = 3,12 8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 10 Bensonitril 1,6 11 Fenylättiknitril 1,6 12 4-metylbensenalkohol 1,6 13 Acetonfenon 1,7 14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 3-nitrobcnsoesyra 1,8 pKa = 3,47 16 4-kloranilin 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobensen 1,9 18 Kanelalkohol 1,9 19 Bensoesyra 1,9 pKa = 4,19 20 p-kresol 1,9 pKa = 10,17 21 Kanelsyra 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 träns 22 Anisol 2,1 23 Metylbensoat 2,1 24 Bensen 2,1 25 3-metylbensoesyra 2,4 pKa = 4,27 26 4-klorfenol 2,4 pKa = 9,1 27 Trikloretylen 2,4 28 Atrazin 2,6 29 Etylbensoat 2,6 30 2,6-diklorbensonitril 2,6 31 3-klorbensoesyra 2,7 pKa = 3,82 32 Toluen 2,7 33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dikloranilin 2,8 35 Monoklorbensen 2,8 36 Allyl-fenyleter 2,9 37 Bromobensen 3,0 38 Etylbensen 3,2 39 Bensofenon 3,2 40 4-fenylfenol 3,2 pKa = 9,54 41 Tymol 3,3 42 1,4-diklorbensen 3,4 43 Difenylamin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftalen 3,6 45 Fenylbensoat 3,6 46 Isopropylbensen 3,7 47 2,4,6-triklorfenol 3,7 PKa = 6 48 Bifenyl 4,0 49 Bensylbensoat 4,0 50 2,4-dinitro-6 sec. butylfenol 4,1 51 1,2,4-triklorbensen 4,2 52 Dodekansyra 4,2 53 Difenyleter 4,2 54 n-butylbensen 4,5 55 Fenantren 4,5 56 Fluoranten 4,7 57 Dibensyl 4,8 58 2,6-difenylpyridin 4,9 59 Tnfenylamin 5,7 60 DDT 6,2 Andra referensämnen med låg log Pow 1 Nikotinsyra -0,07
Tillägg
Figur Form och tillbehör för anordning av testhögen
(Alla mått i mm) Formens längd: 250 mm Material: Aluminium
Tillägg
Figur Apparatur
Tillägg
Exempel på materialspecifikation för värmesensitivitetstestet (se DIN 1623) 1.2.3.
Rör: Materialspecifikation nr 1.0336.505 g. Strypfläns: materialspecifikation nr 1.4873. Gängad krage och mutter: materialspecifikation nr 1.3817.
Figur 1 Apparatur för värmesensitivitetstest
(Alla mått i mm) Fig. 1a Stålrör och tillbehör 1. rör 1a. utvandig fläns 2. gängad krage, lågfriktionsgänga 3. strypfläns a = 2.0 eller 6.0 mm i diameter 4. mutter b = 10 mm i diameter 5. fasad yta 6. 2 tag för nyckelvidd 41 Fig. 1b Värme- och skyddsanordning 7. 2 tag för nyckelvidd 36 8. splitterfri låda 9. 2 stödpinnar för ror 10. provrör 11. position för bakre brännare, de andra brannarna ar synliga 12. pilotjet
Figur 2 Värmesensitivitetstest
Exempel på fragmentering Ingen explosion Ingen explosion Explosion Explosion Explosion Explosion
Figur 3 Kalibrering av uppvärmningshastigheten vid test av värmesensitivitet
Temperatur (°C) Tid (s) Kurvan över temperaturförloppet mot tiden vid uppvärmning av dibutylftalat (27 cm3) i ett stängt rör (strypfläns med 1,5 mm hål) med ett propanflöde av 3,2 liter/minut. Temperaturen är mätt med kromel/alumel-termoelement med 1 mm inkapsling i rostfritt stil, placerat centralt 43 mm under rörens överkant. Mellan 135 oC och 285 oC ska uppvärmningshastigheten vara 185–215 K/minut.
Figur 4 Slagpåverkanapparatur
(Alla mått i mm) Fig. 4a Fallhammare, framifrån och frän sidan, allmän överblick 1. fot, 450 x 450 x 60 2. stålblock. 230 x 250 x 200 3. stad, 100 mm i diameter x 70 4. pelare 5. mellantravers 6. 2 gejder 7. kuggstång Fig. 4b Fallhammare, lägre del 8. graderad skala 9. fallhammare (fallvikt) 10. fasthållnings- och utlösningsanordning 11. styrplatta 12. mellanstäd (utbytbart); 26 diameter x 26 13. styrring med häl 14. slaganordning
Fortsättning
Fig. 4c Slagpåverkananordning för ämnen i pulver- eller pastaform 1. stålcylindrar 2. ring för stålcylindrar 3. centrerring med hål a. lodrät genomskärning b. plan 4. gummiring 5. vätska (40 mm3) 6. vätskefritt område Fig. 4d Slaganordning för vätskor Fig. 4e Hammare (fallvikt 5 kg) 1. upphängmngstapp 2. höjdmärke 3. styrfals 4. cylindriskt slaghuvud 5. bakslagshake
Figur 5 Apparatur för friktionssensitivitet
Fig. 5a Friktionsapparatur: vertikalprojektion och grundritning 1. bottenplatta av stål 2. glidbar vagga 3. porslinsplatta, 25 x 25 x 5 mm, fäst på vagga 4. fast porslinspinne 5. testprov, cirka 10 mm3 Fig. 5b Startposition for pinne på prov 6. pinnhållare 7. Jastarm 8. motvikt 9. omkopplare 10. ratt för inställning av vagga vid startposition 11. riktning mot elektrisk drivmotor
Tillägg
Figur Form och tillbehör för iordningställande av högen
(Alla mått i mm)
Bilaga Exempel på andra metoder för fastställande av medelantalet molekylvikt (Mn) för polymerer
Gelégenomträngningskromatografi (GPC) är den metod som är att föredra för fastställande av Mn, framför allt när en uppsättning standardämnen finns tillgängliga, vilkas struktur är jämförbar med polymerens struktur. När det föreligger praktiska svårigheter med användning av GPC eller det redan finns en förväntan att ämnet inte kommer att uppfylla ett vanligt Mn-kriterium (och detta kräver bekräftelse) finns alternativa metoder, som t.ex.:
1.1.11.21.31.4
Utnyttjande av kolligativa egenskaper Ebullioscopi/kryoscopi inkluderar mätning av kokpunktshöjning (ebullioscopi) eller fryspunktssänkning (cryoscopi) för ett lösningsmedel när polymeren tillsätts. Metoden grundas på det faktum att den upplösta polymerens effekt på vätskans kok- och/eller fryspunkt beror på polymerens molekylvikt (1) (2). Tillämpningsbarhet: Mn < 20000. Sänkning av ångtryck inkluderar mätning av ångtrycket för en vald referensvätska före och efter tillsats av kända mängder polymerer (1) (2). Tillämpningsbarhet: Mn < 20000 (teoretiskt, i praktiken emellertid ett begränsat värde). Membranosmometri grundas på osmosprincipen, dvs. den naturliga tendensen för molekylerna i en lösning att passera genom ett halvgenomträngligt membran från en lösning till en koncentrerad lösning för att uppnå balans. I detta prov har den uppblandade lösningen nollkoncentration, medan den koncentrerade lösningen innehåller polymeren. Lösningens passage genom membranet förorsakar ett differenstryck som är avhängigt koncentrationen och polymerens molekylvikt (1) (3) (4). Tillämpningsbarhet: Mn < 20000–200000. Ångfasosmometri inkluderar jämförelse av förångningshastigheten för en ren aerosollösning till minst tre aerosoler innehållande polymeren vid olika koncentrationer (1) (2) (4). Tillämpningsbarhet: Mn < 20000.
2. Ändgruppanalys För att kunna använda denna metod krävs kunskap både om polymerens övergripande struktur och om den typ av kedja som avslutar ändgrupperna (som måste vara urskiljningsbar från huvudstrukturen med t.ex. NMR eller titrering/derivatisering) Fastställandet av molekylkoncentrationen i polymerens ändgrupper kan ge ett värde for rnolekylvikten (7) (8) (9). Tillämpningsbarhet: Mn upp till 50000 (med minskande tillförlitlighet).
3.1.2.3.4.5.6.7.8.9.
Hänvisningar Billmeyer, F.W. Jr., (1984), Textbook of Polymer Science (ung. Textbok om polymerforskning), tredje utg., John Wiley, New York. Glover, C.A., (1975), Absolute Colligative Property Methods (ung. Absoluta metoder för bestämning av kolligativa egenskaper), kapitel 4, In: Polymer Molecular Weights (ung. Polymerers molekylvikt), Part I P.E. Siade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. ASTM D 3750-79, (1979), Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry (ung. Standardmetod för bestämning av numerisk medelmolekylvikt med membranosmometri i polymerer). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Coll, H. (1989), Membrane Osmometry (Membranosmometri). In: Determination of Molecular Weight (Bestämning av molekylvikt), A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, s. 25–52. ASTM 3592-77, (1977), Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure (ung. Rekommenderad standardmetod för bestämning av molekylvikt med hjälp av ångtryck), American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure osmometry (Ångtrycksosmometri). In: Determination of Molecular Weight (Bestämning av molekylvikt), A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. Schröder, E., Muller, G., och Arndt, K-F., (1989), Polymer Characterisation (Polymerkarakterisering), Carl Hanser Verlag, München. Garmon, R.G., (1975), End-Group Determinations (ung. Bestämning av ändgrupper) kapitel 3 In: Polymer Molecular Weights (Polymerers molekylvikt), Del 1, P.E. Siade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. Amiya, S., et al. (1990), Pure and Applied Chemistry (ung. Ren och tillämpad kemi), 62, 2139–2146.
Bilaga Riktlinjer för korrigering av lågmolekylärt innehåll beroende på närvaro av olöslig polymer
När olösliga polymerer förekommer i ett prov, leder detta till massaförlust under GPC-analysen. Den olösliga polymeren kvarhålls definitivt i kolonnen eller provfiltret, medan den lösbara delen av provet passerar genom kolonnen. När polymerens refraktiva indexökning (dn/dc) kan uppskattas eller mätas, kan provets massaförlust i kolonnen uppskattas. I detta fall görs en korrigering med hjälp av en extern kalibrering med standardmaterial med känd koncentration och dn/dc för kalibrering av refraktometerns reaktion. I nedanstående exempel används en standardpolymer (merylmetakrylat) (pMMA). Vid den externa kalibreringen för analys av akrylpolymerer analyseras en standard-pMMA med känd koncentration i terahydrofuran med GPC, och resulterande data används för att få fram refraktometerkonstanten med följande ekvation: K = R/(C × V × dn/dc) där: K står för refraktometerkonstanten i μvs/ml, R för reaktionen på standard-pMMA i μvs, C för koncentrationen av standard-pMMA i mg/ml, V för insprutningsvolymen i ml, och dn/dc är ökningen av refrakdonsindexet för pMMA i tetrahydrofuran (i ml/mg). Följande data är normala för en standard-pMMA: R 2937891 C 1,07 mg/ml V 0,1 ml dn/dc 9 × 10-5 ml/mg Resulterande K-värde, 3,05 × 1011, används därefter för att beräkna den teoretiska detektorreaktionen, om 100 % av den insprutade polymeren hade eluerat genom detektorn.
DEL B METODER FÖR BESTÄMNING AV TOXICITET OCH ANDRA HÄLSOEFFEKTER
ALLMÄN INLEDNING A.
BESKRIVNING AV TESTSUBSTANSEN Testsubstansens sammansättning, inbegripet de viktigaste orenheterna, och dess relevanta fysikaliskt-kemiska egenskaper, inbegripet ämnets stabilitet, ska vara kända innan en toxicitetsundersökning inleds. Testsubstansens fysikaliskt-kemiska egenskaper ger viktig vägledning vid val av tillförselväg, utformning av varje enskild undersökning samt hantering och lagring av testsubstansen. En analysmetod för kvalitativ och kvantitativ bestämning av testsubstansen (om möjligt inbegripet viktiga orenheter) i doseringsmediet och i biologiska material bör utvecklas innan en undersökning inleds. Alla uppgifter om identifiering av testsubstansen, dess fysikaliskt-kemiska egenskaper, renhet och beteende bör omfattas av testrapporten.
B.
DJURVÅRD En strikt kontroll av miljöförhållandena samt tillämpliga djurvårdsmetoder är grundläggande i fråga om toxicitetstester.
i)
Förvaltningsförhållanden Miljön i försöksdjurens rum eller burar ska vara avpassade efter djurarten. Lämpliga betingelser för råttor, möss och marsvin är en rumstemperatur på 22 ±3 oC med en relativ luftfuktighet på 30 – 70 %. För kaniner och marsvin bör temperaturen hållas vid 20 ±3 oC med en relativ luftfuktighet på 30 – 70 %. Vissa testmetoder är särskilt känsliga för temperatureffekter och i dessa fall ingår detaljuppgifter om lämpliga betingelser i metodbeskrivningen. I alla undersökningar av toxiska effekter ska temperaturen och luftfuktigheten kontrolleras, registreras och anges i den slutliga testrapporten. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus, 12 timmar mörker. Detaljuppgifter om belysningsrytmen ska registreras och anges i den slutliga testrapporten. Om inte annat anges för metoden får djuren inhysas individuellt eller i små grupper av samma kön; i fråga om grupper bör högst fem djur inhysas i varje bur. I rapporter om djurförsök är det viktigt att ange vilken typ av bur som används och antalet djur i varje bur, både under exponering för det kemiska ämnet och under en påföljande observationstid.
ii)
Utfodring Fodret ska uppfylla alla näringsmässiga krav som kan ställas för den djurart som används i försöket. Om testsubstansen tillförs djuren via fodret kan näringsvärdet sjunka till följd av en samverkan mellan ämnet och någon beståndsdel i fodret. Möjligheten av en sådan reaktion ska övervägas vid tolkningen av testresultaten. Konventionellt laboratoriefoder får användas tillsammans med obegränsade mängder vatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning med testsubstansen när denna tillförs enligt denna metod. I fodret får inte finnas störande koncentrationer av föroreningar som man vet påverkar toxiciteten.
C.
ALTERNATIVA TESTER För Europeiska unionen är det ett åtagande att främja utvecklandet och valideringen av alternativa metoder som kan ge samma informationsnivå som nuvarande djurförsök, men som använder färre djur, orsakar mindre lidande eller undviker användning av djur fullständigt. När sådana metoder blir tillgängliga ska de om möjligt beaktas för riskbedömning och efterföljande klassificering och märkning av eventuella risker.
D.
UTVÄRDERING OCH TOLKNING När tester utvärderas och tolkas ska begränsningarna för i vilken utsträckning resultaten av djurförsök och in vitro-undersökningar går att tillämpa på människor beaktas och därför får bevis för negativa effekter på människor i förekommande fall användas som bekräftelse av testresultaten.
E.
LITTERATURHÄNVISNINGAR De flesta av dessa metoder har utvecklats inom ramen för OECD:s program för riktlinjer för tester och bör utföras i enlighet med principerna för god laboratoriepraxis, i syfte att så långt möjligt säkerställa ömsesidigt godtagande av uppgifter. Ytterligare information finns i de hänvisningar som görs i OECD:s riktlinjer och relevant litteratur som publicerats på annat håll.
B.1a AKUT TOXICITET (ORALT) – METOD MED FASTA SÄRSKILJANDE DOSER
B.1a
1. METOD Denna testmetod motsvarar OECD TG 420 (2001).
1.
1.1 INLEDNING Vid traditionella metoder för bedömning av akut toxicitet används djurens död som slutpunkt. 1984 föreslog British Toxicology Society en ny metod för test avseende akut toxicitet. Den nya metoden bygger på att djuren ges en serie doser på definierade nivåer (se hänvisning 1). Då behöver djurens död inte användas som slutpunkt, eftersom metoden bygger på observationer av klara tecken på toxicitet vid någon av de definierade dosnivåerna. Efter brittiska och internationella (se hänvisning 2 respektive 3) valideringsstudier in vivo 1992 detta förfarande som en testmetod. Därefter har metodens statistiska egenskaper utvärderats med hjälp av matematiska modeller i en serie studier (se hänvisning 4, 5, och 6). Med hjälp av dessa in vivo- och modelleringsstudier har man kunnat demonstrera att metoden är reproducerbar, kräver ett mindre antal djur och orsakar mindre lidande än de traditionella metoderna, och att metoden även gör det möjligt att klassificera ämnen på ett liknande sätt som med de övriga testmetoderna för akut toxicitet. Riktlinjer för valet av den lämpligaste testmetoden för ett visst ändamål finns i vägledningen om testning av akut toxicitet oralt (se hänvisning 7). I vägledningen finns även tilläggsinformation rörande utförandet av testmetod B.1b och tolkningen av resultaten. Metoden bygger på principen om att endast skäligen toxiska doser används i huvudtestet, och att doser som förväntas vara dödliga ska undvikas. Doser som, på grund av frätande eller allvarligt irriterande verkningar, är kända att orsaka klar smärta och svårt lidande behöver inte användas. Döende djur eller djur som uppvisar klara tecken på smärta eller allvarligt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt, och vid tolkningen av testresultaten ska dessa djur beaktas på samma sätt som djur som har dött under testets gång. Kriterierna för beslut rörande avlivning av döende eller svårt lidande djur, liksom även riktlinjer för tecknen på förutsägbar eller annalkande död, behandlas i en separat vägledning (se hänvisning 8). Metoden ger information om ett ämnes farliga egenskaper och möjliggör klassificering av ämnet enligt det globala harmoniserade systemet (GHS) för klassificering av kemikalier som orsakar akut toxicitet (se hänvisning 9). Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om testämnet innan själva testningen genomförs. Sådan information inbegriper ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalkemiska egenskaper, resultaten från andra eventuella in vitro- eller in vivo-test avseende toxicitet, toxikologiska data om strukturellt närbesläktade ämnen och ämnets tilltänkta användningsändamål. Denna information behövs för att avgöra huruvida testet är relevant för skyddet av människors hälsa, och hjälper vid valet av en optimal startdos.
1.2 DEFINITIONER Akut toxicitet (oralt): De skadliga verkningar som uppträder efter oral tillförsel av en engångsdos av ett ämne eller upprepade doser som ges inom 24 timmar. Fördröjd död: Det att ett djur inte dör eller är döende inom 48 timmar, men dör senare under den 14 dagar långa observationsperioden. Dos: Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (exempelvis mg/kg). Uppenbar toxicitet: En allmän term för att beskriva klara tecken på toxicitet efter tillförsel av testämnet (exempel finns i hänvisning 3). Verkningarna är då så allvarliga att närmaste högre dos troligen leder till att största delen av djuren utsätts för svår smärta eller uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande, är döende (kriterierna anges i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 8) eller sannolikt dör. GHS: Globala harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier och blandningar. Systemet utarbetas gemensamt inom OECD (människors hälsa och miljö), FN:s expertkommitté om transport av farligt gods (fysikalkemiska egenskaper) och ILO (varningar). Samordningen sker genom det gemensamma programmet för sund kemikaliehantering (IOMC). Annalkande död: När ett djur troligen är döende eller har dött före den nästa planenliga observationstidpunkten. Hos gnagare kan tecknen på annalkande död inbegripa konvulsioner, lateral kroppsställning, halvliggande ställning och tremor (närmare uppgifter finns i vägledning om konsekvenserna för människor, se hänvisning 8). LD50 (median letal dos): En statistiskt fastställd engångsdos som kan förväntas leda till döden för 50 % av de djur som har tillförts dosen oralt. LD50-värdet uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (mg/kg). Gränsdos: En dos på den övre gränsnivån (2000 eller 5000 mg/kg). Döende djur: Ett djur som håller på att dö eller som har små chanser att överleva, även om det får behandling (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenserna för människors hälsa, se hänvisning 8). Förutsägbar död: Förekomsten av kliniska tecken som tyder på död vid en känd framtida tidpunkt som infaller före försökets planerade avslutningstidpunkt, exempelvis oförmåga att nå vatten eller föda (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenserna för människors hälsa, se hänvisning 8).
man når den dos som orsakar uppenbar toxicitet eller ett dödsfall, eller tills inga verkningar kan iakttas på den högsta dosnivån eller dödsfall inträffar på den lägsta dosnivån.
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Val av djurart Rekommenderad gnagare är råtta, även om testet kan utföras med andra gnagare. I regel används hondjur (se hänvisning 7). Detta beror på att litteraturstudier av konventionella LD50-test indikerar att känslighetsskillnaderna mellan könen är små, men att honorna i förekommande fall ofta är en aning mer känsliga (se hänvisning 10). Om däremot kunskaperna om strukturellt närbesläktade ämnens toxikologiska eller toxiko-kinetiska egenskaper tyder på att hanarna sannolikt är känsligare än honorna bör hanar användas. Om testet görs på hanar bör tillbörlig motivering ges. Djuren bör vara unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. När dostillförseln inleds ska djuret vara mellan 8 och 12 veckor gammalt, och variationerna i vikt får vara högst ± 20 % av medelvikten för alla tidigare djur som har doserats.
1.4.2 Förvarings- och utfodringsbetingelser Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22 oC (± 3 oC). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten. Djur som tillförs doser på samma nivå kan inhysas i samma bur, men antalet djur per bur får inte vara högre än att klara observationer kan göras av varje djur.
1.4.3 Förberedelse av djuren Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan identifieras individuellt Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst 5 dagar före doseringsstart.
1.4.4 Förberedelse av doserna I regel ska de olika doserna av testämnet tillföras i en konstant volym, vilket innebär att doserna har varierande koncentration. När en slutprodukt i vätskeform eller en blandning testas, kan det med tanke på riskbedömningen vara mer relevant att använda testämnet i outspädd form (konstant koncentration), vilket även förutsätts av vissa tillsynsmyndigheter. Den maximala dosvolymen för tillförsel får aldrig överskridas. Den största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle beror på testdjurets storlek. För gnagare bör denna volym i regel inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt. I fråga om vattenlösningar får dock 2 ml per 100 g kroppsvikt användas. För tillförsel av dosen rekommenderas alltid i första hand lösning, suspension eller emulsion i vatten, sedan lösning, suspension eller emulsion i olja (exempelvis majsolja) och därefter eventuella andra vehiklar. I fråga om andra vehiklar än vatten måste de toxikologiska egenskaperna vara kända. Doserna måste beredas strax före tillförseln, utom i fall där preparatets stabilitet är känd och har påvisats vara godtagbar över hela användningsperioden.
1.5 FÖRFARANDE
1.5
1.5.1 Tillförsel av doser Testämnet tillförs som en engångsdos genom sondmatning med hjälp av magsond eller lämplig intubationskanyl. I det sällsynta fallet att det inte är möjligt med en engångsdos, kan dosen tillföras i mindre delar över en period som inte överskrider 24 timmar. Före dostillförseln hålls djuren fastande (utan föda och med tillgång till vatten, för råttor över natten och för möss i 3–4 timmar). Efter fasteperioden vägs djuren och testämnet tillförs. Efter tillförsel av ämnet kan djuren hållas utan föda i ytterligare 3–4 timmar (råttor) respektive 1–2 timmar (möss). Om dosen tillförs i delar över en tidsperiod kan det vara nödvändigt att ge djuren föda och vatten, beroende på periodens längd.
1.5.2 Inledande test Avsikten med ett inledande test är att få en grund för valet av optimal startdos för huvudtestet. Testämnet tillförs enskilda djur enligt den sekvens som anges i flödesschemat i bilaga 1. Det inledande testet kan avslutas när sekvensen når fram till ett utfall om en startdos för huvudtestet (eller om ett djur dör på den lägsta angivna dosnivån). Som startdos för det inledande testet väljs en av de angivna dosnivåerna 5, 50, 300 och 2000 mg/kg. Startdosen väljs så att den troligen ger tecken på uppenbar toxicitet, och den ska i mån av möjlighet grunda sig på resultat från in vivo- och in vitro-test av samma kemikalie och strukturellt närbesläktade kemikalier. Om sådan information inte finns att tillgå, används startdosen 300 mg/kg. Det bör gå minst 24 timmar från doseringen av att djur till doseringen av följande djur. Alla djur bör observeras i minst 14 dagar. Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika tillsynskrav, får en ytterligare högre dosnivå på 5000 mg/kg användas (se bilaga 3). Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur när det gäller GHS-kategori 5 (2000–5000 mg/kg). Sådan testning får endast göras när det finns en stark sannolikhet för att resultaten har en direkt relevans för skyddet av djurs eller människors hälsa eller av miljön. I ett inledande test där ett djur dör vid den lägsta dosnivån (5 mg/kg), bör förfarandet i regel avslutas och ämnet klassificeras som tillhörande GHS-kategori 1 (se bilaga 1). Om det ändå behövs ytterligare bekräftelse av klassificeringen kan ett valfritt tilläggsförfarande genomföras. Detta går ut på att ett andra djur doseras vid nivån 5 mg/kg. Om detta andra djur dör, anses GHS-kategorin 1 vara bekräftad och testet avslutas omedelbart. Om det andra djuret överlever doseras högst tre tilläggsdjur vid nivån 5 mg/kg. Eftersom mortalitetsrisken är hög bör dessa djur av hänsyn till djurens välbefinnande doseras sekventiellt. Efter doseringen av ett djur får följande djur inte doseras förrän det är klart att det tidigare djuret sannolikt överlever. Om något av dessa djur dör ska doseringssekvensen omedelbart avslutas, och inga ytterligare djur ska doseras. Eftersom förekomsten av ett dödsfall till (oavsett hur många djur som har testats vid testets slut) leder till utfall A (två eller flera dödsfall), ska klassificeringen enligt bilaga 2 göras för dosen 5 mg/kg (kategori 1 om det förekommit två eller flera dödsfall eller kategori 2 om det inte förekommit fler än ett dödsfall). Dessutom innehåller bilaga 4 vägledning om klassificeringen enligt EU-systemet, som gäller tills det att det nya GHS-systemet har genomförts.
1.5.3 Huvudtest
1.5.3
1.5.3.1 Antalet djur och dosnivåer I flödesschemat i bilaga 2 anges de steg som bör följas efter testning vid startdosnivå. Ett av tre steg måste tas – avsluta testet och riskklassificera ämnet på grundval av utfallet, testa vid en högre dosnivå eller testa vid en lägre dosnivå. Med hänsyn till djurens välbefinnande bör dosnivåer som har orsakat dödsfall i det inledande testet inte användas i huvudtestet (se bilaga 2). Erfarenheterna tyder på att det mest sannolika utfallet vid startdosnivån är att ämnet kan klassificeras och att ingen ytterligare testning behövs. I regel används totalt fem djur av samma kön vid varje dosnivå. Dessa fem djur inbegriper det djur som i det inledande testet doserades vid den valda nivån och därutöver fyra djur (utom, i undantagsfall, om en dosnivå som används i huvudtestet inte har ingått i det inledande testet). Tidsintervallet mellan doseringen vid varje nivå bestäms av start, varaktighet och allvarlighetsgrad för de toxiska tecknen. Doseringen av djuren på följande dosnivå bör inte inledas förrän det råder säkerhet om de tidigare doserade djurens överlevnad. I förekommande fall rekommenderas ett intervall på 3–4 dagar mellan doseringen vid de olika nivåerna, så att eventuella tecken på fördröjd toxicitet kan observeras. Tidsintervallet kan anpassas på tillbörligt sätt, exempelvis i fall där responsen är tvetydig. I fall där man överväger att använda en övre dos på 5000 mg/kg bör förfarandet enligt bilaga 3 följas (se även avsnitt 1.6.2).
1.5.3.2 Gränstest (limit test) Gränstest används primärt i situationer där laboratoriet har information som tyder på att testämnet sannolikt inte är toxiskt (toxiskt endast ovanför de gränsdoser som anges i bestämmelser). Information om testämnets toxicitet kan härledas från kunskaperna om liknande testade ämnen eller liknande testade blandningar eller produkter, med hänsyn tagen till identiteten och halten av de komponenter som har känd toxikologisk signifikans. Om informationen om ämnets toxicitet är bristfällig eller saknas, eller om ämnet troligen är toxiskt, bör huvudtestet genomföras. Som gränstest för den metod som beskrivs här kan man använda ett inledande test med en startdos på 2000 mg/kg (eller undantagsvis 5000 mg/kg) som åtföljs av dosering av ytterligare fyra djur vid denna nivå.
1.6 OBSERVATIONER Efter doseringen observeras djuren individuellt minst en gång under de första 30 minuterna, periodiskt under de första 24 timmarna (med särskild uppmärksamhet under de första 4 timmarna) och därefter dagligen under totalt 14 dagar. Detta gäller inte för djur som av hänsyn till djurens välbefinnande måste avlivas skonsamt eller för djur som hittas döda. Observationsperiodens längd bör dock ha en anpassningsmån. Längden bör bestämmas enligt de toxiska reaktionerna, tidpunkten för när de sätter in och återhämtningsperiodens längd. Observationsperioden kan således förlängas om det anses vara nödvändigt. Tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om de toxiska tecknen tenderar att vara fördröjda (se hänvisning 11). Alla observationer registreras systematiskt, med individuella registreringar för varje djur. Tilläggsobservationer behövs om djuren fortsätter att uppvisa tecken på toxicitet. Observationerna bör omfatta ändringar i hud och päls, ögon och slemhinnor samt även andningsorganen, cirkulationsorganen och det autonoma och centrala nervsystemet. Likaså bör den somatomotoriska aktiviteten och beteendemönstret observeras. Uppmärksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsioner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Hänsyn bör tas till de principer och kriterier som anges i vägledningen om konsekvenserna för människor (se hänvisning 8). Djur som befinns vara döende och djur som visar tecken på svår smärta eller ihållande lidande bör avlivas skonsamt. I fall där djur avlivas av hänsyn till djurens välbefinnande eller hittas döda, bör tidpunkten för dödsfallet registreras så exakt som möjligt.
1.6
1.6.1 Kroppsvikt Djurens individuella vikter bör registreras strax innan testämnet tillförs och därefter minst en gång per vecka. Alla viktändringar bör bestämmas och registreras. Vid testets slut vägs alla överlevande djur och därefter avlivas de skonsamt.
1.6.2 Patologi Alla försöksdjur (inbegripet de som dött under testet eller som har avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande) bör obduceras. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur. Användbar information kan även fås genom mikroskopundersökning av organ som uppvisar betydande skador och som härrör från djur som överlevt minst 24 timmar efter tillförsel av startdosen.
2. DATA Data bör rapporteras individuellt per djur. Dessutom bör alla data sammanställas i tabellform. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur som använts, antalet djur som uppvisat tecken på toxicitet, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande, tidpunkterna för alla individuella dödsfall, en beskrivning av och förloppet för de toxiska verkningarna och deras reversibilitet samt obduktionsfynd.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter, enligt det som är relevant:
Testämne:
Fysikalisk natur, renhet och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (inbegripet isomerisering).
Identifieringsdata, inbegripet CAS-nummer.
Vehikel (i förekommande fall).
Motivering för val av vehikel, om annan än vatten.
Försöksdjur:
Art och stam som använts.
Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända.
Antalet djur, deras ålder och kön (och i förekommande fall en motivering för användning av hanar i stället för honor).
Ursprung, förvaringsförhållanden, foder och dylikt.
Testbetingelser:
Detaljerade uppgifter om testämnets sammansättning, inbegripet uppgifter om den tillförda dosens fysikaliska form.
Uppgifter om hur testämnet har tillförts, inbegripet dosens volym och doseringstidpunkt.
Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet diettyp/källa, vattenkälla).
Motivering för valet av startdos.
Resultat:
En tabell med responsdata och dosnivå för varje djur (djur som uppvisat tecken på toxicitet samt mortalitet, verkningarnas art, allvarlighetsgrad och varaktighet).
Tabell med kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt.
Djurens individuella vikt på doseringsdagen och därefter med en veckas intervall, samt tidpunkten för dödsfall eller avlivning.
Datum och tidpunkt för dödsfall som inträffat före den planenliga avlivningen.
Tidsförloppet för när tecken på toxicitet sätter in och huruvida tecknen är reversibla, för varje djur.
Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, i förekommande fall.
Diskussion och tolkning av resultaten.
Slutsatser.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.
HÄNVISNINGAR British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984), Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity, Human Toxicol., 3, 85–92. M. J. Van den Heuvel, A.D. Dayan och R.O. Shillaker (1987), Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity, Human Toxicol., 6, 279–291. M. J. Van den Heuvel, D.G. Clark, R.J. Fielder, P.P. Koundakjian, G.J.A. Oliver, D. Pelling, N.J. Tomlinson och A.P. Walker (1990), The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test, Fd. Chem. Toxicol., 28, 469–482. A. Whitehead och R.N. Curnow (1992), Statistical evaluation of the fixed-dose procedure, Fd. Chem.Toxicol., 30, 313–324. N. Stallard och A. Whitehead (1995), Reducing numbers in the fixed-dose procedure, Human Exptl.Toxicol., 14, 315–323. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002), Statistical evaluation of the revised fixed dose pro cedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196. OECD (2001), Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing, Environmental Health and SafetyMonograph Series on Testing and Assessment, 24, Paris. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and SafetyMonograph Series on Testing and Assesment, 19. OECD (1998), Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, s. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/ pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html). R.L. Lipnick, J.A. Cotruvo, R.N. Hill, R.D. Bruce, K.A. Stitzel, A.P. Walker, I. Chu, M. Goddard, L. Segal, J.A. Springer och R.C. Myers (1995), Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures, Fd. Chem. Toxicol., 33, 223–231. P.K Chan och A.W. Hayes (1994), Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation, Principles and Methodsof Toxicology, 3rd Edition, red. A.W. Hayes, Raven Press, Ltd. New York, USA.
B.1b AKUT TOXICITET ORALT – METOD FÖR BESTÄMNING AV AKUT TOXICITETSKLASS
B.1b
1. METOD Denna testmetod motsvarar OECD TG 423 (2001).
1.
1.1 INLEDNING Denna metod för bestämning av akut toxicitetsklass (se hänvisning 1) är ett stegvis förfarande där tre djur av samma kön används per steg. Beroende på mortaliteten och/eller förekomsten av döende djur behövs det i genomsnitt 2–4 steg för bedömningen av testämnets akuta toxicitet. Förfarandet är reproducerbart, kräver mycket få djur och ger en möjlighet att klassificera ämnen på ett liknande sätt som med de övriga metoderna för testning av akut toxicitet. Metoden för bestämning av akut toxicitetsklass baserar sig på biometriska bedömningar (se hänvisningarna 2, 3, 4 och 5) och fast definierade doser på tillräckligt separerade nivåer för att testämnet ska kunna kategoriseras för klassificering och riskbedömning. Metoden antogs 1996 och har validerats omfattande in vivo mot LD50-data som erhållits vid litteraturstudier, både nationellt (se hänvisning 6) och internationellt (se hänvisning 7). Riktlinjer för valet av den lämpligaste testmetoden för ett bestämt ändamål finns i vägledningen för testning av akut oral toxicitet (se hänvisning 8). I vägledningsdokumentet finns även tilläggsinformation rörande utförandet av testmetod B.1b och tolkningen av resultaten. Testämnesdoser som, på grund av frätande eller allvarligt irriterande verkningar, är kända att orsaka klar smärta och svårt lidande behöver inte ges. Döende djur eller djur som uppvisar klara tecken på smärta eller allvarligt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt, och vid tolkningen av testresultaten ska dessa djur beaktas på samma sätt som djur som har dött under testets gång. Kriterierna för beslut rörande avlivning av döende eller svårt lidande djur, liksom även vägledning om igenkänning av förutsägbar eller annalkande död, behandlas i en separat vägledning (se hänvisning 9). Metoden bygger på användning av fast definierade doser, och resultatet ger en möjlighet att kategorisera och klassificera ett ämne enligt det globala harmoniserade systemet (GHS) för klassificering och märkning av kemikalier som orsakar akut toxicitet (se hänvisning 10). Även om metoden i princip inte är avsedd att användas för beräkning av exakta LD50-värden ger den ändå en möjlighet att bestämma exponeringsområden där ämnets verkan sannolikt är dödlig, eftersom den viktigaste ändpunkten för detta test fortfarande är andelen djur som dör. Bestämning av ett LD50-värde med denna metod kan endast göras när minst två doser leder till en mortalitet som är högre än 0 % och lägre än 100 %. Eftersom testningen alltid utförs med fast definierade doser, oavsett vilket ämne som testas, och klassificeringen uttryckligen är bunden till antalet djur som reagerar på ett visst sätt, ökas möjligheterna till enhetliga testrapporter och repeterbarhet mellan olika laboratorier. Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om testämnet innan själva testningen genomförs. Sådan information inbegriper ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalkemiska egenskaper, resultaten från andra eventuella in vivo- eller in vitro-test avseende toxicitet, toxikologiska data om strukturellt närbesläktade ämnen och ämnets förutsedda användningsändamål. Denna information behövs för att avgöra huruvida testet är relevant för skyddet av människors hälsa, och utgör en hjälp vid valet av en optimal startdos.
1.2 DEFINITIONER Akut toxicitet (oralt): De skadliga verkningar som uppträder efter oral tillförsel av en engångsdos av ett ämne eller upprepade doser som ges inom 24 timmar. Fördröjd död: Det att ett djur inte dör eller är döende inom 48 timmar, men dör senare under den 14 dagar långa observationsperioden. Dos: Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (exempelvis mg/kg). GHS: Globala harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier och blandningar. Systemet utarbetas gemensamt inom OECD (människors hälsa och miljö), FN:s expertkommitté om transport av farligt gods (fysikalkemiska egenskaper) och ILO (varningar). Samordningen sker genom det gemensamma programmet för sund kemikaliehantering (IOMC). Annalkande död: När ett djur troligen är döende eller har dött före den nästa planenliga observationstidpunkten. Tecken som tyder på detta tillstånd kan hos gnagare inbegripa konvulsioner, kroppsställning på sidan, bakåtlutad kroppsställning och tremor (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 9). LD50 (median letal dos, oralt): En statistiskt fastställd engångsdos som troligen leder till döden för 50 % av de djur som har tillförts dosen oralt. LD50-värdet uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (mg/kg). Gränsdos: En testdos vid den övre gränsnivån (2000 eller 5000 mg/kg). Döende djur: Ett djur som håller på att dö eller som har små chanser att överleva, även om det får behandling (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 9). Förutsägbar död: Förekomsten av kliniska tecken som tyder på död vid en känd framtida tidpunkt som infaller före försökets planerade avslutningstidpunkt, exempelvis oförmåga att nå vatten eller föda (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 9).
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN Testmetoden bygger på principen om att man genom ett stegvis förfarande med ett minimalt antal djur per steg kan få tillräcklig information om testämnets akuta toxicitet för att det ska vara möjligt att klassificera ämnet. Ämnet tillförs oralt till en grupp försöksdjur vid en av de definierade dosnivåerna. Ämnet testas genom ett stegvis förfarande med tre djur av samma kön (i regel honor) per steg. Avsaknaden eller förekomsten av ämnesrelaterad mortalitet hos de djur som doserats på ett visst steg avgör vilket av följande som blir nästa steg: Testningsförfarandet beskrivs närmare i bilaga 1. När denna metod används kan testämnet genom de olika utfallen placeras i en av de toxicitetsklasser som definieras genom fasta LD50-gränsvärden.
Ingen ytterligare testning behövs.
Ytterligare tre djur tillförs en lika stor dos.
Ytterligare tre djur tillförs en dos på nästa högre eller lägre dosnivå.
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Val av djurart Rekommenderad gnagare är råtta, även om testet kan utföras med andra gnagare. I regel används hondjur (se hänvisning 9). Skälet till detta är att litteraturundersökningar av konventionella LD50-test tyder på att känslighetsskillnaderna mellan könen är små, men att honorna i förekommande fall ofta är en aning mer känsliga (se hänvisning 11). Om däremot kunskaperna om strukturellt närbesläktade ämnens toxikologiska eller toxikokinetiska egenskaper tyder på att hanarna sannolikt är känsligare än honorna bör hanar användas. Om testet görs på hanar bör tillbörlig motivering ges. Djuren bör vara unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. När dostillförseln inleds ska djuret vara mellan 8 och 12 veckor gammalt, och variationerna i vikt får vara högst ± 20 % av medelvikten för alla tidigare djur som har doserats.
1.4.2 Förvarings- och utfodringsbetingelser Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22 oC (± 3 oC). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten. Djur som tillförs doser på samma nivå kan inhysas i samma bur, men antalet djur per bur får inte vara högre än att klara observationer kan göras av varje djur.
1.4.3 Förberedelse av djuren Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan identifieras individuellt Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst 5 dagar före doseringsstart.
1.4.4 Förberedelse av doserna I regel ska de olika doserna av testämnet tillföras i en konstant volym, vilket innebär att doserna har varierande koncentration. När slutprodukter i vätskeform eller blandningar testas, kan det med tanke på riskbedömningen vara mer relevant att använda testämnet i outspädd form (konstant koncentration), vilket även förutsätts av vissa tillsynsmyndigheter. Den maximala dosvolymen för tillförsel får aldrig överskridas. Den största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle beror på testdjurets storlek. För gnagare bör denna volym i regel inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt. I fråga om vattenlösningar får dock 2 ml per 100 g kroppsvikt användas. För tillförsel av dosen rekommenderas alltid i första hand lösning, suspension eller emulsion i vatten, sedan lösning, suspension eller emulsion i olja (exempelvis majsolja) och därefter eventuella andra vehiklar. I fråga om andra vehiklar än vatten måste de toxikologiska egenskaperna vara kända. Doserna måste beredas strax före tillförseln, om inte preparatets stabilitet är känd och har påvisats vara godtagbar över hela användningsperioden.
1.5 FÖRFARANDE
1.5
1.5.1 Tillförsel av doser Testämnet tillförs som en engångsdos genom sondmatning med hjälp av magsond eller lämplig intubationskanyl. I det sällsynta fall det inte är möjligt med en engångsdos, kan dosen tillföras i mindre delar över en period som inte överskrider 24 timmar. Före dostillförseln hålls djuren fastande (utan föda och med tillgång till vatten, för råttor över natten och för möss i 3–4 timmar). Efter fasteperioden vägs djuren och testämnet tillförs. Efter tillförsel av ämnet kan djuren hållas utan föda i ytterligare 3–4 timmar (råttor) respektive 1–2 timmar (möss). Om dosen tillförs i delar över en tidsperiod kan det vara nödvändigt att ge djuren föda och vatten, beroende på tidsperiodens längd.
1.5.2 Antalet djur och dosnivåer Tre djur används per steg. För startdosen väljs en av fyra fast definierade nivåer (5, 50, 300 eller 2000 mg per kg kroppsvikt). För startdosen väljs den nivå som högst sannolikt leder till att ett antal av de doserade djuren dör. I flödesschemat i bilaga 1 beskrivs de förfaranden som gäller för de olika startdoserna. Dessutom innehåller bilaga 4 vägledning om klassificeringen enligt EU-systemet, som gäller tills det att det nya GHS-systemet har genomförts. Om den tillgängliga informationen tyder på att inga djur dör vid den högsta startdosnivån (2000 mg per kg kroppsvikt) bör ett gränstest utföras. Om det inte finns någon information tillgänglig om testämnet, rekommenderas med hänsyn till djurens välbefinnande att startdosen 300 mg per kg kroppsvikt används. Tidsintervallet mellan dostillförseln till de olika grupperna bestäms av start, varaktighet och allvarlighets-grad för de toxiska tecknen. Doseringen av djuren på nästa dosnivå bör inte inledas förrän det råder säkerhet om de tidigare doserade djurens överlevnad. Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika tillsynskrav, får en ytterligare övre dosnivå på 5000 mg per kg kroppsvikt användas (se bilaga 2). Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur när det gäller GHS-kategori 5 (2000–5000 mg per kg kroppsvikt). Sådan testning bör endast övervägas när det finns en stark sannolikhet för att resultaten har direkt relevans för skyddet av människors eller djurs hälsa eller av miljön.
1.5.3 Gränstest Gränstest används primärt i situationer där laboratoriet har information som tyder på att testämnet sannolikt inte är toxiskt (toxiskt endast ovanför de gränsdoser som anges i gällande föreskrifter). Information om testämnets toxicitet kan härledas från kunskaperna om liknande testade ämnen eller liknande testade blandningar eller produkter, med hänsyn tagen till identiteten och halten av de komponenter som har känd toxikologisk signifikans. Om informationen om ämnets toxicitet är bristfällig eller saknas, eller om ämnet troligen är toxiskt, bör huvudtestet genomföras. Ett gränstest vid en dosnivå 2000 mg per kg kroppsvikt kan utföras med sex djur (tre djur per steg). Undantagsvis kan ett gränstest på dosnivån 5000 mg per kg kroppsvikt utföras med tre djur (se bilaga 2). Om testämnet orsakar dödsfall måste eventuellt ytterligare testning utföras på närmaste lägre nivå.
1.6 OBSERVATIONER Efter doseringen observeras djuren individuellt minst en gång under de första 30 minuterna, periodiskt under de första 24 timmarna (med särskild uppmärksamhet under de första 4 timmarna) och därefter dagligen under totalt 14 dagar. Detta gäller inte för djur som av hänsyn till djurens välbefinnande måste avlivas skonsamt eller för djur som hittas döda. Observationsperiodens längd bör dock ha en anpassningsmån. Längden bör bestämmas enligt de toxiska reaktionerna, tidpunkten för när de sätter in och återhämtningsperiodens längd. Observationsperioden kan således förlängas om det anses vara nödvändigt. Tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om de toxiska tecknen tenderar att vara fördröjda (se hänvisning 12). Alla observationer registreras systematiskt, med individuella registreringar för varje djur. Tilläggsobservationer behövs om djuren fortsätter att uppvisa tecken på toxicitet. Observationerna bör omfatta förändringar i hud och päls, ögon och slemhinnor samt även andningsorganen, cirkulationsorganen och det autonoma och centrala nervsystemet. Likaså bör den somatomotoriska aktiviteten och beteendemönstret observeras. Uppmärksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsioner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Hänsyn bör tas till de principer och kriterier som anges i vägledningen om konsekvenser för människor (se hänvisning 8). Djur som befinns vara döende och djur som visar tecken på svår smärta eller ihållande lidande bör avlivas skonsamt. I fall där djur avlivas av hänsyn till djurens välbefinnande eller hittas döda, bör tidpunkten för dödsfallet registreras så exakt som möjligt.
1.6
1.6.1 Kroppsvikt Djurens vikt bör registreras individuellt strax före testämnet tillförs och därefter minst en gång per vecka. Alla viktändringar bör bestämmas och registreras. Vid testets slut vägs alla överlevande djur och avlivas därefter skonsamt.
1.6.2 Patologi Alla försöksdjur (inbegripet de som dött under testet eller som har avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande) bör obduceras. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur. Användbar information kan även fås genom mikroskopundersökning av organ som uppvisar betydande skador och som härrör från djur som överlevt minst 24 timmar efter tillförsel av startdosen.
2. DATA Data bör rapporteras individuellt per djur. Dessutom bör alla data sammanställas i tabellform. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur som använts, antalet djur som uppvisat tecken på toxicitet, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande, tidpunkterna för alla individuella dödsfall, en beskrivning av och förloppet för de toxiska verkningarna och deras reversibili-tet samt obduktionsfynd.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 Testrapport Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter, enligt det som är relevant:
Testämne:
Fysikalisk natur, renhet och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (inbegripet isomerisering).
Identifieringsdata, inbegripet CAS-nummer.
Vehikel (i förekommande fall).
Motivering för val av vehikel, om annan än vatten.
Försöksdjur:
Art och stam som använts.
Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända.
Antalet djur, deras ålder och kön (och i förekommande fall en motivering för användning av hanar i stället för honor).
Ursprung, förvaringsförhållanden, foder och dylikt.
Testbetingelser:
Detaljerade uppgifter om testämnets sammansättning, inbegripet uppgifter om den tillförda dosens fysikaliska form.
Uppgifter om hur testämnet har tillförts, inbegripet dosens volym och doseringstidpunkten.
Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet diettyp/källa, vattenkälla).
Motivering för valet av startdos.
Resultat:
En tabell med responsdata och dosnivå för varje djur (djur som uppvisat tecken på toxicitet samt mortalitet, verkningarnas natur, allvarlighetsgrad och varaktighet).
Tabell med kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt.
Djurens individuella vikt på doseringsdagen och därefter med en veckas intervall, samt tidpunkten för dödsfall eller avlivning.
Datum och tidpunkt för dödsfall som inträffat före den planenliga avlivningen.
Tidsförloppet för när tecken på toxicitet sätter in och huruvida dessa är reversibla, för varje djur.
Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, i förekommande fall.
Diskussion och tolkning av resultaten.
Slutsatser.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.
HÄNVISNINGAR Roll R., Höfer-Bosse T. and Kayser D. (1986), New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989), Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994), The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral), Arch. Toxicol. 68, 559–610. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995), The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734. Diener W. and Schlede E. (1999), Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992), A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994), The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. OECD (2001), Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19. OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environ mental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1. oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. Lipnick R.L., Cotruvo J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I., Goddard M., Segal L., Springer J.A. and Myers R.C. (1995), Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231. Chan P.K. and Hayes A.W. (1994), Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods ofToxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
B.2 AKUT TOXICITET (INANDNING)
B.2
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Det är användbart att ha förhandsupplysningar om ämnets partikelstorleksfördelning, ångtryck, smältpunkt, kokpunkt, flampunkt och eventuellt explosiva egenskaper. Se allmän inledning till del B (A).
1.2 DEFINITIONER Se allmän inledning till del B (B).
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Flera grupper av försöksdjur exponeras under en angiven period för testämnet i graderade koncentrationer, en bestämd koncentration per grupp. Därefter observeras effekter och dödsfall. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket obduceras överlevande djur. Det kan vara nödvändigt att på ett humant sätt avliva djur som uppvisar ihållande tecken på stark smärta och lidande. Undersökningar av ämnen på ett sätt som på grund av deras frätande eller irriterade egenskaper vållar avsevärd smärta och lidande behöver inte utföras.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Förberedelser I minst fem dagar före försöket ska djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas friska könsmogna djur slumpmässigt i erforderligt antal behandlingsgrupper. De behöver inte utsättas för simulerad exponering om detta inte indiceras av den typ av exponeringsapparatur som används. Det kan vara nödvändigt att mikronisera fasta testämnen för att erhålla lämplig partikelstorlek. Vid behov kan lämplig vehikel tillsättas till testämnet för att göra det lättare att uppnå en lämplig koncentration av testämnet i atmosfären. I sådana fall ska försöket omfatta en kontrollgrupp som exponeras för vehikeln. Om den vehikel eller annan additiv substans används för att underlätta dosering ska det vara påvisat att dessa inte framkallar toxiska effekter. Här kan tidigare insamlade data användas, om så bedöms vara lämpligt.
1.6.2 Testbetingelser
1.6.2
1.6.2.1 Försöksdjur Om det inte finns kontraindikationer är råttan förstahandsvalet. De vanligen nyttjade laboratoriestammarna ska användas. För både han- och honkön gäller att vikten hos djur som används i ett försök inte får avvika mer än ± 20 % från en rimlig genomsnittsvikt.
1.6.2.2 Antal och kön Minst 10 gnagare (fem honor och fem hanar) används på varje koncentrationsnivå. Honorna får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Anmärkning: Vid användning av djur som är högre upp i näringskedjan än gnagare vid tester av akut toxicitet ska man överväga användning av ett mindre antal djur. Doserna ska fastställas med omsorg och man ska anstränga sig för att inte utnyttja högre doser än moderat toxiska doser. Vid sådana undersökningar bör tillförsel av dödliga doser av testämnet undvikas.
1.6.2.3 Exponeringskoncentrationer Till försöket ska användas ett tillräckligt antal exponeringskoncentrationer, minst tre, som ska vara så valda att man får en gradering av de toxiska effekterna och av dödligheten i behandlingsgrupperna. Datauppgifterna ska vara tillräckliga för framställning av en koncentrations-/dödlighetskurva och, om möjligt, för att medge en rimlig bestämning av LC50.
1.6.2.4 Gränstest Om en exponering av fem han- och fem hondjur med 20 mg/l av en gas eller 5 mg/l av en aerosol eller ett stoft under fyra timmar (eller om detta inte är möjligt på grund av det testade ämnets fysikaliska eller kemiska, inbegripet explosiva, egenskaper, den högsta koncentration som kan uppnås) inte har produktrelaterad dödlig verkan inom 14 dagar, kan ytterligare försök anses som överflödiga.
1.6.2.5 Exponeringstid Exponeringstiden är fyra timmar.
1.6.2.6 Utrustning Djuren ska testas med inhalationsutrustning som utformats så att den upprätthåller en dynamisk luftcirkulation med minst 12 luftväxlingar per timme, för att säkerställa en tillräcklig syrehalt och en jämnt fördelad exponeringsatmosfär. Om exponeringskammare används ska den vara så utformad att trängseln bland försöksdjuren minimeras och exponeringen för testämnet genom inandning maximeras. Som en allmän regel för att säkerställa en stabi] atmosfär i en kammare, ska försöksdjurens totala volym inte överstiga 5 % av exponeringskammarens volym. Exponeringen kan göras genom kammare för mun-näsa, enbart huvudet eller hela försöksdjurets kropp; vid användning av de två första metoderna kan man minska möjligheten att testämnet upptas via andra vägar.
1.6.2.7 Observationstid Observationstiden ska vara minst 14 dagar. Observationstiden ska emellertid inte vara strikt fastställd utan ska bestämmas utifrån de toxiska reaktionerna, tidpunkten för deras uppträdande och återhämtningsperiodens längd. Den kan följaktligen förlängas när detta anses nödvändigt. Tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder respektive försvinner och tidpunkten för dödsfall är viktiga, särskilt om det finns en tendens till att sena dödsfall inträffar.
1.6.3 Förfarande Omedelbart före exponering ska djuren vägas varefter de exponeras för testkoncentrationen i den aktuella apparaturen i minst fyra timmar, efter det att jämvikt har uppnåtts för koncentrationen i kammaren. Jämvikt ska uppnås på kort tid. Temperaturen under försöket ska hållas vid 22 ± 3 oC. Under ideala betingelser ska den relativa luftfuktigheten hållas mellan 30 % och 70 %, men i vissa fall (t.ex. test med aerosoler) kan detta vara praktiskt ogenomförbart. Ett svagt undertryck i kammaren (5 mm vatten) förhindrar att testämnet läcker ut i det omgivande rummet. Under exponeringen ska djuren undanhållas foder och vatten. Ett dynamiskt respirationssystem med ett lämpligt analytiskt kontrollsystem ska användas. Ett försökstest rekommenderas för att fastställa lämpliga exponeringskoncentrationer. Systemet ska vara sådant att det så snabbt som möjligt går att säkerställa stabila exponeringsbetingelser. Lufthastigheten ska justeras för att säkerställa att betingelserna är homogena i hela exponeringskammaren. Mätning eller kontroll ska göras av: Under och efter exponering ska observationer göras och registreras systematiskt för varje enskilt djur. Den första dagen ska täta observationer göras. En grundlig klinisk undersökning ska göras minst en gång varje arbetsdag, andra observationer ska göras dagligen och lämpliga åtgärder ska vidtas för att minimera förlust av djur som ingår i studien, t.ex. ska djur som hittas döda obduceras eller nedfrysas och svaga eller döende djur ska isoleras eller avlivas. Observation ska omfatta hud- och pälsförändringar, ögon, slemhinnor, respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Särskilt uppmärksamhet ska ägnas åt observation av andningsbeteende, skälvningar, kramper, salivavsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Tidpunkten för dödsfall ska registreras så noggrant som möjligt. De enskilda djurens vikt ska bestämmas varje vecka efter exponeringen och vid dödsfall. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket ska överlevande djur obduceras, särskilt med avseende på eventuella förändringar av övre och nedre andningsvägarna. Alla makroskopiska patologiska förändringar ska registreras. Vid sådana indikationer ska vävnadsprover tas för histopatologisk undersökning.
1.6.3 a)
Lufthastighet (fortlöpande).
b)
Den faktiska koncentrationen av testämnet mätt i respirationszonen minst tre gånger under exponeringen (vissa atmosfärer, t.ex. aerosoler med höga koncentrationer, kan behöva kontrolleras oftare). Under exponeringsperioden ska koncentrationen inte avvika mer än ± 15 % från den genomsnittliga koncentrationen. En sådan kontrollnivå kan emellertid var omöjlig att uppnå vid test med stoft och vissa aerosoler, och i sådana fall kan större avvikelser accepteras. För aerosoler ska analys av partikelstorleken göras så ofta som möjligt (minst en gång per försöksgrupp).
c)
Temperatur och luftfuktighet, fortlöpande om möjligt.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp ska anges antal djur i början av försöket, tidpunkten för enskilda djurs dödsfall, antal djur som visar andra tecken på toxicitet, beskrivning av toxiska effekter och obduktionsfynd. De enskilda försöksdjurens vikt ska bestämmas och registreras om överlevnaden överstiger en dag efter exponeringen. Avlivning av djur på grund av ämnesrelaterat lidande och smärta ska registreras som ämnesrelaterade dödsfall. LC50 ska bestämmas enligt en vedertagen metod. Utvärderingen av data ska omfatta eventuellt samband mellan djurens exponering för testämnet och omfattningen och svårighetsgrad av alla abnormiteter, inklusive beteendemässiga och kliniska abnormiteter, makroskopiska lesioner, ändringar av kroppsvikt, dödlighet och eventuella andra toxikologiska effekter.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: Exponeringsdata Dessa ska ställas upp i tabellform och presenteras med medelvärden och ett spridningsmått (t.ex. standardavvikelse) och ska, om möjligt, omfatta
Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv.
Testbetingelser; beskrivning av exponeringsapparaturen inklusive utformning, typ, dimensioner, luftkälla, system för framställning av finfördelade ämnen och aerosoler, metod att konditionera luften och sätt att hålla djuren i en försökskammare när sådan används. Utrustning för mätning av temperatur, luftfuktighet och finfördelade aerosolers koncentration och storlek ska beskrivas.
3.1 a)
lufthastighet genom inhalationsutrustningen,
b)
luftens temperatur och fuktighet,
c)
nominella koncentrationer (total mängd testämne som tillförts inhalationsutrustningen, dividerat med luft volymen),
d)
typ av vehikel, om sådan används,
e)
faktiska koncentrationer i försökets respirationszon,
f)
massmedianen av den aerodynamiska diametern (MMAD) och den geometriska standardavvikelsen (GSD),
g)
jämviktsperiod,
h)
exponeringstid
Tabelluppställning av responsdata efter kön och exponeringsnivå (dvs. antal döda djur, antal djur som upp visar tecken på toxicitet, antal exponerade djur).
Dödstidpunkt under eller efter exponering, motivering och använda kriterier för human avlivning av djur.
Alla observationer.
LC50-värde för varje kön bestämt i slutet av observationsperioden (med angivande av bestämningsmetod).
95 % tillförlitlighetsintervall för LC50 (om detta är möjligt).
Dos-/dödlighetskurva och lutning (om bestämningsmetoden medger detta).
Obduktionsfynd.
Eventuella histopatologiska fynd.
Diskussion av resultaten (med särskild uppmärksamhet på om human avlivning av djur under försöket kan ha inverkat på det beräknade LD50-värdet).
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B (D).
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B (E).
B.3 AKUT TOXICITET (DERMALT)
B.3
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B (A).
1.2 DEFINITIONER Se allmän inledning till del B (B).
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Testämnet appliceras i graderade doser på huden till flera grupper av försöksdjur, en bestämd dos per grupp. Därefter observeras effekter och dödsfall. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket obduceras överlevande djur. Det kan vara nödvändigt att på ett humant sätt avliva djur som uppvisar ihållande tecken på stark smärta och lidande. Undersökningar av ämnen på ett sätt som på grund av deras frätande eller irriterade egenskaper vållar avsevärd smärta och lidande behöver inte utföras.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Förberedelser I minst fem dagar före försöket ska djuren hållas under testbetingelserna vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas friska könsmogna djur slumpmässigt i behandlingsgrupper. Ungefär 24 timmar före testet ska päls avlägsnas från djurens rygg genom klippning eller rakning. Vid klippning eller rakning ska försiktighet iakttas så att huden inte skadas, eftersom det kan ändra dess genomtränglighet. Minst 10 % av kroppsytan ska göras klar för applicering av testämnet. Vid test av fasta ämnen, som får pulvriseras om det är lämpligt, ska testämnet fuktas tillräckligt med vatten eller, vid behov med lämplig vehikel, för att säkerställa god kontakt med huden. När vehikel används ska hänsyn tas till vehikelns inverkan på testämnets penetrering av huden. Flytande testämnen används vanligen outspädda.
1.6.2 Testbetingelser
1.6.2
1.6.2.1 Försöksdjur Könsmogna råttor eller kaniner får användas. Andra arter kan användas men i så fall ska detta motiveras. De vanligen nyttjade laboratoriestammarna ska användas. För både han- och honkön gäller att vikten hos djur som används i ett försök inte får avvika mer än ± 20 % från en rimlig genomsnittsvikt.
1.6.2.2 Antal och kön Minst 5 djur ska användas på varje dosnivå. De ska alla vara av samma kön. Om hondjur används får de inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Om det finns information som visar att ett kön är väsentligt mer känsligt ska djur av detta kön användas. Anmärkning: Vid användning av djur som är högre upp i näringskedjan än gnagare vid tester av akut toxicitet ska man överväga användning av ett mindre antal djur. Doserna ska fastställas med omsorg och man ska anstränga sig för att inte utnyttja högre doser än moderat toxiska doser. Vid sådana undersökningar bör tillförsel av dödliga doser av testämnet undvikas.
1.6.2.3 Dosnivåer Till försöket ska användas ett tillräckligt antal dosnivåer, minst tre, som ska vara så valda att man får en gra-dering av de toxiska verkningarna och av dödligheten i behandlingsgrupperna. När dosnivåerna bestäms ska hänsyn tas till eventuellt irriterande eller trätande effekter. Datauppgifterna ska vara tillräckliga för framställning av en dos-/responskurva och, om möjligt, för att medge en rimlig bestämning av LD50.
1.6.2.4 Gränstest Ett gränstest med en dosnivå av minst 2000 mg/kg kroppsvikt kan utföras med en grupp av fem djur av varje kön enligt ovan beskrivna förfarande. Om ämnesrelaterade dödsfall inträffar bör en fullständig undersökning övervägas.
1.6.2.5 Observationsperiod Observationstiden ska vara minst 14 dagar. Observationstiden ska emellertid inte vara strikt fastställd utan ska bestämmas utifrån de toxiska reaktionerna, tidpunkten för deras uppträdande och återhämtningsperiodens längd. Den kan följaktligen förlängas när detta anses nödvändigt. Tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder respektive försvinner och tidpunkten för dödsfall är viktiga, särskilt om det finns en tendens till att sena dödsfall inträffar.
1.6.3 Förfarande Djuren ska hållas i var sin bur. Testämnet ska appliceras jämnt över ett område som motsvarar ungefär 10 % av den totala kroppsytan. Vid användning av kraftigt toxiska ämnen kan en mindre yta täckas, men ämnet ska appliceras på ytan i ett så tunt och jämnt lager som möjligt. Testämnen ska hållas i kontakt med huden med en porös gaskompress och icke hudirriterande tejp under en 24 timmar lång exponeringstid. Testytan ska vidare täckas på lämpligt sätt för att säkerställa att gaskompressen och testämnet hålls på plats så att djuren inte kan svälja testämnet. För att förhindra att djuren intar testämnet kan rörelsehindrande anordningar användas, men total immobilisering rekommenderas inte. I slutet av exponeringsperioden ska resterande testämne avlägsnas, i lämpliga fall med vatten eller med annan lämplig metod för rengöring av huden. Observationer ska registreras systematiskt när de görs. Varje enskilt djur ska registreras separat. Den första dagen ska täta observationer göras. En grundlig klinisk undersökning ska göras minst en gång varje arbetsdag, andra observationer ska göras dagligen och lämpliga åtgärder ska vidtas för att minimera förlust av djur som ingår i studien, t.ex. ska djur som hittas döda obduceras eller nedfrysas och svaga eller döende djur ska isoleras eller avlivas. Observation av djuren i burarna ska omfatta pälsförändringar, behandlad hud, ögon och slemhinnor, respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Särskilt uppmärksamhet ska ägnas åt observation av skälvningar, kramper, salivavsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Tidpunkten för dödsfall ska registreras så noggrant som möjligt. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket ska överlevande djur obduceras. Alla makroskopiska patologiska förändringar ska registreras. När det är indicerat ska vävnadsprov tas för histopatologisk undersökning.
1.6.3 Bedömning av toxicitet bos det motsatta könet
Sedan en undersökning av det ena könet avslutats ska minst en grupp med fem djur av det motsatta könet testas för att fastställa om djur av detta kön är avsevärt mer känsliga för testämnet. I vissa fall kan användning av färre djur vara motiverat. Om det finns tillräckligt med information om att djur av det kön som har testats är avsevärt mer känsliga, behöver djur av det motsatta könet inte testas.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp ska anges antal djur i början av försöket, tidpunkten för enskilda djurs dödsfall, antal djur som visar andra tecken på toxicitet, beskrivning av toxiska effekter och obduktionsfynd. De enskilda försöksdjurens vikt ska bestämmas och registreras omedelbart innan testämnet appliceras, därefter varje vecka och vid dödsfall. Viktförändringar ska beräknas och registreras om överlevnaden överstiger en dag efter applicering av testämnet. Avlivning av djur på ett humant sätt till följd av ämnesrelaterat lidande och smärta ska registreras som ämnesrelaterade dödsfall. LD50 ska bestämmas enligt en erkänd metod. Utvärderingen av data ska omfatta eventuellt samband mellan djurens exponering för testämnet och omfattningen och svårighetsgraden av alla abnormiteter, inklusive beteendemässiga och kliniska abnormiteter, makro-skopiska lesioner, ändringar av kroppsvikt, dödlighet och eventuella andra toxikologiska effekter.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv.
Testbetingelser (inklusive metod för hudrengöring och slag av bandage: med eller utan ocklusion).
Dosnivåer (med angivande av vehikel, om sådan används, och koncentrationer).
Försöksdjurens kön.
Tabelluppställning av responsdata efter kön och dosnivå (dvs. antal döda djur, antal djur som uppvisar tecken på toxicitet, antal exponerade djur).
Dödstidpunkt efter dosering, motivering och kriterier för human avlivning av djur.
Alla observationer.
LD50-värde för det kön som har varit föremål för en fullständig undersökning bestämt efter 14 dagar med angivande av bestämningsmetod.
95 % tillförlitlighetsintervall för LD50 (där detta är möjligt).
Dos-dödlighetskurva och lutning (om bestämningsmetoden medger detta).
Obduktionsfynd.
Eventuella histopatologiska fynd.
Resultat av försök med motsatt kön.
Diskussion av resultaten (med särskild uppmärksamhet på om human avlivning av djur under försöket kan ha inverkat på det beräknade LD50-värdet).
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B (D).
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B (E).
B.4 AKUT TOXICITET: HUDIRRITATION/HUDKORROSION
B.4
1. METOD Denna testmetod motsvarar OECD TG 404 (2002).
1.
1.1 INLEDNING Vid utarbetandet av denna uppdaterade metod lades särskilt stor vikt vid möjligheterna till bättre testningsförfaranden, där djurskyddsfrågor beaktas så väl som möjligt. Sådana förfaranden innebär att all existerande information om testämnet utvärderas i syfte att undvika onödiga djurförsök. Metoden inbegriper en rekommendation om att laboratoriet, innan det beskrivna in vivo-testet för hudkorrosion/hudirritation utförs, gör en weight-of-the-evidence-analys av existerande relevanta data. Om de data som finns att tillgå inte är tillräckliga, kan behövliga data genereras med hjälp av stegvis testning (1). Den rekommenderade testningsstrategin inbegriper validerade och godkända in vitro-test (se bilagan till denna metod). Dessutom rekommenderas att de tre testkompresserna, där det är lämpligt, appliceras på djuret i följd, i stället för samtidigt, vid det inledande in vivo-testet. Med hänsyn till sund vetenskaplig praxis och djurens välbefinnande bör in vivo-testning inte genomföras förrän alla tillgängliga data som är relevanta för ämnets förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation har utvärderats genom en weight-of-the-evidence-analys. Sådana data är belägg från gjorda undersökningar på människor och/eller försöksdjur, belägg på korrosion/irritation i fråga om ett eller flera strukturellt besläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen, data som demonstrerar att ämnet är stark surt eller alkaliskt (2), (3) samt resultat från validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-test (4), (5), (5a). Genom analysen bör man kunna minska behovet av in vivo-testning med avseende på hudkorrosion/hudirritation när det gäller ämnen för vilka det redan finns tillräckliga belägg från andra undersökningar av dessa två end points. En rekommenderad strategi för stegvis testning, som inbegriper validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-test med avseende på korrosion/irritation finns som bilaga till denna metod. Strategin utvecklades av och rekommenderades enhälligt av deltagarna i en OECD-arbetsgrupp (6). Strategin har antagits som den rekommenderade testningsstrategin i Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Sub-stances (GHS) (7). Strategin för stegvis testning ingår inte i testmetod B.4, men användning av den rekommenderas ändå innan man går in för in vivo-testning. För nya ämnen rekommenderas den som ett stegvis testningsförfarande för generering av vetenskapligt sunda data om ett ämnes förmåga att framkalla korrosion/irritation. För befintliga ämnen med otillräckliga data om hudkorrosion/hudirritation bör strategin användas för att fylla upp luckor i tillgängliga data. Om en annan testningsstrategi eller en annan procedur används, eller om man beslutar att inte använda ett stegvis testningsförfarande, bör detta motiveras. Om bestämningen av korrosivitet eller irritationsförmåga inte kan göras med hjälp av en weight-of-the-evidence-analys som står i överensstämmelse med strategin för stegvis testning, bör ett in vivo-test övervägas (se bilagan).
1.2 DEFINITIONER Hudirritation: Uppkomsten av reversibel skada på huden efter att testämnet har applicerats i upp till 4 timmar. Hudkorrosion (hudfrätning): Uppkomsten av irreversibel skada på huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter att ett testämne har applicerats i upp till fyra timmar. Frätningsreaktioner karakteriseras av sår, blödning, blodiga sårskorpor och, vid slutet av observationsperioden på 14 dagar, avfärgning genom blekning av huden, hela områden med alopeci (håravfall) och ärr. Histopatologi bör övervägas för utvärdering av skador som inte är entydiga.
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN Testämnet appliceras som en engångsdos på försöksdjurets hud. Djurets obehandlade hudområden används som referens. Graden av irritation eller korrosion granskas och poängsätts med specifierade intervall, och beskrivs närmare i syfte att få en fullständig utvärdering av verkningarna. Testet bör pågå tillräckligt länge för att ge möjlighet att utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller irreversibla. Djur som uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande eller smärta vid något skede av testningen bör avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av ämnet. Kriterier för att fatta beslut om skonsam avlivning av döende eller svårt lidande djur finns i hänvisning (8).
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Förberedelser för in vivo-test
1.4.1
1.4.1.1 Val av djurart Rekommenderat försöksdjur är albinokanin. Friska, unga vuxna exemplar bör användas. Om andra arter används bör detta motiveras.
1.4.1.2 Förberedelse av djuren Cirka 24 timmar före testet bör djurens päls avlägsnas genom kortklippning av flankens ryggsida. Varsamhet bör iakttas för att inte repa huden, och endast djur med frisk och intakt hud bör användas. Kaniner från vissa stammar har områden med speciellt tät päls, särskilt under vissa årstider. Sådana områden bör inte användas för testning.
1.4.1.3 Förvarings- och utfodringsbetingelser Djuren ska inhysas individuellt. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 20 oC (± 3 oC) för kaniner. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Konventionellt laboratoriefoder kan användas för utfodringen, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.
1.4.2 Testförfarande
1.4.2
1.4.2.1 Applicering av testämnet Testämnet appliceras på en liten yta (cirka 6 cm2) av huden och täcks med en kompress som hålls på plats med ett icke-irriterande häftförband. Om det inte är möjligt att applicera ämnet direkt (exempelvis vätskor eller vissa pastor) bör ämnet först appliceras på kompressen, som därefter placeras på huden. Kompressen ska under exponeringsperioden hållas i lös kontakt med huden med hjälp av ett lämpligt halvocklusivt förband. Om testämnet appliceras på kompressen bör denna fästas vid huden på sådant sätt att det finns god kontakt och en jämn fördelning av ämnet på huden. Man bör se till att djuret inte når kompressen, eller kan äta eller andas in ämnet. Ämnen i vätskeform används i regel outspädda. Vid testning av fasta ämnen (som vid behov kan pulverise-ras) ska ämnet vätas med minsta möjliga mängd vatten (eller vid behov någon annan lämplig vehikel), som behövs för att säkerställa god hudkontakt. Om annan vehikel än vatten används bör vehikelns potentiella inverkan på den hudirritation som testämnet framkallar vara minimal eller noll. I slutet av exponeringsperioden (som i regel varar fyra timmar) ska överskottsämne om möjligt avlägsnas med vatten eller ett lämpligt lösningsmedel, utan att störa existerande respons eller skada huden.
1.4.2.2 Dosnivå En dos på 0,5 ml vätska eller 0,5 g fast ämne eller pasta appliceras på huden.
1.4.2.3 Inledande test (test avseende hudirritation/hudkorrosion in vivo på ett enskilt djur) Det rekommenderas starkt att ett första in vivo-test görs på ett enskilt djur, särskilt om det föreligger misstanke om att ämnet kan vara korrosivt. Detta är i enlighet med strategin för stegvis testning (se bilaga 1). Om ett ämne har bedömts vara korrosivt på grundval av en weight-of-the-evidence-analys, behövs ingen ytterligare testning på djur. För de flesta ämnen som misstänks vara korrosiva, behövs i regel ingen ytterligare in vivo-testning. I fall där det på grund av otillräckliga bevis är motiverat att generera ytterligare data, kan begränsade test på djur genomföras enligt följande princip: Upp till tre testkompresser appliceras sekventiellt på djuret. Den första kompressen tas bort efter tre minuter. Om ingen allvarlig hudreaktion kan observeras, appliceras en andra kompress, som i sin tur tas bort efter en timme. Om observationerna i detta skede tyder på att exponeringen kan förlängas till fyra timmar utan lidande för testdjuret, appliceras en tredje kompress, som tas bort efter fyra timmar. Därefter kan responsen graderas. Om korrositivitet kan observeras efter någon av de tre sekventiella exponeringarna, avslutas testet omedelbart. Om ingen korrosion observeras efter att den sista kompressen har tagits bort, hålls djuret under observation i 14 dagar, utom om korrosion framkallas tidigare. I fall där testämnet inte förväntas framkalla korrosion men där det kan vara irriterande, appliceras en enstaka kompress på ett djur i fyra timmar.
1.4.2.4 Bekräftande test (in vivo-test avseende hudirritation med ytterligare djur) Om ingen korrosion observeras vid det inledande testet bör irritationsrespons eller negativ respons bekräftas med hjälp av ytterligare två djur. En kompress appliceras på vardera djuret för en exponeringsperiod på fyra timmar. Om irritation har observerats vid det inledande testet, kan bekräftelsetestet göras enligt det sekventiella förfarandet eller genom samtidig exponering på ytterligare två djur. Om inledande test i undantagsfall inte utförs, kan två eller tre djur behandlas med en enskild kompress som tas bort efter fyra timmar. Om två djur används, och samma respons observeras hos båda, behövs ingen ytterligare testning. I annat fall testas även det tredje djuret. Om den respons som observeras inte är entydig, kan det vara nödvändigt att klargöra responsen med hjälp av ytterligare djur.
1.4.2.5 Observationsperiod Observationsperioden bör vara tillräckligt lång för att man till fullo ska kunna utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller inte. Försöket bör dock avslutas omedelbart, oavsett hur länge det pågått, om ett djur uppvisar tecken på svåra smärtor eller lidande. För utvärderingen av om verkningarna är reversibla, bör djuren observeras i upp till 14 dagar efter att kompresserna har tagits bort. Om reversibilitet kan observeras innan 14 dagar har gått kan försöket omedelbart avslutas.
1.4.2.6 Kliniska observationer och gradering av hudreaktionerna Alla djur bör undersökas för tecken på erytem och ödem, och den respons som erhållits vid 60 minuter och därefter vid 24, 48 och 72 timmar efter borttagning av kompresserna registreras. Vid inledande test på ett enskilt djur undersöks applikationsstället omedelbart efter att kompressen har tagits bort. Hudreaktionerna graderas och registreras enligt klassificeringsskalan i tabellen nedan. Om djuret har fått en hudskada som vid 72 timmar inte kan identifieras som irritation eller korrosion, kan observationer behövas fram till dag 14 för att avgöra om verkningarna är reversibla. Utöver observationerna av irritation, bör alla lokala toxiska effekter, såsom avfettning av huden och alla eventuella systemiska skadliga verkningar (exempelvis kliniska tecken på toxicitet eller verkningar på kroppsvikten) till fullo beskrivas och registreras. I fall av tvetydig respons bör en histopatologisk undersökning övervägas i klargörande syfte. Graderingen av hudrespons är oundgängligen subjektiv. För att främja en harmonisering i fråga om graderingen av hudrespons och som stöd för testningslaboratorier och alla som är med om att utföra och tolka observationer, bör den personal som gör observationsarbetet få tillbörlig utbildning i det poängsättnings-system som används (se tabellen nedan). En illustrerad vägledning för gradering av hudirritation och andra hudskador kan vara till hjälp (9).
2. DATA
2.
2.1 PRESENTATION AV RESULTATEN Undersökningens resultat bör sammanställas i tabellform i den slutliga testrapporten. Resultaten bör omfatta alla aspekter som uppräknas i avsnitt 3.1.
2.2 UTVÄRDERING AV RESULTATEN Graderna av hudirritation bör bedömas med hänsyn till skadornas natur och allvarlighetsgrad samt till om skadorna är reversibla eller irreversibla. Individuella resultat av graderingen representerar ingen absolut standard för ett ämnes förmåga att framkalla irritation, eftersom även andra verkningar av testämnet utvärderas. De enskilda bedömningarna bör däremot ses som referensvärden, som bör utvärderas i kombination med alla andra observationer från undersökningen. Reversibiliteten hos hudskador bör beaktas när man utvärderar respons med avseende på irriterande egenskaper. Om verkningar av typen alopeci (begränsat område), hyperkeratos, hyperplasi och flagning håller i till slutet av den 14 dagar långa observationsperioden, bör testämnet betraktas som irriterande.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.
Motivering för in vivo-testning: weight-of-evidence-analys av tidigare existerande data, inbegripet resultat från stegvis testning enligt den rekommenderade strategin, enligt följande:
Beskrivning av relevanta data som erhållits före testningen.
Data som erhållits från de enskilda stegen enligt testningsstrategin.
Beskrivning av utförda in vitro-test, inbegripet detaljerade uppgifter om förfaranden och resultat som erhållits med test- och referensämnen.
Weight-of-the-evidence-analys för utförandet av in vivo-test.
Testämne:
Identifieringsdata (t.ex. CAS-nummer, källa, renhet, kända orenheter, satsnummer),
Fysikalisk natur och fysikalkemiska egenskaper (till exempel pH, flyktighet, löslighet, stabilitet).
För blandningar anges sammansättning och beståndsdelarnas relativa andelar (i procent).
Vehikel:
Identifieringsdata, koncentration (om tillämpligt), volym som har använts.
Motivering för valet av vehikel.
Testdjur:
Art och stam som har använts, motivering om albinokanin inte har använts.
Antalet djur per kön.
De enskilda djurens vikt vid testets start och slut.
Djurens ålder vid testets start.
Ursprung, förvarsförhållanden, foder och dylikt.
Testbetingelser:
Teknik som använts för att förbereda appliceringsstället.
Detaljerade uppgifter om de kompressmaterial som har använts och om förbandstekniken.
Detaljerade uppgifter om beredning, applicering och borttagning av testämnet.
Resultat:
En tabell med graderad irritations-/korrosionsrespons för varje djur vid alla observationspunkter.
Beskrivningar av alla observerade skador.
Beskrivande redogörelse av naturen och graden av den irritation eller korrosion som har observe rats samt eventuella histopatologiska fynd.
Beskrivning av övriga skadliga lokala (till exempel avfettning av huden) och systemiska verkningar utöver hudirritation eller hudkorrosion.
Diskussion om resultaten.
4.1.2.3.4.5.5a.6.7.8.9.
HÄNVISNINGAR Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. InVitro, 2, 19–26. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998), Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720. ECETOC (1990), Monograph No. 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483–524. Testing Method B.40 Skin Corrosion. OECD (1996), OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/ monos.htm). EPA (1990), Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. (Available from OECD Secretariat upon request.)
Tabell 1 Rodnad och sårskorpebildning Ödembildning GRADERING AV HUDREAKTIONER
Ingen rodnad … 0 Mycket svag rodnad (knappt skönjbart) … 1 Väldefinierad rodnad … 2 Moderat till svår rodnad … 3 Svår rodnad (köttrodnad) till sårskorpebildning som utgör hinder för gradering av rodnaden … 4 Maximum: 4 Inget ödem … 0 Mycket svagt ödem (knappt skönjbart) … 1 Milt ödem (området är väl avgränsat genom klar svullnad) … 2 Moderat ödem (svullnadens höjd cirka 1 mm) … 3 Svårt ödem (höjd över 1 mm och svullnaden sträcker sig utöver exponeringsområdet) … 4 Maximum: 4 I fall av tvetydig respons kan en histopatologisk undersökning utföras i klargörande syfte.
B.5 AKUT TOXICITET: ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION
B.5
1. METOD Denna testmetod motsvarar OECD TG 405 (2002).
1.
1.1 INLEDNING Vid utarbetandet av denna uppdaterade metod lades särskilt stor vikt vid möjligheterna till bättre testningsförfaranden, där djurskyddsfrågor beaktas så väl som möjligt. Sådana förfaranden innebär att all existerande information om testämnet utvärderas i syfte att undvika onödiga djurförsök. Metoden innehåller en rekommendation om att laboratoriet, innan det beskrivna in vivo-testet för akut ögonkorrosion/ögonirritation inleds, gör en weight-of-the-evidence-analys av existerande relevanta data. Om de data som finns att tillgå inte är tillräckliga, kan behövliga data genereras med hjälp av stegvis testning (2) (3). Den rekommenderade testningsstrategin inbegriper validerade och godkända in vitro-test (se bilagan till denna metod). Likaså rekommenderas, innan in vivo-ögontest övervägs, utförandet av ett in vivo-test med avseende på hudirritation/hudkorrosion i syfte att förutsäga eventuell ögonkorrosion. Med hänsyn till sund vetenskaplig praxis och djurens välbefinnande bör in vivo-testning inte övervägas förrän alla tillgängliga data som är relevanta för ämnets förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation har utvärderats genom en weight-of-the-evidence-analys. Till sådana data hör bevis från gjorda undersökningar på människor och/eller försöksdjur, bevis på förmåga att framkalla korrosion/irritation som finns hos ett eller flera strukturellt närbesläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen, data om att ämnet är starkt surt eller alkaliskt (4) (5) samt resultat från validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-test med avseende på hudkorrosion och hudirritation (6) (6a). Sådana undersökningar kan ha gjorts före, eller motiverade av, weight-of-the-evidence-analys. För vissa ämnen kan en sådan analys peka på att det behövs in vivo-testning av ämnets förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation. I alla sådana fall bör man, innan ett in vivo-ögontest övervägs, helst göra ett in vivo-test (testmetod B.4) för utvärdering av ämnets verkningar på huden (7). Med hjälp av weight-of-the-evidence-analys och strategin för stegvis testning bör man kunna minska behovet av in vivo-testning med avseende på ögonkorrosion/ögonirritation när det gäller ämnen för vilka det redan finns tillräckliga bevis från andra undersökningar. Om det inte går att fastställa ett ämnes förmåga att framkalla ögonkorrosion eller ögonirritation i enlighet med strategin för stegvis testning, inte ens efter det att man utfört en in vivo-undersökning med avseende på hudkorrosion och hudirritation, kan ett in vivo-test med avseende på ögonkorrosion och ögonirritation genomföras. En rekommenderad strategi för stegvis testning, som inbegriper validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-test med avseende på korrosion/irritation, finns som bilaga till denna metod. Strategin utvecklades av och rekommenderades enhälligt av deltagarna i en OECD-arbetsgrupp (8). Strategin har antagits som den rekommenderade testningsstrategin i Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances (GHS) (9). Denna strategi för stegvis testning ingår inte i testmetod B.4, men användning av den rekommenderas ändå innan man går in för in vivo-testning. För nya ämnen rekommenderas den som en stegvis testningsmetod för generering av vetenskapligt sunda data om ett ämnes korrosion/irritation. För befintliga ämnen med otillräckliga data om korrosion/irritation för hud och ögon bör strategin användas för att fylla upp luckor i tillgängliga data. Om en annan testningsstrategi eller ett annat förfarande används, eller om man beslutar att inte använda ett förfarande med stegvis testning, bör detta motiveras.
1.2 DEFINITIONER Ögonirritation: Ändringar som uppstår i ögat efter applicering av ett testämne på ögats främre yta och som inte är fullt reversibla inom 21 dagar från appliceringen. Ögonkorrosion (ögonfrätning): Vävnadsskador som uppstår i ögat, eller allvarlig fysisk synnedsättning, efter applicering av ett testämne på ögats främre yta, och som inte är fullt reversibla inom 21 dagar från appliceringen.
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN Testämnet appliceras som en engångsdos i försöksdjurets ena öga. Det obehandlade ögat används som referens. Graden av ögonirritation eller ögonkorrosion utvärderas genom klassificering av skadorna på konjunktiva, hornhinnan och iris med specifika intervall. Likaså bör övriga verkningar i ögat och skadliga systemiska verkningar beskrivas för att en fullständig utvärdering av verkningarna ska fås. Testet bör pågå tillräckligt länge för att ge möjlighet att utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller irreversibla. Djur som uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande eller smärta vid något skede av testningen bör avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av ämnet. Kriterier för att fatta beslut om skonsam avlivning av döende eller allvarligt lidande djur finns i hänvisning (10).
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Förberedelser för in vivo-test
1.4.1
1.4.1.1 Val av art Rekommenderat försöksdjur är albinokanin. Friska, unga vuxna exemplar bör användas. Om andra arter eller stammar används bör detta motiveras.
1.4.1.2 Förberedelse av djuren De djur som preliminärt har valts ut för testning bör undersökas med avseende på båda ögonen inom 24 timmar före testets början. Djur som har irriterade ögon, okulära defekter eller existerande skada på hornhinnan bör inte användas.
1.4.1.3 Förvarings- och utfodringsbetingelser Djuren ska inhysas individuellt. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 20 oC (±3 oC) för kaniner. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Konventionellt laboratoriefoder kan användas för utfodringen, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.
1.4.2 Testförfarande
1.4.2
1.4.2.1 Applicering av testämnet Testämnet tillförs i ena ögats konjunktivasäck (alla djur). Före tillförseln bör det undre ögonlocket varsamt dras ut en bit ut från ögongloben. Ögonlocken förs därefter samman för cirka en sekund för att förhindra att ämnet kommer ut. Det andra, obehandlade ögat används som referens.
1.4.2.2 Sköljning Försöksdjurens ögon bör inte sköljas under minst 24 efter tillförseln av testämnet, utom när det gäller fasta ämnen (se avsnitt 1.4.2.3.2) eller om det uppstår omedelbara korrosiva eller irriterande verkningar. Efter 24 timmar kan ögonen sköljas, om detta bedöms vara lämpligt. Användningen av en satellitgrupp för att undersöka inverkan av sköljningen rekommenderas inte, utom om det är vetenskapligt motiverat. Om en satellitgrupp används, ska den bestå av två kaniner. Sköljningsbetingelserna bör dokumenteras omsorgsfullt, till exempel sköljningstidpunkten, lösningens sammansättning och temperatur samt sköljningstiden, applicerad volym och sköljningsintensitet (volymström).
1.4.2.3 Dosnivå
1.4.2.3
1.4.2.3.1 Testning av vätskor Vid testning av vätskor används en dos på 0,1 ml. Pumpsprej bör inte användas för att tillföra ämnet direkt i ögat. I stället bör vätskan sprejas in i en behållare, som används för att tillföra 0,1 ml i ögat.
1.4.2.3.2 Testning av fasta ämnen Vid testning av fasta ämnen, pastor och ämnen i partikelform, bör den tillförda mängden ha en volym på 0,1 ml eller en medelvikt på högst 100 mg. Testämnet bör malas ned till fint stoft. Det fasta materialets volym bör mätas efter en varsam kompaktering, som görs till exempel genom att klappa mätbehållaren. Om ett fast testämne inte har tagis bort ur försöksdjurets öga med hjälp av fysiologiska mekanismer vid den första observationstidpunkten (en timme efter behandlingen), kan ögat sköljas med saltslösning eller destillerat vatten.
1.4.2.3.3 Testning av aerosoler Det rekommenderas att material i form av pumpsprej eller aerosol sprejas i en behållare, som sedan används för tillförsel i ögat. Det enda undantaget är aerosoler i tryckbehållare som inte går att samla in på grund av förångning. I sådana fall hålls djurets öga öppet och testämnet sprutas in i ögat under cirka en sekund, på cirka 10 cm avstånd direkt framför ögat. Avståndet kan variera beroende på behållarens tryck och innehåll. Det är viktigt att se till att ögat inte skadas av sprejtrycket. I tillämpliga fall kan det vara nödvändigt att utvärdera om sprejstyrkan kan framkalla mekanisk skada i ögat. En uppskattning av dosen från en aerosol kan göras genom en simulering på följande sätt: Ämnet sprejas på ett vägningspapper genom en öppning som har storleken av ett kaninöga och som hålls strax framför papperet. Papperets viktökning används som grund för att uppskatta den mängd som har sprejats i ögat. För flyktiga ämnen kan dosen uppskattas genom att väga en mottagningsbehållare före och efter borttagning av testämnet.
1.4.2.4 Inledande test (in vivo-test avseende ögonirritation/ögonkorrosion på ett enskilt djur) I enlighet med det som anges i strategin för stegvis testning (se bilaga 1), rekommenderas starkt att in vivo-testet först görs på ett enskilt djur. Om resultatet av ett sådant test tyder på att ämnet är korrosivt eller framkallar allvarlig irritation i ögat när man använder det beskrivna förfarandet, bör ingen ytterligare testning utföras.
1.4.2.5 Lokalbedövning Lokalbedömning kan användas beroende på fall. Om weight-of-the-evidence-analysen tyder på att ämnet kan framkalla smärta, eller om en inledande testning tyder på att en smärtsam reaktion kommer att ske, kan djuret få lokalbedövning innan testämnet tillförs. Typen, koncentrationen och dosen för lokalbedövningsmedlet bör väljas omsorgsfullt för att säkerställa att lokalbedövningen inte påverkar den reaktion som testämnet framkallar. Lokalbedövning bör även ges i det andra ögat (referensögat).
1.4.2.6 Bekräftande test (in vivo-test avseende ögonirritation med ytterligare djur) Om ingen korrosiv verkan observeras vid det inledande testet, bör responsen (irriterande eller negativ) bekräftas med hjälp av högst två ytterligare djur. Om en allvarlig irritation har observerats vid det inledande testet, vilket tyder på en eventuell stark (irreversibel) verkan vid den bekräftande testningen, rekommenderas bekräftande test som görs stegvis på ett djur i taget, i stället för samtidigt test på båda tilläggsdjuren. Om frätning eller kraftig irritation kan observeras på det tilläggsdjur som först används, bör testningen avbrytas. Om irritationsresponsen är mild till moderat behövs eventuellt även det andra tilläggsdjuret för bekräftelse.
1.4.2.7 Observationsperiod Observationsperioden bör vara tillräckligt lång för att det till fullo ska gå att utvärdera omfattningen och reversibiliteten hos de observerade verkningarna. Försöket bör dock avslutas omedelbart, oavsett hur länge det pågått, om det berörda djuret uppvisar tecken på svåra smärtor eller lidande (9). För fastställandet av verkningarnas reversibilitet bör djuren i regel observeras i 21 dagar efter tillförsel av testämnet. Om reversibilitet kan observeras innan 21 dagar har gått kan försöket omedelbart avslutas.
1.4.2.7
1.4.2.7.1 Kliniska observationer och gradering av ögonreaktionerna Ögonen bör undersökas 1, 24, 48 och 72 timmar efter tillförsel av testämnet. Djuren bör inte utsättas för testning längre än det är nödvändigt för att få definitiv information. Djur som uppvisar allvarliga och ihållande tecken på smärta eller lidande bör omedelbart avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av ämnet. Djur som fått följande ögonskador efter tillförsel av ämnet bör avlivas på ett skonsamt sätt: perforering eller signifikant ulceration av kornea inklusive stafylom, blod i främre ögonkammaren, korneaopacitet av grad 4 som varar i 48 timmar; ingen ljusreaktion (irisreaktion av grad 2) som varar i 72 timmar, ulceration av konjuktivamembran, nekros i konjunktiva- eller blinkhinna eller bildning av sårskorpa. Skälet till avlivningen är att dessa skador i regel är irreversibla. Djur som inte utvecklar okulära skador ska inte avlivas förrän det har gått tre dagar från tillförsel av ämnet. Djur med milda till moderata skador bör observeras tills skadorna läks, eller under 21 dagar. Efter det avslutas undersökningen. Observationer bör göras på dag 7, 14 och 21 i syfte att fastställa skadornas status och huruvida de är reversibla eller inte. Graderna av okulär reaktion (konjunktiva, kornea och iris) bör registreras vid varje undersökning (se tabell 1). Likaså bör alla andra ögonskador (till exempel pannus, missfärgning) eller skadliga systemiska verkningar även rapporteras. Som hjälpmedel vid undersökningen av reaktionerna kan användas en binokulärlupp, ficklampa, biomikroskop eller annan lämplig utrustning. Efter det att observationerna har registrerats vid 24 timmar efter tillförseln, kan ögonen undersökas ytterligare med hjälp av fluorescein. Graderingen av okulär respons är oundgängligen subjektiv. För att främja en tillnärmning av graderingen av okulär respons, och som stöd för testningslaboratorier och alla som är med om att utföra och tolka observationer, bör den personal som gör observationsarbetet få tillbörlig utbildning om klassificeringssystemet. Graderingen av okulär respons bör göras i blindo.
2. DATA
2.
2.2 UTVÄRDERING AV RESULTATEN Klassificeringen av okulär respons bör göras med hänsyn till skadornas natur och allvarlighetsgrad samt deras reversibilitet eller irreversibilitet. Individuella klassificeringsresultat representerar ingen absolut standard för ett ämnes förmåga att framkalla irritation, eftersom även andra verkningar av testämnet utvärderas. Enskilda klassificeringsresultat bör i stället ses som referensvärden, och de är meningsfulla endast när de åtföljs av en fullständig beskrivning och utvärdering av alla observationer.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.
Motivering för in vivo-testning: weight-of-evidence-analys av tidigare existerande data, inbegripet resultat från ett förfarande enligt strategin för stegvis testning, enligt följande:
Beskrivning av relevanta data som erhållits före testningen.
Data som erhållits vid de olika stegen enligt testningsstrategin.
Beskrivning av utförda in vitro-test, inbegripet detaljerade uppgifter om förfaranden och resultat som erhållits med test- och referensämnen.
Beskrivning av utförda in vivo-test med avseende på hudirritation/hudkorrosion, inbegripet de resultat som erhållits.
Weight-of-the-evidence-analys för utförandet av in vivo-test.
Testämne:
Identifieringsdata (till exempel CAS-nummer, källa, renhet, kända orenheter, satsnummer).
Fysikalisk natur och fysikalkemiska egenskaper (till exempel pH, flyktighet, löslighet, stabilitet, reaktivitet med vatten).
För blandningar anges sammansättning och beståndsdelarnas relativa andelar (i procent).
Om lokalbedövning används, anges identifieringsdata, renhet, typ, dos och potentiell växelverkan med testämnet.
Vehikel:
Identifieringsdata, koncentration (om tillämpligt), volym som har använts.
Motivering för valet av vehikel.
Testdjur:
Art och stam som har använts, motivering om albinokanin inte har använts.
Djurens ålder, enskilt för varje djur vid testets start.
Antalet djur per kön i test- och kontrollgrupperna (vid behov).
De enskilda djurens vikt vid testets start och slut.
Ursprung, förvaringsbetingelser, foder och dylikt.
Resultat:
Beskrivning av den metod som har använts för att klassificera irritationen vid varje observationstidpunkt (till exempel ficklampa, biomikroskop, fluorescein),
En sammanställning i tabellform av responsdata rörande irritation/korrosion för varje djur vid varje observationstidpunkt fram till dess att testningen avslutas för det djurets del.
Narrativ beskrivning av graden och naturen hos den irritation eller korrosion som har observerats.
Beskrivning av alla andra eventuella ögonskador som har observerats (till exempel vaskularisering, pannusbildning, adhesioner, missfärgning).
Beskrivning av icke-okulära lokala och systemiska skadliga verkningar och, i förekommande fall, histopatologiska fynd.
Diskussion om resultaten.
3.2 TOLKNING AV RESULTATEN En extrapolering av resultaten från undersökningar av ögonirritation som gjorts på försöksdjur är valid endast till en begränsad utsträckning. I många fall är albinokaniner mycket känsligare än människor i fråga om ämnen som är irriterande eller korrosiva för ögat. Särskild noggrannhet bör iakttas vid tolkning av resultaten i syfte att utesluta irritation som beror på en sekundär infektion.
4.1.2.3.4.5.6.(6a)(7)(8)(9)(10)
HÄNVISNINGAR Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159–164. Worth, A.P. och Fentem, J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. och Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524. Testmetod B.40 Hudkorrosion. Testmetod B.4. Akut toxicitet: hudirriation/hudkorrosion. OECD (1996), OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, Solna, Sverige, den 22–24 januari 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, november 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
Tabell 1 GRADERING AV OKULÄRA SKADOR
Hornhinna (kornea)
Opacitet: graden av densitet (avläsningarna bör göras på området med den högsta densiteten) Ingen ulceration eller opacitet … 0 Spridda eller diffusa områden med opacitet (annan än svag avmattning av den normala lystern), iris alla detaljer är klart synliga … 1 Enkelt skönjbart translucent område, detaljerna i iris är lätt förmörkade … 2 Pärlemorliknande område, inga detaljer i iris synliga, pupillens storlek kan knappt skönjas … 3 Opak hornhinna, iris kan inte skönjas genom opaciteten … 4 Maximum: 4 ANMÄRKNINGAR NOTER
Iris
Normal … 0 Märkbart fördjupade rugae, blodstockning, svullnad, moderate hyperemi kring kornea eller injektion; iris reagerar för ljus (en långsam reaktion bedöms som en verkning) … 1 Blödning, kraftig destruktion eller ingen reaktion för ljus … 2 Maximum: 2
Konjunktiva
Rodnad (hänför sig till palpebral och bulbär konjunktiva, exklusive hornhinnan och iris) Normal … 0 Vissa blodkärl är hyperemiska (injekterade) … 1 Diffus, blodröd färg; individuella blodkärl kan inte skönjas med lätthet … 2 Diffust köttröd … 3 Maximum: 3
Chemos
Svullnad (hänför sig till ögonlocken och/eller blinkhinnor) Normalt … 0 En viss svullnad över det normala … 1 Klar svullnad, delvis eversion av ögonlocken … 2 Svullnad, ögonlocken ungefär halvstängda … 3 Svullnad, ögonlocken mer än halvstängda … 4 Maximum: 4
B.6 HUDSENSIBILISERING
B.6
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Kommentarer: Testers noggrannhet och förmåga att spåra sådana ämnen som kan orsaka hudallergi hos människan anses betydelsefulla i ett klassificeringssystem för toxicitet som avser folkhälsan. Det finns ingen enstaka testmetod som på ett lämpligt sätt kan identifiera samtliga de ämnen som kan vara sensibiliserande och som är relevant för alla ämnen. Faktorer som ett ämnes fysikaliska egenskaper, inbegripet dess förmåga att penetrera huden, ska beaktas vid valet av test. Två typer av test på marsvin har utvecklats: Ett test av adjuvanstyp i vilket man åstadkommer ett allergiskt tillstånd genom att upplösa eller suspendera (blanda) testsubstansen i Freunds Complete Adjuvant (FCA), och test av icke-adjuvanstyp. Adjuvanstester är sannolikt mer precisa vad gäller att förutsäga ämnets eventuella kapacitet att orsaka hudsensibilisering hos människan än metoder där inte Freunds Complete Adjuvant används och de är därför att föredra. Maximeringstest på marsvin (GPMT) används ofta som adjuvanstest. Trots att flera andra metoder kan användas för att upptäcka ett ämnes potentiella förmåga att orsaka hudsensibilisering anses maximeringsförsöket på marsvin vara den bästa metoden. Icke-adjuvanstester (av vilka Buehler-testet föredras) med många kemiska klasser anses mindre känsliga. I vissa fall anses det finnas goda skäl att välja Buehler-testet, som innebär lokal applicering i stället för den intradermala injektion som används i GPMT. Då Buehler-testet används ska detta vara vetenskapligt välmotiverat. Här beskrivs GPMT och Buehler-testet. Andra metoder får användas, förutsatt att de är väldokumenterade och vetenskapligt motiverade. Om en erkänd kontrollundersökning ger positiva resultat, kan testämnet betecknas som potentiellt sensibiliserande, och det behöver inte vara nödvändigt att genomföra ytterligare test på marsvin. Om en sådan kontrollundersökning dock ger negativt resultat ska ett test på marsvin genomföras enligt det förfarande som beskrivs i denna testmetod. Se även Allmän inledning, del B.
1.2 DEFINITIONER Hudsensibilisering (allergisk kontaktdermatit): En immunologiskt utlöst kutan reaktion på ett ämne. Hos människan kan reaktionerna kännetecknas av klåda, hudrodnad, ödem, blemmor och blåsor eller en kombination av dessa. Andra arter kan reagera annorlunda så att endast hudrodnad och ödem observeras. Induktionsexponering: En försöksexponering av ett försöksobjekt för en testsubstans i syfte att inducera hypersensibilitet. Induktionsperiod: En period på minst en vecka som följer efter induktionsexponering då hypersensibilitet kan utvecklas. Provokationsexponering: En försöksexponering av ett tidigare behandlat objekt för att testa ämnet efter en induktionsperiod i syfte att bestämma om objektet reagerar med hypersensibilitet.
1.3 REFERENSÄMNEN Den tillämpade försöksmetodens noggrannhet och tillförlitlighet bör utvärderas var sjätte månad genom användning av ämnen som är kända för att ha milda till moderata hudsensibiliseringsegenskaper. I ett korrekt utfört test bör en reaktion på minst 30 % i adjuvanstest och minst 15 % i icke-adjuvanstest förväntas för milda/moderata sensibiliserande ämnen. Följande ämnen är att föredra: CAS-nummer EINECS-nummer EINECS-namn Vanliga namn 101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldehyd α-hexylcinnamaldehyd 149-30-4 205-736-8 benzotiasol-2-tiol (merkapto benzotiasol) kaptax 94-09-7 202-303-5 benzokain norkain Då det är motiverat på grund av vissa omständigheter får andra kontrollämnen som uppfyller ovan angivna kriterier användas.
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN Försöksdjuren exponeras inledningsvis för testsubstansen genom intradermala injektioner och/eller epidermal applicering (induktionsexponering). Efter en paus på 10–14 dagar (induktionsperiod) under vilken en immunreaktion kan utvecklas exponeras djuren för en provokationsdos. Omfattningen och graden av hudens reaktion på provokationsexponeringen hos försöksdjuren jämförs med den som uppträder hos kontrollgruppens djur som under induktionsexponeringen får skenbehandling och därefter utsätts för provokationsexponering.
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODERNA Om det anses nödvändigt att avlägsna testsubstansen görs det med vatten eller en lämplig lösning utan att befintlig reaktion eller hudens tillstånd ändras.
1.5
1.5.1 Maximeringstest på marsvin (GPMT)
1.5.1
1.5.1.1 Förberedelser Friska unga vuxna albinomarsvin acklimatiseras till laboratoriemiljö under minst fem dagar före försöket. Före försöket väljs djuren ut slumpvis och fördelas i behandlingsgrupper. Pälsen avlägsnas genom klippning, rakning eller eventuellt kemiskt, beroende på vilken testmetod som används. Försiktighet ska iakttas för att inte skada huden. Djuren vägs innan försöket påbörjas och då det avslutas.
1.5.1.2 Försöksförhållanden
1.5.1.2
1.5.1.2.1 Försöksdjur Vanliga stammar av albinomarsvin används.
1.5.1.2.2 Antal och kön Hannar och/eller honor kan användas. Om honor används ska de inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. Minst 10 djur används i behandlingsgruppen och minst 5 djur i kontrollgruppen. Om färre än 20 testdjur och 10 kontrolldjur har använts och det inte är möjligt att konstatera att testsubstansen är hudsensibiliserande, rekommenderas starkt tester med ytterligare djur upp till totalt 20 testdjur och 10 kontrolldjur.
1.5.1.2.3 Dosnivåer Den testsubstanskoncentration som används vid varje induktionsexponering ska tolereras väl av hela organismen och vara den högsta nivå som orsakar mild till måttlig hudirritation. Den koncentration som används vid provokationsexponering ska vara den högsta icke-irriterande dosen. Om nödvändigt, kan de lämpliga koncentrationerna fastställas med hjälp av en pilotundersökning med två eller tre djur. För detta ändamål bör användningen av FCA-behandlade djur beaktas.
1.5.1.3 Förfarande
1.5.1.3
1.5.1.3.1 Induktion Dag 0-behandlingsgrupp Tre par intradermala injektioner på 0,1 ml ges i skuldertrakten, där pälsen avlägsnats, så att varje par injektioner görs på var sida om mittlinjen. Injektion l: en 1:1-blandning (viktprocent) FCA/vatten eller fysiologisk saltlösning. Injektion 2: Testsubstansen i lämplig vehikel i vald koncentration. Injektion 3: Testsubstansen i vald koncentration i en 1:1-blandning (viktprocent) FCA/vatten eller fysiologisk saltlösning. I injektion 3 löses de vattenlösliga ämnena i vattenfasen innan de blandas med FCA. Fettlösliga eller olösliga ämnen suspenderas (blandas) i FCA innan de blandas med vattenfasen. Testsubstansens slutliga koncentration ska vara densamma som den i injektion 2. Injektionerna 1 och 2 ges med ett kort intervall och närmast huvudet medan injektion 3 ges i testområdets nedersta del. Dag 0-kontrollgrupp Tre par intradermala injektioner på 0,1 ml ges i samma område som på djuren i behandlingsgruppen. Injektion l: en 1:1-blandning (viktprocent) FCA/vatten eller fysiologisk saltlösning. Injektion 2: Outspädd vehikel. Injektion 3: En 50 % blandning av vehikeln i en 1:1-blandning (viktprocent) FCA/vatten eller fysiologisk saltlösning. Dag 5–7-behandlings- och kontrollgrupp Om ämnet inte är hudirriterande behandlas testområdet, efter klippning eller rakning, ungefär 24 timmar före lokal applicering med 0,5 ml 10 % natriumlaurylsulfat i vaselin i syfte att orsaka lokal irritation. Dag 6–8-behandlingsgrupp Pälsen avlägsnas på nytt från testområdet. Testsubstansen i lämplig vehikel fördelas på ett filterpapper (2 × 4 cm), appliceras på testområdet och hålls i kontakt med huden genom täckande förband under 48 timmar. Valet av vehikel ska vara välmotiverat. Fasta ämnen pulveriseras och införlivas i en lämplig vehikel. Vätskor kan om det är lämpligt appliceras outspädda. Dag 6–8-kontrollgrupp Pälsen avlägsnas på nytt från testområdet. Vehikeln appliceras på liknande sätt på testområdet och hålls i kontakt med huden genom täckande förband under 48 timmar.
1.5.1.3.2 Provokation Dag 20–22-behandlings- och kontrollgrupp Pälsen avlägsnas frän behandlings- och kontrolldjurens flanker. En kompress eller kammare innehållande testsubstansen appliceras på djurens ena flank och, om relevant, en kompress eller kammare innehållande enbart vehikel på den andra flanken. Kompresserna hålls i kontakt med huden genom täckande förband under 24 timmar.
1.5.1.3.3 Observation och gradering: Behandlings- och kontrollgrupp Blindläsning av test- och kontrolldjur rekommenderas. Om det är nödvändigt för att klargöra resultaten från den första provokationen bör en andra provokation (dvs. en omprovokation) övervägas en vecka efter den första, i tillämpliga fall med en ny kontrollgrupp. En omprovokation får också göras på den ursprungliga kontrollgruppen. Alla hudreaktioner och ovanliga resultat, inbegripet systematiska reaktioner, som orsakas av induktions- och provokationsförfarandena bör observeras och noteras i enlighet med graderingsskalan enligt Magnusson/Kligman (se tillägget), övriga förfaranden t.ex. histopatologisk undersökning eller mätning av hudvecks tjocklek, bör utföras för att klargöra tveksamma reaktioner.
Cirka 21 timmar efter det att kompressen avlägsnats rengörs det provocerade området och klipps eller rakas och vid behov avlägsnas pälsen med hårborttagningsmedel.
Cirka tre timmar senare (ungefär 48 timmar från det att provokationsexponeringen påbörjats) observeras hudreaktionen och noteras i enlighet med graderingen i tillägget.
Cirka 24 timmar efter föregående observation görs en andra observation (72 timmar) och resultaten noteras.
1.5.2 Buehler-test
1.5.2
1.5.2.1 Förberedelser Friska unga vuxna albinomarsvins acklimatiseras till laboratoriemiljön under minst fem dagar före försöket. Före försöket väljs djuren ut slumpvis och fördelas i behandlingsgrupper. Pälsen avlägsnas genom klippning, rakning eller eventuellt kemiskt, beroende på den testmetod som används. Försiktighet ska iakttas för att inte skada huden. Djuren vägs innan försöket påbörjas och då det avslutas.
1.5.2.2 Försöksförhållanden
1.5.2.2
1.5.2.2.1 Försöksdjur Vanliga laboratoriestammar av albinomarsvin används.
1.5.2.2.2 Antal och kön Hannar och/eller honor kan användas. Om honor används ska de inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. Minst 20 djur används i behandlingsgruppen och minst 10 djur i kontrollgruppen.
1.5.2.2.3 Dosnivåer Testsubstansens koncentration anpassas till den högsta nivå som djuren har tolererat väl i varje induktionsstadium och ska vara den högsta nivå som orsakar mild till uthärdlig hudirritation. Den koncentration som används vid provokationsexponering ska vara den högsta icke-irriterade dosen. Om nödvändigt, kan de lämpliga koncentrationerna fastställas med hjälp av en pilotundersökning med två eller tre djur. I fråga om vattenlösliga testmaterial är det lämpligt att använda vatten eller en icke-irriterande lösning av anjon-ytaktiva ämnen som vehikel. I fråga om övriga testmaterial är 80 % etanol/vatten att föredra för induktion och aceton för provokation.
1.5.2.3 Förfarande
1.5.2.3
1.5.2.3.1 Induktion Dag 0-behandlingsgrupp Pälsen avlägsnas från ena flanken (klipps). Testkompressystemet dränks in med testsubstansen i lämplig vehikel (valet av vehikel ska vara välmotiverat; om lämpligt får testsubstanser i vätskeform appliceras outspädda). Testkompressystemet appliceras på testområdet och hålls i kontakt med huden med ocklusivkompress eller -kammare och lämpligt förband under sex timmar. Testkompressystemet ska vara ocklusivt. En bomullskompress är lämplig och kan vara fyrkantig eller rund och cirka 4–6 cm2. Fasthållning medelst lämpligt förband är lämpligt för att säkerställa ocklusion. Om omslag används kan ytterligare exponering krävas. Dag 0-kontrollgrupp Pälsen avlägsnas från ena flanken (klipps). Endast vehikeln appliceras på liknande sätt som för behandlingsgruppen. Testkompressystemet hålls i kontakt med huden genom ocklusivkompress eller -kammare och lämpligt förband under sex timmar. Om det kan visas att en simulerad kontrollgrupp inte krävs kan en oexponerad kontrollgrupp användas. Dag 6–8- och 13–15-behandlings- och kontrollgrupp Samma applicering som dag 0 utförs på samma testområde (vid behov efter avlägsnande av päls) på samma flank dag 6–8 och åter dag 13–15.
1.5.2.3.2 Provokation Dag 27–29- behandlings- och kontrollgrupp Pälsen avlägsnas från den obehandlade flanken på behandlings- och kontrolldjuren (klippning). En ocklusivkompress eller -kammare innehållande lämplig mängd testsubstans appliceras vid maximal icke-irriterande koncentration, på den bakre obehandlade flanken på behandlings- och kontrolldjuren. I relevanta fall appliceras också en ocklusivkompress eller -kammare på den främre obehandlade flanken på både behandlings- och kontrolldjur. Kompresserna eller kamrarna hålls i kontakt med huden genom lämpligt förband under sex timmar.
1.5.2.3.3 Observation och gradering Blindläsning av test och kontrolldjur rekommenderas. Om det är nödvändigt för att klargöra resultaten från den första provokationen bör en andra provokation (dvs. en förnyad provokation) övervägas en vecka efter den första, i tillämpliga fall med en ny kontrollgrupp. En förnyad provokation får också göras på den ursprungliga kontrollgruppen. Alla hudreaktioner och ovanliga resultat, inbegripet systemiska reaktioner, som följer av induktions- och provokationsförfarandena bör observeras och noteras i enlighet med graderingsskalan enligt Magnusson/Kligman (se tillägget), övriga förfaranden, t.ex. histopatologisk undersökning eller mätning av hudvecks tjocklek, får utföras för att klargöra tveksamma reaktioner.
Cirka 21 timmar efter det att kompressen tagits bort avlägsnas pälsen från provokationsområdet.
Cirka tre timmar senare (ungefär 30 timmar efter det att provokationskompressen applicerades) observeras hudreaktionerna och noteras i enlighet med graderingen i tillägget.
Cirka 24 timmar efter 30-timmarsobservationen (ungefär 54 timmar efter det att provokationskompressen applicerades) observeras hudreaktionerna på nytt och noteras.
2. DATA (GPMT och Buehler-test) Uppgifterna bör sammanfattas i tabellform som i fråga om varje djur visar hudreaktioner vid varje observation.
3. RAPPORTERING (GPMT och Buehler-test) Om ett screeningsförsök utförs före marsvinsförsöket ska en beskrivning av eller hänvisning till försöket (t.ex. Local Lymph Node Essay (LLNA), Mouse Ear Swelling Test (MEST), inbegripet uppgifter om förfarandet, lämnas tillsammans med de resultat som erhållits genom försöket och referensämnena.
3. Försöksrapport (GPMT och Buehler-test)
Försöksrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Försöksdjur:
Art/stam för använda marsvin.
Djurens antal, ålder och kön.
Härkomst, miljöbetingelser, foder etc.
Djurens individuella vikt vid försökets inledning.
Försöksförhållanden:
Metod för förberedelse av kompressområde.
Uppgift om använt kompressmaterial och kompressmetod.
Resultat av förundersökning med slutsatser om de induktions- och provokationskoncentrationer som ska användas i försöket.
Uppgift om förberedelse av testsubstans, applicering och borttagning.
Motivering för val av vehikel.
Vehikel- och testsubstanskoncentrationer som används vid induktions- och provokationsexponering och den totala mängd ämne som appliceras vid induktion och provokation.
Resultat:
En sammanfattning av resultaten av den senaste kontrollen av känslighet och tillförlitlighet (se 1.3), inbegripet uppgift om ämne, koncentration och använd vehikel.
Resultatet för varje djur inklusive graderingssystem.
Redogörelse för arten och graden av observerade effekter.
Eventuella histopatologiska resultat.
Diskussion om resultaten.
Slutsatser.
4. HÄNVISNINGAR Denna metod motsvarar OECD TG 406.
B.7 28 DAGARS STUDIE AV TOXICITET MED UPPREPAD ORAL DOSERING
B.7
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se Allmän inledning, del B.
1.2 DEFINITIONER Se Allmän inledning, del B.
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN Testsubstansen tillförs dagligen oralt i gradvist ökande doser till flera grupper försöksdjur, en dosnivå per grupp, under 28 dagar. Under doseringsperioden observeras djuren noggrant varje dag efter tecken på toxicitet. Djur som dör eller avlivas under försöket obduceras och vid försökets slut avlivas de överlevande djuren och obduceras. Denna metod lägger större vikt vid de neurologiska effekterna som särskild sluteffekt samt behovet av noggranna kliniska observationer av djuren i syfte att erhålla mesta möjliga information. Metoden ska identifiera kemikalier med eventuell neurotoxisk verkan vilket kan motivera mer ingående undersökningar av den aspekten. Därutöver kan metoden ge indikationer på immunologiska och reproduktionstoxiska effekter.
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Förberedelser Friska unga vuxna djur väljs slumpvis ut till kontroll- och dosgrupperna. Burarna bör ordnas så att eventuella effekter på grund av deras placering minimeras. Djuren identifieras individuellt och hålls i sina burar minst fem dagar innan försöket påbörjas för att de ska acklimatisera sig till laboratoriemiljön. Testsubstansen tillförs via sondmatning, foder eller vatten. Den metod som väljs för oral tillförsel beror på syftet med studien och ämnets fysikaliskt–kemiska egenskaper. Testsubstansen löses vid behov i lämplig vehikel. Om möjligt bör i första hand vattenlösning eller vattensuspension övervägas, följt av oljelösning eller oljeemulsion (t.ex. majsolja) samt därefter andra vehiklar. I fråga om andra vehiklar än vatten ska vehikelns toxiska egenskaper vara kända. Testsubstansens stabilitet i vehikeln bör fastställas.
1.4.2 Försöksförhållanden
1.4.2
1.4.2.1 Försöksdjur Helst ska råttor användas även om andra gnagare kan användas. Vanligen använda laboratoriestammar av unga friska vuxna djur bör användas. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. Doseringen bör inledas snarast möjligt efter avvänjningen och under alla förhållanden innan djuren är nio veckor gamla. Då undersökningen påbörjas bör variationen i vikt mellan de använda djuren vara minimal och inte överstiga ± 20 % av vardera könets genomsnittsvikt. Om upprepad oralstudie utförs som inledning till en långtidsstudie ska helst djur från samma stam och med samma ursprung användas i båda försöken.
1.4.2.2 Antal och kön Minst 10 djur (fem honor och fem hannar) bör användas för varje dosnivå. Om avlivningar är inplanerade under försökets gång bör antalet djur ökas med det antal som avlivas innan försöket slutförts. Därutöver bör en satellitgrupp på 10 djur (fem av vardera könet) behandlas med den höga dosnivån under 28 dagar och observeras angående reversibla eller kvarstående effekter eller fördröjt uppträdande av toxiska effekter under 14 dagar efter det att försöket avslutats. En satellitgrupp på 10 kontrolldjur (fem av vardera könet) ska också användas.
1.4.2.3 Dosnivåer I allmänhet bör minst tre dosgrupper och en kontrollgrupp användas. Med undantag för behandling med testsubstansen bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som djuren i dosgrupperna. Om en vehikel används vid tillförsel av testsubstansen bör kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största dos som används. Om det, efter utvärdering av andra uppgifter, inte förväntas några effekter vid en dos på 1000 mg/kg kroppsvikt får ett limit-test utföras. Om det inte finns tillgång till relevant underlag får en pilotstudie genomföras till hjälp för att bestämma doser som ska användas. Dosnivåerna bör väljas med hänsyn till eventuellt befintliga toxicitets- och toxikokinetiska uppgifter som finns tillgängliga för testsubstansen eller närbesläktade ämnen. Den högsta dosnivån bör väljas i syfte att inducera toxiska effekter utan att orsaka dödsfall eller allvarligt lidande. Därefter bör dosnivåerna väljas i fallande skala för att påvisa en dosrelaterad reaktion samt vid den lägsta dosnivån inga påvisbara skadliga effekter (NOAEL. – no-observed-adverse effects). Två- till fyrdubbla dosintervall är ofta optimala för att fastställa de fallande dosnivåerna; tillägg av en fjärde testgrupp är att föredra framför användning av mycket breda intervall (t.ex. över faktor 10) mellan dosnivåerna. För substanser som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att försäkra sig om att de kvantiteter av testsubstansen som används inte stör det normala näringsupptaget eller den normala vattenbalansen. När testsubstansen tillförs via fodret kan man använda antingen en konstant koncentration (ppm) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt. Det använda alternativet ska anges. För ett ämne som tillförs genom sondmatning ska dosen ges vid samma tid varje dag och vid behov justeras för att hålla en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt. Om försök med upprepad oral dosering används som förstudie till en långtidsstudie ska samma foder användas i båda försöken.
1.4.2.4 Limit-test Om ett försök med en dosnivå om minst 1000 mg per kg kroppsvikt och dag eller, vid tillförsel i föda eller dricksvatten, en motsvarande andel i födan eller dricksvattnet (baserad på fastställd kroppsvikt) och med användning av det tillvägagångssätt som beskrivits för denna studie, inte ger några observerbara toxiska effekter och om toxicitet inte förväntas på grundval av uppgifter från strukturellt närbesläktade ämnen, kan en fullständig undersökning med tre dosnivåer anses överflödig. Ett limit-test används utom när exponering på människor visar att en högre dosnivå behövs.
1.4.2.5 Observationsperiod Observationsperioden bör vara 28 dagar. Djur i en satellitgrupp avsedd för fortsatta observationer bör hållas i minst ytterligare 14 dagar utan behandling för att fördröjda eller kvarstående effekter eller återhämtning från toxiska effekter ska kunna upptäckas.
1.4.3 Förfarande Djuren doseras med testsubstansen dagligen sju dagar per vecka under en period på 28 dagar. Dosering fem dagar per vecka måste motiveras. Om testsubstansen tillförs genom sondmatning ska ämnet ges till djuren i en enda dos via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 1 ml/100 g kroppsvikt utom i fråga om vattenlösningar då 2 ml/100 g kroppsvikt får användas. Med undantag för irriterande eller frätande ämnen som normalt visar kraftigare effekt med högre koncentration bör variationer i testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym på alla dosnivåer.
1.4.3
1.4.3.1 Generella observationer Generella kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt(er) varje dag och med hänsyn till de maximalt förväntade effekterna efter dosering. Djurens hälsostatus bör noteras. Minst två gånger per dag kontrolleras om djur är döende eller döda. Döende djur och djur som lider allvarligt bör avlägsnas, avlivas skonsamt och obduceras. Noggranna kliniska observationer görs en gång av samtliga djur före den första exponeringen (för att möjliggöra jämförelser på samma objekt) och därefter minst en gång i veckan. Dessa observationer bör göras utanför buren på en standardarena och helst vid samma tidpunkt varje gång. Observationerna bör noteras noggrant, helst genom ett poängsystem som definieras utförligt av testlaboratoriet. Minimala variationer i försöksbetingelserna bör eftersträvas, och observationerna ska helst utföras av någon som inte känner till behandlingen. De tecken som noteras bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar av hud, hårrem, ögon och slemhinnor, uppträdande av sekret och utsöndringar samt autonom aktivitet (tårflöde, upprest hårrem, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, hållning och reaktion på hantering liksom eventuella kramper eller spasmer, stereotypt beteende (t.ex. överdrivet putsande, repetitivt cirklande) eller bisarrt beteende (t.ex. självstympning, baklängesgång) bör också noteras. Under den fjärde exponeringsveckan bör den sensoriska reaktionen på stimuli av olika slag utföras (t.ex. hörsel-, syn- och djupsensoriska stimuli) liksom bedömning av greppstyrka och motorisk aktivitet. Ytterligare uppgifter om de förfaranden som kan följas finns publicerad (se Allmän inledning, del B). De funktionsobservationer som utförs under den fjärde exponeringsveckan kan utelämnas om en förstudie genomförs som inledning till ett efterföljande subkroniskt 90-dagarstest. I sådana fall bör funktionsobservationerna inkluderas i den efterföljande undersökningen. Å andra sidan kan tillgång på uppgifter om funktionsobservationer från en förstudie med upprepad dosering öka möjligheterna att välja dosnivåer till en efterföljande subkronisk undersökning. I undantagsfall får funktionsobservationerna också utelämnas för grupper som annars skulle visa tecken på toxicitet i en sådan utsträckning att det väsentligt skulle påverka utförandet av funktionsförsöket.
1.4.3.2 Kroppsvikt samt foder- och vattenkonsumtion Alla djuren bör vägas minst en gång i veckan. Mätning av foder- och vattenkonsumtion bör göras minst en gång per vecka. Om testsubstansen tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas minst en gång i veckan.
1.4.3.3 Hematologi Följande hematologiska undersökningar bör göras då testperioden avslutas: hematokrit, hemoglobinkoncentration, räkning av röda blodkroppar, total- och differentialräkning av vita blodkroppar, blodplättsräkning samt ett mått på koaguleringstid och koaguleringsförmåga. Blodprov bör tas från ett angivet ställe just före eller som ett led i avlivningsförfarandet och förvaras under lämpliga förhållanden.
1.4.3.4 Klinisk kemi Kliniskt kemiska bestämningar för att undersöka större toxiska effekter i vävnader, särskilt effekter på lever och njurar, bör utföras på de blodprov som tas från samtliga djur strax före eller som ett led i avlivningsförfarandet (med undantag för de djur som hittas döende eller avlivas under försökets gång). Djuren bör fasta natten före blodprovstagningen. Undersökningar av serum eller plasma ska omfatta natrium, kalium, glukos, totalkolesterol, urinämne, kreatinin, totalprotein och albumin. minst två enzymer som indikerar effekter på leverceller (t.ex. alanin-aminotransferas, aspartat-aminotransferas, alkaliskt fosfatas, gamma-glutamyl-transpeptidas och sorbitol-dehydrogenas). Mätningar av ytterligare enzymer (från lever eller av annat ursprung) och gallsyror kan under vissa förhållanden ge användbar information. Följande urinanalysbestämningar kan utföras frivilligt under sista veckan av försöket med samling av urin på fasta tider: utseende, volym, osmolalitet eller specifik vikt, pH, protein, glukos och blod eller blodceller. Dessutom bör tester för att undersöka serummarkörer av allmänna vävnadsskador övervägas. Andra bestämningar som bör utföras, om testsubstansens kända egenskaper kan eller misstänks påverka närbesläktade metaboliska profiler, omfattar kalcium, fosfat, fastevärden av triglycerider, specifika hormoner, methemoglobin och kolinesteras. Dessa behöver identifieras för ämnen inom vissa grupper eller från fall till fall. Generellt krävs flexibla tillvägagångssätt beroende på djurart och på den observerade eller förväntade effekten av ett givet ämne. Om historiska basdata är otillräckliga bör hänsyn tas till hematologiska och kliniskt kemiska variabler innan doseringen påbörjas.
1.4.3.5 Obduktion Samtliga djur i undersökningen bör underkastas en fullständig obduktion som omfattar yttre granskning av kroppen, alla kroppsöppningar liksom kranium, bröst- och bukhåla samt deras innehåll. Lever, njurar, binjurar, testiklar, bitestiklar, bräss, mjälte, hjärna och hjärta från samtliga djur ska putsas från angränsande vävnad och deras våtvikt vägas så snart möjligt efter dissekering för att undvika uttorkning. Följande vävnader och organ bör bevaras i det mest lämpade mediet för histopatologiska undersökningar: alla stora skador, hjärnan (representativa regioner inbegripet storhjärna, lillhjärna och hjärnbrygga), ryggrad, magsäck, tunntarm och tjocktarm (inklusive Peyer's patches), lever, njurar, binjurar, mjälte, hjärta, bräss, sköldkörtel, luftstrupe och lungor (konserverade genom inflation med fixermedel och därefter immersion), könskörtlar, accessoriska könsorgan (t.ex. livmoder, prostata), urinblåsa, lymfkörtlar (helst en lymfkörtel som omfattar tillförselvägen och en annan långt från tillförselvägen för att täcka systematiska effekter), perifer nerv (ischias- eller tibialnerven), helst nära muskeln, och ett snitt av ryggmärgen (alternativt färskt benmärgsaspirat). Kliniska eller andra fynd indikerar att ytterligare vävnader behöver undersökas. Dessutom bör de organ bevaras som på grund av testsubstansens kända egenskaper förmodas vara målorgan.
1.4.3.6 Histopatologisk undersökning En fullständig histopatologisk undersökning bör utföras på bevarade organ och vävnader från samtliga djur i kontroll- och högdosgrupperna. Undersökningarna bör utsträckas till djur i alla andra dosgrupper om behandlingsrelaterade förändringar observeras i de högre dosgrupperna. Alla stora skador ska undersökas. Om en satellitgrupp används bör histopatologisk undersökning utföras på de vävnader och organ som visat effekter i dosgrupperna.
2. DATA Individuella data bör tillhandahållas. Därutöver bör alla data sammanfattas i en tabell som anger antalet djur i varje testgrupp vid försökets början, antalet djur som hittats döda under försöket eller som avlivats av humanitära skäl samt tidpunkten för avlivning, antalet djur som visar tecken på toxicitet, en beskrivning av de tecken på toxicitet som observerats, inbegripet tidpunkten då de först visar sig, duration och hur allvarliga de toxiska effekterna är, antalet djur som visar skador, typ av skada och procentandelen djur för varje typ av skada. Om möjligt bör numeriska resultat utvärderas genom en lämplig och allmänt godtagbar statistisk metod. De statistiska metoderna bör väljas vid utformningen av undersökningen.
3. RAPPORTERING
3. FÖRSÖKSRAPPORT
Försöksrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Försöksdjur:
Art/stam som använts.
Djurens antal, ålder och kön.
Ursprung, försöksförhållanden, foder etc.
Djurens individuella vikt vid försökets början, därefter varje vecka samt vid försökets avslutning.
Försöksförhållanden:
Motivering av val av vehikel, om annan än vatten.
Grund för dosval.
Utförliga uppgifter om testsubstansens sammansättning och förberedelse av foder, uppnådd koncentration, preparatets stabilitet och homogenicitet.
Utförliga uppgifter om tillförseln av testsubstansen.
Omräkning från testsubstanskoncentration i foder eller vatten (ppm) till faktisk dos (mg/kg kroppsvikt och dag) i förekommande fall.
Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.
Resultat:
Kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt.
Foderkonsumtion och i tillämpliga fall vattenkonsumtion.
Uppgifter om toxiska reaktioner per kön och dosnivå, inklusive tecken på toxicitet.
Arten, grad och duration av kliniska observationer (reversibilitet ska anges).
Bedömning av sensorisk aktivitet, greppstyrka och motorisk aktivitet.
Blodundersökningar med relevanta basvärden.
Kliniskt kemiska tester med relevanta basvärden.
Kroppsvikt vid avlivning och organvikt.
Obduktionsfynd.
En detaljerad beskrivning alla histopatologiska fynd.
Absorptionsdata om de finns tillgängliga.
Statistisk bearbetning av resultaten i tillämpliga fall.
Diskussion om resultaten.
Slutsatser.
4. HÄNVISNINGAR Denna metod motsvarar OECD TG 407.
B.8 TOXICITET VID UPPREPAD DOSERING (28 DAGAR, INANDNING)
B.8
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Det är fördelaktigt att ha förhandsupplysningar om ämnets partikelstorleksfördelning, ångtryck, smältpunkt, kokpunkt, flampunkt och eventuellt explosiva egenskaper. Se också allmän inledning till del B (A).
1.2 DEFINITION Se allmän inledning till del B (B).
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Flera grupper av försöksdjur exponeras dagligen i 28 dagar för testämnet i graderade koncentrationer, en bestämd koncentration per grupp. Om vehikel används för att underlätta framtagning av lämplig koncentration av testämnet i luften, ska en kontrollgrupp som utsätts för vehikeln användas. Under administrationsperioden observeras djuren dagligen för tecken på toxicitet. Djur som dör under testet ska obduceras och i slutet av testet avlivas och obduceras överlevande djur.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Förberedelser I minst fem dagar före testet ska djuren hållas under testbetingelser med hänsyn till miljö och utfodring. Före testet fördelas friska könsmogna djur slumpmässigt i erforderligt antal grupper. Vid behov ska en lämplig vehikel tillsättas till testämnet för att underlätta framtagning av lämplig koncentration av ämnet i luften. Om vehikel eller annan tillsats används för att underlätta dosering ska det vara fastställt att den inte framkallar några toxiska effekter. I lämpliga fall kan tidigare insamlade data användas.
1.6.2 Testbetingelser
1.6.2
1.6.2.1 Försöksdjur Om det inte finns kontraindikationer är råttan förstahandsvalet. De vanligen nyttjade laboratoriestammarna med unga friska djur ska användas. Vid testets början får vikten hos de aktuella djuren inte avvika mer än ± 20 % från en rimlig genomsnittsvikt.
1.6.2.2 Antal och kön Minst 10 djur (fem honor och fem hanar) ska ingå i varje grupp. Honorna får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av djur under testet ska det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt ska avlivas innan studien slutförs. Dessutom kan en satellitgrupp bestående av 10 djur (fem av vardera könet) tillföras den högsta koncentrationen i 28 dagar och därefter observeras i 14 dagar efter testet för reversibilitet, persistens eller fördröjt uppträdande av toxiska effekter. Även en satellitgrupp bestående av 10 kontrolldjur (fem av vardera könet) ska användas.
1.6.2.3 Exponeringskoncentration Till testet används minst tre koncentrationsnivåer och en kontrollgrupp eller en kontrollgrupp som tillförs vehikeln (i en koncentration som svarar mot den högsta koncentrationen av vehikeln). Djuren i kontrollgruppen ska behandlas på samma sätt som djuren i behandlingsgruppen, bortsett från att de inte ska tillföras testämnet. Den högsta koncentrationsnivån ska ge toxiska effekter men inga, eller få, dödsfall. Den lägsta koncentrationsnivån ska inte ge några tecken på toxicitet. Om det finns en användbar uppskattning av människans exponering för ämnet ska den lägsta nivån vara högre än denna. Helst ska medelkoncentrationen ge minsta möjliga observerbara toxiska effekter. Om fler än en medelkoncentration används ska koncentrationsnivåerna väljas på ett sådant sätt att en gradering av de toxiska effekterna erhålls. I grupperna som utsätts för låg- och medelkoncentrationer och i kontrollgruppen ska antalet dödsfall hållas på en låg nivå för att utvärderingen av resultaten ska vara meningsfylld.
1.6.2.4 Exponeringstid Durationen av den dagliga exponeringen ska vara sex timmar men andra perioder kan behövas för att uppfylla särskilda krav.
1.6.2.5 Utrustning Djuren ska testas i inhalationsapparatur som är så utformad att den upprätthåller en dynamisk luftcirkulation med minst 12 luftväxlingar per timme för att säkerställa en tillräcklig syrehalt och en jämnt fördelad exponeringsluft. Om exponeringskammare används ska den vara så utformad att trängseln bland försöksdjuren minimeras och exponeringen för testämnet genom inandning maximeras. Som en allmän regel för att säkerställa en stabil atmosfär i kammaren, ska försöksdjurens totala volym inte överstiga 5 % av exponeringskammarens volym. Exponeringen kan göras genom kammare för mun–näsa, enbart huvudet eller hela försöksdjurets kropp; genom användning av de två första metoderna kan man minska möjligheten att testämnet upptas via andra vägar.
1.6.2.6 Observationstid Under hela testet och återhämtningsperioden ska försöksdjuren observeras dagligen för tecken på toxicitet. Tidpunkten för dödsfall och tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner ska registreras.
1.6.3 Förfarande Djuren exponeras för testämnet dagligen, fem à sju dagar i veckan i 28 dagar. Djur i en eventuell satellitgrupp som planerats för uppföljning ska observeras i ytterligare 14 dagar utan någon behandling så att det kan fastställas om de toxiska effekterna försvinner eller om de håller i sig. Testtemperaturen ska hållas vid 22 ± 3 oC. Under ideala betingelser ska den relativa luftfuktigheten hållas mellan 30 och 70 %, men i vissa fall (t.ex. test av aerosoler) kan detta vara praktiskt ogenomförbart. Ett svagt undertryck i kammaren (≤ 5 mm vatten) förhindrar att testämnet läcker ut i det omgivande rummet. Foder och vatten ska undanhållas djuren under exponeringen. Till testet används ett dynamiskt inhalationssystem med lämpligt analytisk kontrollsystem för att säkerställa exponeringskoncentrationen. Ett provtest rekommenderas för att fastställa lämpliga exponeringskoncentrationer. Luftcirkulationen ska justeras för att säkerställa homogena betingelser i hela exponeringskammaren. Systemet ska vara av en sådan beskaffenhet att stabila exponeringsbetingelser uppnås så snart som möjligt. Mätning eller kontroll ska göras av: Under och efter exponering görs systematiska observationer som registreras för varje enskilt djur. Alla djur ska observeras dagligen och tecken på toxicitet registreras tillsammans med tidpunkten då de uppträdde samt graden och varaktigheten av toxiciteten. Observationer ska omfatta hud- och pälsförändringar, ögon och slemhinnor och även respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Djurens ska vägas varje vecka och vidare rekommenderas att foderförbrukningen mäts per vecka. Det är nödvändigt att observera djuren regelbundet för att säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. I slutet av testet avlivas och obduceras alla överlevande djur utom djuren i satellitgruppen. Döende djur och djur som visar symptom på stark smärta eller lidande avlägsnas så snart de iakttas och avlivas sedan på humant sätt samt obduceras. I slutet av testet ska alla djur inklusive kontrollgruppen genomgå följande undersökning: Andra bestämningar som kan vara nödvändiga för en adekvat toxikologisk utvärdering är kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, glukos efter fasta, lipidanalys, hormoner, syra/basbalansen, methemoglobin och kolinesterasaktivitet. Ytterligare kliniska biokemiska analyser kan vid behov utföras för att vidare utreda de observerade effekterna.
1.6.3 a)
Lufthastigheten (fortlöpande).
b)
Den faktiska koncentrationen av testämnet mätt i respirationszonen. Under den dagliga exponeringsperioden ska koncentrationen inte avvika mer än ± 15 % från den genomsnittliga koncentrationen. En sådan kontrollnivå kan emellertid vara omöjlig att uppnå vid test med vissa aerosoler, och i sådana fall kan större avvikelser accepteras. Under hela testet ska de dagliga koncentrationerna hållas så konstanta som möjligt. För aerosoler analyseras partikelstorleken minst en gång i veckan per försöksgrupp.
c)
Temperatur och luftfuktighet, helst fortlöpande.
i)
Hematologi omfattande minst hematokrit, hemoglobinkoncentration, erytrocyträkning, total och differential räkning av leukocyter samt mätning av koaguleringsförmågan.
ii)
Klinisk biokemisk analys av blodet omfattande minst en lever- och njurfunktionsparameter: alanin-aminotransferas (tidigare kallat glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminas, GPT), serum-aspartat-aminotransferas (tidigare kallat glutaminsyra-oxalättiksyra-transaminas, GOT), och urinkväve, äggviteämnen, blod-kreatinin, totalt bilirubin och totalt serumprotein.
1.6.3.1 Makroskopisk undersökning Alla försöksdjur ska genomgå en fullständig makroskopisk undersökning. Åtminstone lever, njurar, binjurar, lungor och testiklar ska vägas våta så snart som möjligt efter dissektion för att undvika uttorkning. Organ och vävnader (andningsvägarna, lever, njure, mjälte, testiklar, binjurar, hjärta och andra organ som företer allvarliga skador eller storleksförändringar) ska förvaras i lämpligt medium för eventuell senare histopatologisk undersökning. Näs–svalgrummet och lungor ska tas ut hela och oskadade, vägas och behandlas med lämpligt fixativ för att säkerställa att lungstrukturen bibehålls.
1.6.3.2 Histopatologisk undersökning Histologisk undersökning ska göras av bevarade organ och vävnader från högkoncentrationsgruppen och kontrollgruppen/grupperna. Organ och vävnader, hämtade från gruppen som fått den högsta koncentrationen, som uppvisar defekter som kan tillskrivas testämnet, ska undersökas i alla grupper som fått lägre dos. Djur i en eventuell satellitgrupp ska genomgå histologisk undersökning, särskilt de organ och vävnader som har utvisat effekter i de övriga behandlingsgrupperna.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp anges antal djur i början av testet och antal djur som företer varje typ av skada. Alla observerade resultat ska utvärderas med lämplig statistisk metod. Alla vedertagna statistiska metoder kan användas.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv.
Testbetingelser: Beskrivning av exponeringsapparaturen, inklusive utformning, typ, mått, luftkälla, system för att generera partiklar och aerosoler, metod för konditionering av luften, behandling av utpumpad luft och metoden att hålla djuren i en exponeringskammare, om sådan används. Utrustningen för att mäta temperatur, luftfuktighet och i förekommande fall aerosolkoncentrationers eller partikelstorlekars stabilitet, ska beskrivas. Exponeringsdata: Dessa ska ställas upp i tabellform med angivande av medelvärden och ett spridningsmått (t.ex. standardavvikelse) och ska om möjligt omfatta:
3.1
pt_2 a)
Lufthastighet genom inhalationsutrustningen.
b)
Luftens temperatur och fuktighet.
c)
Nominella koncentrationer (total mängd testämne som tillförts inhalationsutrustningen, dividerat med luftvolymen).
d)
Typ av vehikel, om sådan använts.
e)
Faktiska koncentrationer i testets andningszon.
f)
Massmedianen av den aerodynamiska diametern (MMAD) och den geometriska standardavvikelsen (GSD).
Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter kön och koncentration.
Tidpunkten för dödsfall under testet eller överlevnad till slutet av testet.
Beskrivning av toxiska och andra effekter.
Tidpunkten för observation av varje abnormt tecken och dess senare utveckling.
Uppgifter om foder och kroppsvikt.
Gjorda hematologiska undersökningar och alla resultat.
Gjorda kliniska biokemiska analyser och alla resultat.
Obduktionsfynd.
Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska fynd.
Statistisk behandling av resultaten när detta är möjligt.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B (D).
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B (E).
B.9 TOXICITET VID UPPREPAD DOSERING (28 DAGAR, DERMALT)
B.9
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B (A).
1.2 DEFINITIONER Se allmän inledning till del B (B).
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Testämnet appliceras dagligen i graderade doser på huden till flera grupper av försöksdjur, varvid varje grupp ges en bestämd dos i 28 dagar. Under appliceringsperioden observeras djuren dagligen för tecken på toxicitet. Djur som dör under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas och obduceras de överlevande djuren.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6
1.6.1 Förberedelser I minst fem dagar före testet ska djuren hållas under testbetingelser med hänsyn till miljö och utfodring. Före testet fördelas friska unga djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper. Omedelbart innan testet inleds ska päls klippas bort från försöksdjurens rygg. Om pälsen rakas bort ska detta göras ungefär 24 timmar före testet. Klippning eller rakning behöver vanligtvis upprepas ungefär en gång i veckan. När pälsen klipps eller rakas bort ska försiktighet iakttas så att huden inte skadas. Minst 10 % av kroppsytan ska göras klar för applicering av testämnet. Vid fastställande av vilket och hur stort område som ska förberedas ska hänsyn tas till djurets kroppsvikt. Vid test av fasta ämnen, som får pulvriseras om det är lämpligt, ska testämnet fuktas tillräckligt med vatten eller, vid behov med lämplig vehikel, för att säkerställa god kontakt med huden. Flytande testämnen används vanligen outspädda. Testämnet appliceras dagligen fem till sju dagar i veckan.
1.6.2 Testbetingelser
1.6.2
1.6.2.1 Försöksdjur Könsmogna råttor, kaniner eller marsvin får användas. Andra arter kan användas men i så fall ska detta motiveras. Vid testets början får vikten hos de aktuella djuren inte avvika mer än ± 20 % från en rimlig genomsnittsvikt.
1.6.2.2 Antal och kön Minst 10 djur (fem honor och fem hanar) med frisk hud ska användas på varje dosnivå. Honorna får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av djur under testet ska det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt ska avlivas innan studien slutförs. Dessutom kan en satellitgrupp bestående av 10 djur (fem av vardera könet) tillföras den högsta dosnivån i 28 dagar och därefter observeras i 14 dagar efter testet för reversibilitet, persistens eller fördröjt uppträdande av toxiska effekter. Även en satellitgrupp bestående av 10 kontrolldjur (fem av vardera könet) ska användas.
1.6.2.3 Dosnivåer Till testet ska användas minst tre dosnivåer samt en kontrollgrupp eller en vehikelkontroll, om vehikel används. Testämnet ska appliceras vid samma tid varje dag och dosnivåerna ska justeras med jämna mellanrum (varje eller varannan vecka) så att dosnivån hålls konstant i förhållande till djurens kroppsvikt. Djuren i kontrollgruppen ska behandlas på samma sätt som djuren i behandlingsgruppen, bortsett från att de inte ska tillföras testämnet. Om vehikel används för att underlätta dosering ska kontrollgruppen tillföras vehikeln på samma sätt som behandlingsgrupperna. Vidare ska vehikeln tillföras kontrollgruppen i samma mängd som till de försöksdjur i gruppen som ges den högsta dosnivån. Den högsta dosnivån ska ge toxiska effekter men inga eller få dödsfall. Den lägsta dosnivån ska inte ge några tecken på toxicitet. Om det finns en användbar uppskattning av människans exponering för ämnet ska den lägsta nivån vara högre än denna. Helst ska medeldosen ge minsta möjliga observerbara toxiska effekter. Om fler än en medeldos används ska dosnivåerna väljas på ett sådant sätt att en gradering av de toxiska effekterna erhålls. I grupperna som utsätts för låg- och medeldoser och i kontrollgruppen ska antalet dödsfall hållas på en låg nivå för att utvärderingen av resultaten ska vara meningsfylld. Om appliceringen av testämnet ger allvarlig hudirritation ska koncentrationerna sänkas, vilket kan medföra att andra toxiska effekter minskar eller uteblir på högsta dosnivån. Om huden har skadats allvarligt kan det bli nödvändigt att avsluta det pågående testet och påbörja en ny med lägre koncentrationer.
1.6.2.4 Gränstest Om det vid ett förberedande test fastställs att en dosnivå på 1000 mg/kg, eller en högre dosnivå om detta motiveras av kunskap om människans möjliga exponering, inte ger några toxiska effekter kan ytterligare test anses vara överflödiga.
1.6.2.5 Observationsperiod Försöksdjuren ska observeras dagligen för tecken på toxicitet. Tidpunkten för dödsfall och tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder ska registreras.
1.6.3 Förfarande Djuren ska hållas i var sin bur. Den ideala doseringen är att djuren utsätts för testämnet sju dagar i veckan i 28 dagar. Djur i en eventuell satellitgrupp som planerats för uppföljning ska observeras i ytterligare 14 dagar utan tillförsel av testämnet så att det kan fastställas om de toxiska effekterna försvinner eller om de håller i sig. Exponeringstiden ska vara minst sex timmar per dag. Testämnet ska appliceras jämnt över ett område som motsvarar ungefär 10 % av den totala kroppsytan. Med starkt toxiska ämnen kan testområdet vara mindre men så stor del av området som möjligt ska täckas med ett så tunt och jämnt fördelat lager som möjligt. Under exponeringen ska testämnet hållas i kontakt med huden med en porös kompress och icke hudirriterande tejp. Testområdet ska vidare täckas på lämpligt sätt så att gaskompressen och testämnet hålls på plats och djuren inte kan inta testämnet. För att förhindra intag av testämnet kan rörelsehindrande anordningar användas men total immobilisering rekommenderas inte. Alternativt kan en skyddskrage användas. I slutet av exponeringsperioden ska kvarvarande testämne avlägsnas, om så är lämpligt med användning av vatten eller någon annan passande metod att rengöra huden. Alla djuren ska observeras dagligen och tecken på toxicitet ska registreras tillsammans med tidpunkten då de uppträdde samt graden och varaktigheten av toxiciteten. Observationer ska omfatta hud- och pälsförändringar, ögon och slemhinnor och även respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Djurens ska vägas varje vecka och vidare rekommenderas att foderförbrukningen mäts per vecka. Det är nödvändigt att observera djuren regelbundet för att säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. I slutet av testet avlivas och obduceras alla överlevande djur utom djuren i satellitgruppen. Djur som dör under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas och obduceras de överlevande djuren. I slutet av testet ska alla djur inklusive kontrollgruppen genomgå följande undersökning: Andra bestämningar som kan vara nödvändiga för en adekvat toxikologisk utvärdering är kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, glukos efter fasta, lipidanalys, hormoner, syra/basbalansen, metahemoglobin och kolinesterasaktivitet. Ytterligare kliniska biokemiska analyser kan vid behov utföras för att vidare utreda de observerade effekterna.
1.6.3
1. Hematologi omfattande minst hematokrit, hemoglobinkoncentration, erytrocyträkning, total och differential räkning av leukocyter samt mätning av koaguleringsförmågan.
2. Klinisk biokemisk analys av blodet omfattande minst en lever- och njurfunktionsparameter: alanin-aminotransferas (tidigare kallat glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminas, GPT), serum-aspartat-aminotransferas (tidigare kallat glutaminsyra-oxalättiksyra-transaminas, GOT), och urinäkväve, äggviteämnen, blod-kreatinin, totalt bilirubin och totalt serumprotein.
1.6.4 Makroskopisk undersökning Alla försöksdjur ska genomgå en fullständig makroskopisk undersökning. Lever, njurar, binjurar och testiklar ska vägas våta så snart som möjligt efter dissektion för att undvika uttorkning. Organ och vävnader, dvs. obehandlad och behandlad hud, lever, njure, mjälte, testiklar, binjurar, hjärta och målorgan (de organ som företer allvarliga skador eller storleksförändringar) ska förvaras i lämpligt medium för eventuell senare histopatologisk undersökning.
1.6.5 Histopatologisk undersökning Histologisk undersökning ska göras av bevarade organ och vävnader från högdosgruppen och kontrollgruppen. Organ och vävnader, hämtade från gruppen som fått den högsta dosnivån, som uppvisar defekter som kan tillskrivas testämnet, ska undersökas i alla grupper som fått lägre dos. Djur i satellitgruppen ska genomgå histologisk undersökning, särskilt de organ och vävnader som har utvisat effekter i de övriga behandlingsgrupperna.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp anges antal djur i början av testet och antal djur som företer varje typ av skada. Alla observerade resultat ska utvärderas med lämplig statistisk metod. Alla vedertagna statistiska metoder kan användas.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Data om djuren (art, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv.).
Testbetingelser (inklusive slag av bandage: med eller utan ocklusion).
Dosnivåer (inklusive vehikel, om sådan använts) och koncentrationer.
Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos.
Icke toxisk dos, om sådan har fastställts.
Tidpunkten för dödsfall under testet eller överlevnad till slutet av testet.
Toxiska och andra effekter.
Tidpunkten för observation av varje abnormt tecken och dess senare utveckling
Uppgifter om foder och kroppsvikt.
Hematologiska undersökningar och alla resultat.
Kliniska biokemiska analyser och alla resultat.
Obduktionsfynd.
Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska fynd.
Statistisk behandling av resultaten i lämpliga fall.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B (D).
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B (E).
B.10 MUTAGENICITET – TEST IN VITRO AV KROMOSOMAVVIKELSER HOS DÄGGDJUR
B.10
1. METOD Denna metod är en kopia av metoden OECD TG 47 3, Test In Vitro av kromosomavvikelser hos däggdjur (1997).
1.
1.1 INLEDNING Avsikten med testen av kromosomavvikelser in vitro är att identifiera ämnen som orsakar strukturella kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller (1) (2) (3). Strukturella avvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Majoriteten av de kemiska mutagenerna inducerar avvikelser av kromatidtyp, men även avvikelser av kromosomtyp förekommer. En ökning av polyploidin kan indikera att ett kemiskt ämne har potential att inducera numeriska avvikelser. Denna metod är dock inte utformad för att mäta numeriska avvikelser och används inte rutinmässigt för det ändamålet. Kromosommutationer och liknande händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar och det finns påtagliga bevis för att kromosommutationer och liknande händelser som ger upphov till förändringar i onkogener och tumörsuppressorgener i somatiska celler är inblandade i cancerinduktion hos människa och hos försöksdjur. Test av kromosomavvikelser in vitro kan göras med kulturer av etablerade cellinjer, cellstammar eller primära cellkulturer. De celler som används väljs ut på grundval av tillväxtförmåga vid odling, karyotypens stabilitet, antalet kromosomer, kromosomernas mångfald och den spontana frekvensen av kromosomavvikelser. Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att en exogen källa för metabolisk aktivering används. Detta metaboliska system för aktivering kan inte helt och hållet efterlikna de förhållanden som råder i däggdjuret in vitro. Man bör se till att undvika sådana förhållanden som skulle leda till positiva resultat som inte återspeglar den verkliga mutageniciteten och kan ha sin orsak i pH-förändringar, osmolalitet eller hög cytotoxicitet (4) (5). Detta test används för att söka efter möjliga mutagener och karcinogener hos däggdjur. Många ämnen som är positiva i detta test är karcinogena hos däggdjur, men det finns ingen perfekt korrelation mellan detta test och karcinogenicitet. Korrelationen är beroende på den kemiska klassen och det finns allt starkare bevis för att det finns karcinogener som inte detekteras med detta test, eftersom det ser ut som om de verkar genom andra mekanismer än direkta DNA-skador. Se även Allmän inledning, del B.
1.2 DEFINITIONER avvikelser av kromatidtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt i form av brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider. avvikelser av kromosomtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt som brott, eller brott och återförening, hos båda kromatiderna pä samma ställe. endoreduplikation: en process där kärnan efter den S-fas under DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. Resultatet är kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider. lucka: en akromatisk skada som är mindre än bredden hos en kromatid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna. mitotiskt index: den andel celler som är i metafas delat med det totala antalet celler som kan observeras i en cellpopulation; en indikation på graden av tillväxt hos den populationen. numerisk avvikelse: en förändring av antalet kromosomer jämfört med det normala antalet karakteristika hos de celler som används. polyploidi: en multipel av det haploida antalet kromosomer (n) som skiljer sig från det diploida antalet (dvs. 3n, 4n och så vidare). strukturell avvikelse: en förändring i kromosomstrukturen som kan detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och fragment, interna eller externa utbyten.
1.3 TESTMETODENS PRINCIP Cellodlingar exponeras för testsubstansen både med och utan metabolisk aktivering. Vid förutbestämda intervall, efter det att cellodlingen har exponerats för testsubstansen, utförs behandling med ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colcemid® eller colchicin). Därefter skördas cellerna och färgas in, varpå närvaro av kromosomavvikelser i metafascellerna analyseras mikroskopiskt.
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Förberedelser
1.4.1
1.4.1.1 Celler Ett antal olika cellinjer, stammar eller primära cellkulturer, inklusive humanceller, kan användas (t.ex. fibroblaster från kinesisk hamster, perifera blodlymfocyter från människor eller andra däggdjur).
1.4.1.2 Typ av medium och kultur Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, CO2-koncentration, temperatur och luftfuktighet) bör väljas för odlingarna. Etablerade cellinjer och stammar bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på stabilitet hos det modala kromosomantalet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma. Om kontaminering har skett bör de inte användas. Cellernas normala cellcykeltid och de odlingsförhållanden som används bör vara kända.
1.4.1.3 Förberedelse av kulturer Etablerade cellinjer och stammar: celler dras upp från stamkulturer, inokuleras i ett odlingsmedium som har en sådan densitet att kulturerna inte kommer att växa samman innan det är dags att skörda, och inkuberas vid 37 oC. Lymfocyter: helblod, behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin} eller separerade lymfocyter som erhållits från friska individer, tillsätts till odlingsmediet, vilket innehåller en mitogen substans (t.ex. fytohemaglutinin), varpå inkubering sker vid 37 oC.
1.4.1.4 Metabolisk aktivering Celler bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro av ett lämpligt metaboliskt system för aktivering. Det mest använda systemet är en kofaktorstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd ur lever från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) eller en blandning av fenobarbiton och β-naftoflavon (10) (11) (12). Den postmitokondriella fraktionen används vanligen vid koncentrationer i området 1 till 10 % v/v i det slutliga testmediet. Tillståndet hos ett system för metabolisk aktivering kan bero på den klass av kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den post-mitokondriella fraktionen. Ett antal vidareutvecklingar, inklusive skapandet av genetiskt modifierade cellinjer som uttrycker specifika aktiverande enzymer, kan erbjuda en potential för endogen aktivering. Valet av de cellinjer som ska användas bör vara vetenskapligt underbyggt (t.ex. genom relevansen av cytokrom P450 isoenzym för metabolismen hos testsubstansen).
1.4.1.5 Beredning av testsubstansen Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpligt lösningsmedel eller vehikel och spädas ut om detta är lämpligt före det att cellerna behandlas. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till testsystemen och/eller spädas ut innan behandlingen startas. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata påvisar att lagring är acceptabelt.
1.4.2 Försöksbetingelser
1.4.2
1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel Lösningsmedlet/vehikeln bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen och bör vara förenlig med överlevnaden för cellerna samt S9-aktiviteten. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas data som visar att de är kompatibla. Det rekommenderas att vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar i första hand bör övervägas närhelst det är möjligt. När substanser som är instabila i vatten testas, bör de organiska lösningsmedel som används vara fria från vatten. Vatten kan avlägsnas genom tillsats av en molekylsikt.
1.4.2.2 Exponeringskoncentrationer Bland de kriterier som ska övervägas när den högsta koncentrationen ska fastställas är cytotoxicitet, löslighet i testsystemet och förändringar i pH eller osmolalitet. Cytotoxicitet bör fastställas, såväl med som utan metabolisk aktivering i huvudexperiment, med hjälp av en lämplig indikation på cellernas integritet och tillväxt, såsom graden av sammanväxning, viabilitetsräkning av cellerna, eller ett mitotiskt index. Det kan vara lämpligt att fastställa cytotoxicitet och löslighet i ett förberedande experiment. Minst tre analyserbara koncentrationer bör användas. Där cytotoxicitet uppträder bör dessa koncentrationer täcka in ett område som sträcker sig från maximal toxicitet ner till liten eller ingen toxicitet. Detta innebär normalt att koncentrationerna bör separeras av minst en faktor mellan 2 och 10. Vid tiden för skörd av cellerna bör den högsta koncentrationen visa en signifikant reduktion i graden av konfluens, cellräkning eller mitotiskt index (alla större än 50 %). Det mitotiska indexet är endast ett indirekt mått på cytotoxiska/cytosta-tiska effekter och är beroende av tiden efter behandlingen. Det mitotiska indexet är dock acceptabelt för suspensionskulturer där andra toxicitetsmätningar kan vara besvärliga och opraktiska. Information om kinetiken för cellcykler, såsom medelgenerationstid (AGT), kan användas som extra information. AGT är dock ett övergripande medelvärde som inte alltid avslöjar existensen av försenade subpopulationer, och även små ökningar av medelgenerationstiden kan associeras med en mycket påtaglig senareläggning av tiden för optimalt utbyte av avvikelser. För substanser som är relativt icke-cytotoxiska bör den maximala testkoncentrationen vara 5 μl/ml, 5 mg/ml eller 0,01 M, beroende på vilket av dessa värden som är det lägsta. För relativt olösliga substanser, som inte är toxiska vid koncentrationer som är lägre än koncentrationen där olöslighet inträder, bör den högsta använda dosen vara en koncentration som ligger över löslighetsgränsen i det avslutande odlingsmediet mot slutet av behandlingsperioden. I vissa fall (t.ex. när toxicitet endast uppträder vid koncentrationer som är högre än den lägsta olösliga koncentrationen) är det lämpligt att testa vid mer än en koncentration med synlig fällning. Det kan vara lämpligt att fastställa lösligheten vid början och slutet av behandlingen, eftersom lösligheten kan ändras under det att exponeringen i testsystemet pågår, beroende på närvaro av celler, S9, serum, etc. Löslighet kan detekteras med blotta ögat. Fällningen torde inte störa bestämningen.
1.4.2.3 Negativa och positiva kontroller Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller vehikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje experiment. När metabolisk aktivering används, bör den positiva kontrollkemikalien vara av en sådan typ att aktivering krävs för att ge ett mutagent svar. Positiva kontroller bör utnyttja en känd klastogen vid exponeringsnivåer som förväntas ge en reproducerbar och detekterbar ökning jämfört med bakgrunden och som demonstrerar känsligheten hos testsystemet. Positiva kontrollkoncentrationer bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos kodade utstryksglas för läsaren. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser. Betingelser för metabolisk aktivering Substans CAS-nummer EINECS-nummer Frånvaro av exogen metabolit Aktivering Metylmetansulfonat 66-27-3 200-625-0 Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 4-Nitroquinolin-N-oxid 56-57-5 200-281-1 Närvaro av exogen metabolit Aktivering Bens[a]pyren 50-32-8 200-028-5 Cyklofosfamid Cyklofosfamidmonohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Andra lämpliga positiva kontrollsubstanser kan användas. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas när sådana finns att tillgå. Negativa kontroller, bestående av lösningsmedel eller enbart en vehikel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas var gång som odlingen skördas. Dessutom bör obehandlade kontroller också användas om det inte finns historiska kontrolldata som påvisar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.
1.4.3 Förfarande
1.4.3
1.4.3.1 Behandling med en testsubstans Prolifererande celler behandlas med testsubstansen i såväl närvaro som frånvaro av ett system för metabolisk aktivering. Behandling av lymfocyter bör inledas när cirka 48 timmar gått efter den mitogena stimuleringen.
1.4.3.2 Två kulturer bör normalt användas för varje koncentration, och rekommenderas varmt för negativa kontrollkulturer eller kontrollkulturer för lösningsmedel. Där minimala variationer mellan två kulturer kan påvisas (13) (14) ur historiska data, kan det vara acceptabelt att en enda kultur används för varje koncentration. Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med hjälp av lämpliga metoder, t.ex. test i slutna odlingskärl (15) (16).
1.4.3.3 Tid för skörd av odlingen I det första experimentet bör cellerna exponeras för testsubstansen, både med och utan metabolisk aktivering, under 3–6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (12). Om detta protokoll ger negativa resultat både med och utan aktivering, bör ytterligare ett experiment utan aktivering utföras, med kontinuerlig behandling fram till dess att provtagning sker vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcyklens längd. Vissa kemikalier kan vara enklare att detektera vid behandlings-/provtagningstider som är längre är 1,5 cykellängder. Negativa resultat med metabolisk aktivering måste bekräftas från fall till fall. I de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta negativa resultat bör detta motiveras.
1.4.3.4 Kromosomberedning Cellkulturer behandlas vanligtvis med Colcemid® eller colchicin under 1–3 timmar innan skördning sker. Varje cellkultur skördas och behandlas separat för preparationen av kromosomer. Kromosomberedning innefattar hypoton behandling av cellerna, fixering och infärgning.
1.4.3.5 Analys Alla utstryksglas, inklusive de med positiva och negativa kontroller, bör kodas upp oberoende av varandra innan den mikroskopiska analysen utförs. Eftersom fixeringen ofta ger upphov till brott på en del av de celler som är i metafas, med åtföljande förlust av kromosomer, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromerantal som är ekvivalent med det modala antalet ± 2 för alla celltyper. Åtminstone 200 väl spridda metafaser bör förekomma per koncentration och kontroll, med lika fördelning mellan dubbelproven, om det är tillämpligt. Detta antal kan reduceras när ett stort antal avvikelser observeras. Även om syftet med testet är att detektera strukturella kromosomavvikelser, är det viktigt att notera polyploidi och endoreduplikation när dessa händelser observeras.
2. DATA
2.
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN Den experimentella enheten utgörs av cellen, och därför bör den procentandel av cellerna som uppvisar strukturella kromosomavvikelser utvärderas. Olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas med antal och frekvenser för experimentella kulturer samt kontrollkulturer. Luckor i DNA-strängen noteras separat och rapporteras men inkluderas inte generellt i den totala frekvensen för avvikelser. Samtidiga mätningar av cytotoxicitet för alla behandlade och negativa kontrollkulturer i huvudexperimenten avseende avvikelser bör även samlas in. Individuella data för kulturen bör tas fram. Dessutom bör alla data sammanställas i form av en tabell.
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning eller en reproducerbar ökning av antalet celler med kromosomavvikelser. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärderingen av testresultaten (3) (13). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. En ökning av antalet polyploida celler kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inhibera mitotiska processer och att inducera numeriska kromosomavvikelser. En ökning av antalet celler med endoreduplicerade kromosomer kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inhibera cellcykelns förlopp (17) (18). En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier bedöms såsom icke-mutagen i detta system. Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många experiment som utförs. Positiva resultat från testet av kromosomavvikelser in vitro indikerar att testsubstansen inducerar strukturella kromosomavvikelser hos odlade somatiska däggdjursceller. Negativa resultat indikerar att testsubstansen inte inducerar kromosomavvikelser hos odlade somatiska däggdjursceller under de betingelser som rådde under testet.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Testrapporten måste innehålla följande information:
Lösningsmedel/vehikel:
Motivering av valet av vehikel.
Testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt.
Celler:
Cellernas typ och ursprung.
Den använda celltypens karyotypegenskaper och lämplighet.
Frånvaro av mykoplasma, om detta är tillämpligt.
Information om cellcykelns längd.
Bloddonatorernas kön, helblod eller separerade lymfocyter, använd mitogen substans
Antal passager, om detta är tillämpligt.
Metoder för underhåll av cellkulturen, om detta är tillämpligt.
Det normala antalet kromosomer.
Försöksbetingelser:
Identitet hos det ämne som stoppar celldelningen i metafasen, dess koncentration och cellexponeringens varaktighet.
Grund för val av koncentrationer och antalet kulturer som ingår, t.ex. data för cytotoxicitet och begränsningar i löslighet, om detta finns tillgängligt.
Mediets sammansättning, CO2-koncentration, om detta är tillämpligt.
Testsubstansens koncentration.
Den tillsatta vehikelns och testsubstansens volym.
Inkubationstemperatur.
Inkubationstid.
Behandlingens varaktighet.
Celldensitet vid inokulering, om detta är tillämpligt.
Typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier.
Positiva och negativa kontroller.
Metoder för preparation av utstryksglas.
Kriterier för bedömning av avvikelser.
Antal metafaser som analyserats.
Metoder för toxicitetsmätningarna.
Kriterier för när studierna ska anses vara positiva, negativa eller osäkra.
Resultat:
Tecken på toxicitet, t.ex. grad av sammanväxning, cellcykeldata, cellräkningar, mitotiskt index.
Tecken på utfällning.
Data om behandlingsmcediets pH och osmolalitet, om detta har uppmätts.
Definition av avvikelser, inklusive luckor i DNA-strängen.
Antalet celler med kromosomavvikelser och typ av sådana avvikelser, angivna separat för varje behandlad kultur samt kontrollkultur.
Förändringar i ploiditet, om detta observerats.
Dos/respons-förhållande, där det är möjligt.
Statistiska analyser, om sådana finns.
Samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata.
Historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata, med variationer, medelvärden och standardavvikelser.
Diskussion av resultaten.
Slutsatser.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.
HÄNVISNINGAR Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Melhods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, s. 1–29. Ishidate, M. Jr. och Sofuni, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, s. 427–432. Galloway, S. M, Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, K, Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M. A, Anderson, G. och Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), s. 1–175. Scott, D., Galloway, S. M, Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. och Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, s. 147–204. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. och Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, s. 297–305. Arnes, B. N., McCann, J. och Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, s. 347–364. Maron, D. M. och Arnes, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, s. 173–215. Natarajan. A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. och de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, s. 83–90. Matsuoka, A., Hayashi, M. och Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, s. 277–290. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. och Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, s. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M, Hara, K. och Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. och Philpot, R. M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, s. 85–88. Galloway, S. M., Aardema. M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P, Sofuni, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, s. 241–261. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. och Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154. Soper, K. A. och Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, s. 139–149. Krahn, D. F, Barsky, F. C. och McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds). Genotoxic Effects oj Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91–103. Zamora, P. O., Beson, J. M., Li, A. P. och Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels of Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, s. 795–801. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, s. 403–413. Huang, Y., Change, C. och Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, s. 1362–1364.
B.11 MUTAGENICITET – TEST IN VIVO AV KROMOSOMAVVIKELSER I BENMÄRG HOS DÄGGDJUR
B.11
1. METOD Denna metod är en kopia av OECD TG 475, Test av kromosomavvikelser i benmärg hos däggdjur (Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997)).
1.
1.1 INLEDNING Testet in vivo avseende kromosomavvikelser hos däggdjur används för att detektera strukturella kromosomavvikelser inducerade av testsubstansen i benmärgsceller hos djur, vanligen hos gnagare (1) (2) (3) (4). Strukturella kromosomavvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. En ökning av polyploidin kan indikera att en kemikalie har potential att inducera numeriska avvikelser. För huvuddelen av de kemiska mutagenerna utgörs de inducerade avvikelserna av kromatidtypen, men även avvikelser av kromosomtyp kan förekomma. Kromosommutationer och liknande händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människa och det finns omfattande bevis för att kromosommutationer och liknande händelser som ger upphov till förändringar i onkogener samt att tumörsuppressorgener är inblandade i cancer hos människa och i experimentella system. Gnagare används rutinmässigt i detta test. Benmärg är målvävnaden i detta test, eftersom det är en mycket kärlrik vävnad som innehåller en cellpopulation med en snabb cellcykel, och där cellerna enkelt kan isoleras och bearbetas. Andra arter och målvävnader används inte med denna metod. Detta test av kromosomavvikelser är särskilt relevant för att fastställa mutagena risker, eftersom det medger överväganden av faktorer in vivo för metabolism, farmakokinetik och processer för DNA-reparationer, även om dessa faktorer kan variera mellan olika arter och vävnader. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av en mutagen effekt, med detektion genom tester in vitro. Om det finns bevis för att testsubstansen, eller en reaktiv metabolit, inte kommer att nå målvävnaden, är det inte lämpligt att använda detta test. Se även Allmän inledning, del B.
1.2 DEFINITIONER avvikelser av kromatidtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt i form av brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider. avvikelser av kromosomtyp: en strukturell kromosomskada, uttryckt som brott, eller brott och återförening, hos båda kromatiderna på samma ställe. endoreduplikation: en process där kärnan efter den S-fas under DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. Resultatet är kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider. lucka: en akromatisk skada som är mindre än bredden hos en kromatid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna. numerisk avvikelse: en förändring av antalet kromosomer jämfört med det normala antalet karakteristika hos de celler som används. polyploidi: en multipel av det haploida antalet kromosomer (n) som skiljer sig från det diploida antalet (dvs. 3n, 4n.). strukturell avvikelse: en förändring i kromosomstrukturen som kan detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och fragment, interna eller externa utbyten.
1.3 TESTMETODENS PRINCIP Djur exponeras för testsubstansen genom en lämplig metod för exponering och de avlivas på lämpliga tider efter behandlingen. Innan de avlivas behandlas djuren med ett ämne som gör att celler stannar upp i metafas (t.ex. colchicin eller Colcemid®). Kromosomberedningar görs sedan från benmärgscellerna och färgas in, varpå celler i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Förberedelser
1.4.1
1.4.1.1 Val av djurarter Vanligen används råttor, möss och kinesiska hamstrar, även om vilket lämpligt däggdjur som helst kan utnyttjas. Man bör välja de stammar av unga, friska vuxna djur som vanligen används på laboratorier. När undersökningen ska påbörjas, är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren är så liten som möjligt och den bör inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön.
1.4.1.2 Förhållanden vid förvaring och utfodring De generella förhållanden som anges i den Allmänna inledningen till del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 50–60 %.
1.4.1.3 Förberedelse av djuren Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren ska ha en unik identifiering. De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar.
1.4.1.4 Beredning av doser Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas, om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.
1.4.2 Försöksbetingelser
1.4.2
1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Därhelst det är möjligt rekommenderas att man i första hand överväger att använda vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.
1.4.2.2 Kontroller Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) bör ingå för varje kön i varje test. Förutom behandling med testsubstansen, bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på ett identiskt sätt i förhållande till djuren i de grupper där behandling skett. Positiva kontroller bör ge strukturella avvikelser in vivo vid exponeringsnivåer som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till bakgrunden. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men att identiteten hos kodade utstryksglas inte omedelbart avslöjas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen och att provtagning endast sker vid ett enstaka tillfälle. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier kan dessutom övervägas när dessa finns tillgängliga. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser. Substans CAS-nummer EINECS-nummer Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Cyklofosfamid Cyklofosfamidmonohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietylenmelamin 51-18-3 200-083-5 Negativa kontroller, behandlade enbart med lösningsmedel eller vehikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte acceptabel variabilitet och frekvens hos celler med kromosomavvikelser hos djuren kan erhållas från historiska kontrolldata. Om enstaka provtagning används för negativa kontroller, är den lämpligast tiden det första provtagningstillfället. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas om det inte finns historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln.
1.5 FÖRFARANDE
1.5
1.5.1 Försöksdjurens antal och kön Varje behandlad grupp samt kontrollgruppen måste bestå av minst 5 analyserbara djur av varje kön. Det räcker med att testa enbart det ena könet, om det vid tiden för undersökningens genomförande finns data tillgängliga från undersökningar av samma art och där man har använt sig av samma exponeringssätt, så att det går att visa att det inte finns några substantiella skillnader i toxicitet mellan könen. I de fall där exponering för kemikalier hos människa kan vara könsspecifik, vilket t.ex. kan vara fallet för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön.
1.5.2 Behandlingsschema Testsubstanser administreras med fördel som en enstaka behandling. Testsubstanser kan även administreras i form av en delad dos, två behandlingar under samma dag med högst några timmars intervall, för att underlätta administrering av en stor volym. Andra doseringsscheman bör vara vetenskapligt motiverade. Prover bör tas vid två separata tillfällen efter behandling under en dag. Det första provtagningstillfället för gnagare ligger på 1,5 gånger den normala cellcykelns längd (den senare är normalt 12–18 timmar) efter behandling. Eftersom den tid som går åt för upptag och metabolism av testsubstansen, likväl som dess effekt på cellcykelns kinetik, kan påverka den optimala tiden för detektion av kromosomavvikelser, så rekommenderas att provtagningen senareläggs till 24 timmar efter det första provtagningstillfället. Om doseringsscheman på mer än en dag används, bör man använda en provtagningstid på 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter den slutliga behandlingen. Innan djuren avlivas bör de injiceras intraperitonealt med en lämplig dos av ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colcemid® eller colchicin). Prov på försöksdjur bör därefter tas vid lämpliga intervall. För möss är detta intervall ca 3–4 timmar; för kinesiska hamstrar ligger intervallet på ca 4–5 timmar. Celler skördas från benmärgen och analyseras med avseende på kromosomavvikelser.
1.5.3 Dosnivåer Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen (5). Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första provtagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett område som sträcker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid senare provtagningstillfällen räcker det med att endast den högsta dosen används. Den högsta dosen definieras som den dos som producerar tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret dör. Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undantag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas från fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i benmärgen (t.ex. mer än 50 % reduktion av mitotiskt index).
1.5.4 Limit-test En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara nödvändig om ett test på en dosnivå på minst 2000 mg/kg kroppsvikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. För undersökningar med en längre varaktighet ligger gränsdosen på 2000 mg/kg/kroppsvikt/dag vid behandlingar upp till 14 dagar, och 1000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behandlingar som varar längre än 14 dagar. Förväntad exponering av människor kan utgöra en indikation på behovet av att använda en högre dosnivå i ett limit-test.
1.5.5 Administrering av doser Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intraperitoneal injektion. Andra vägar för exponering kan vara acceptabla där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan administreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är högre än dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva substanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en justering av koncentrationen för att säkerställa att volymen är konstant vid alla dosnivåer.
1.5.6 Kromosomberedning Omedelbart efter avlivningen tas benmärgen ut, tillsätts hypoton lösning och fixeras. Cellerna sprids sedan ut på utstryksglas och färgas in.
1.5.7 Analys Det mitotiska indexet bör fastställas om ett mått på cytotoxicitet hos minst 1000 celler per djur för alla behandlade försöksdjur (inklusive positiva kontroller) och obehandlade försöksdjur för negativ kontroll. Minst 100 celler bör analyseras för varje försöksdjur. Detta antal kan reduceras när ett stort antal avvikelser observeras. Alla utstryksglas, inklusive de för positiva och negativa kontroller, bör kodas oberoende av varandra innan de analyseras i mikroskop. Eftersom beredningen av utstryksglas ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas med förlust av kromosomer som följd, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromererantal som är lika med antalet 2n ± 2.
2. DATA
2.
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN Individuella data för försöksdjuren bör presenteras i tabellform. Den experimentella enheten utgörs av djuret. För varje försöksdjur bör antalet celler som påträffas, antalet avvikelser per cell och procentandelen celler med strukturella kromosomavvikelser utvärderas. Antalet och frekvensen av olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas för behandlade grupper och kontrollgrupper. Luckor i DNA-strängen noteras separat och rapporteras men inkluderas inte generellt i den totala frekvensen av avvikelser. Om det inte finns några bevis för en skillnad i resultaten mellan könen, kan data från båda könen kombineras för statistisk analys.
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning i det relativa antalet celler med kromosomavvikelser eller en tydlig ökning av antalet celler som uppvisar avvikelser i en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka provtagningstillfälle. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan vara till hjälp vid utvärdering av testresultatet (6). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. En ökning av polyploidin kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inducera numeriska kromosomavvikelser. En ökning av endoreduplikationen kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inhibera cellcykelns förlopp (7) (8). En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test. Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många experiment som utförs. Positiva resultat från testet av kromosomavvikelser in vitro, indikerar att en substans inducerar kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under dessa försöksbetingelser, inte inducerar kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades. Sannolikheten för att testsubstansen eller dess metaboliter når ut till det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk toxicitet) bör diskuteras.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Testrapporten måste innehålla följande information:
Lösningsmedel/vehikel:
Motivering av valet av vehikel.
Testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt.
Försöksdjur:
Art/stam som används.
Försöksdjurens antal, ålder och kön.
Källa, förhållanden vid förvaring, diet, etc.
Individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp.
Försöksbetingelser:
Positiva och negativa kontroller (vehikel/lösningsmedel).
Data frän en undersökning av lämpligt intervall, om en sådan har utförts.
Grund för valet av dosnivå.
Uppgifter om beredningen av testsubstansen.
Uppgifter om administreringen av testsubstansen.
Grund för administreringens tillförselväg.
Metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora kretsloppet eller målvävnaden, om detta är tillämpbart.
Omvandling från koncentration av testsubstansen i diet/dricksvatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg/kroppsvikt/dag), om detta är tillämpbart.
Uppgifter om fodrets och vattnets kvalitet.
Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman.
Metoder för mätningar av toxicitet.
Identiteten hos substanser som stoppar cellcykeln i metafas, deras koncentration och behandlingens varaktighet.
Metoder för preparation av utstryksglas.
Kriterier för hur avvikelser påvisas.
Antalet celler som analyserats per försöksdjur.
Kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, negativa eller tvetydiga.
Resultat:
Tecken på toxicitet.
Mitotiskt index.
Typ av och antal avvikelser, angivna separat för varje försöksdjur.
Det totala antalet avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser.
Antal celler med avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser.
Förändringar i ploiditet, om några sådana har observerats.
Dos/responsförhållande, där så är möjligt.
Statistiska analyser, om några sådana förekommer.
Samtidiga negativa kontrolldata.
Historiska negativa kontrolldata med områden, medelvärden och standardavvikelser.
Samtidiga positiva kontrolldata.
Diskussion av resultaten.
Slutsatser.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.
HÄNVISNINGAR Adler, I. D. (1984), Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt och J. M. Parry (eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., s. 275–306. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. K. och Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189. s. 157–165. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. och Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays. In: D. J. Kirkland (ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141. Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H. Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Simada, H., Sutou, S. och Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, s. 305–312. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker. G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. och Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, s. 313–319. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. och Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Comntittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part. III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, s. 184–232. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, s. 403–413. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, s. 1362–1364.
B.12 MUTAGENICITET – TEST AV MIKROKÄRNOR IN VIVO I ERYTROCYTER HOS DÄGGDJUR
B.12
1. METOD Denna metod är en kopia av testet OECD TG 474, Test av mikrokämor i erytrocyter hos däggdjur (Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test [1997]).
1.
1.1 INLEDNING Testet av mikrokärnor in vivo hos däggdjur används för detektion av sådana skador på kromosomer eller på den mitotiska apparaten hos erytroblaster som induceras av testsubstansen, genom analys av erytrocyter från provtagning på benmärg och/eller perifert blod från djurceller, vanligtvis gnagare. Avsikten med testet av mikrokärnor är att identifiera substanser som orsakar cytogen skada, vilket resulterar i bildning av mikrokärnor som innehåller isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer. När en erytroblast från benmärg utvecklas till en polykromatisk erytrocyt stöts huvudkärnan ut. Varje mikrokärna som har bildats kan bli kvar i den annars kärnfria cytoplasman. Visualisering av mikrokärnor underlättas i dessa celler eftersom de saknar en huvudkärna. En ökning av frekvensen av polykromatiska erytrocyter med mikrokärnor hos behandlade försöksdjur utgör en indikation på inducerade kromosomskador. Benmärg från gnagare används rutinmässigt i detta test eftersom polykromatiska erytrocyter produceras i sådan vävnad. Mätningen av omogna (polykromatiska) erytrocyter med mikrokärnor i perifert blod är lika acceptabelt hos alla arter där oförmågan hos mjälten att avlägsna erytrocyter med mikrokärnor har kunnat påvisas, eller som har uppvisat en adekvat sensitivitet för att detektera ämnen som orsakar strukturella eller numeriska kromosomavvikelser. Mikrokärnor kan särskiljas genom ett antal olika kriterier. Dessa innefattar identifiering av närvaron eller frånvaron av en kinetochor eller av centromer-DNA i mikrokärnor. Frekvensen av omogna (polykromatiska) erytrocyter med mikrokärnor utgör den huvudsakliga slutpunkten. Antalet mogna (normokromatiska) erytrocyter i perifert blod som innehåller mikrokärnor bland ett givet antal mogna erytrocyter kan även användas som slutpunkt på undersökningen, när försöksdjur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller längre. Detta test av mikrokärnor in vivo på däggdjur är särskilt relevant för att fastställa mutagena risker, eftersom det möjliggör överväganden av faktorer för in vivo metabolism, farmakokinetik och processer för DNA-reparationer, även om sådana faktorer kan variera mellan olika arter, vävnader och genetiska slutpunkter. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av en mutagen effekt, med detektion i ett in vitro-system. Om det finns bevis för att testsubstansen eller en reaktiv metabolit inte kommer att nå målvävnaden, är det inte lämpligt att använda detta test. Se även Allmän inledning, del B.
1.2 DEFINITIONER centromer (Kinetochor): delar av en kromosom till vilka spindelfibrer är fästa under celldelning, vilket ger upphov till en ordnad rörelse av dotterkromosomerna mot dottercellernas poler. mikrokärnor: små extra kärnor som är separata från cellernas huvudkärna, och som produceras under mitosens telofas (meios) från isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer. normokromatisk erytrocyt: mogna erytrocyter som saknar ribosomer och som kan särskiljas från omogna polykromatiska erytrocyter genom infärgning som är selektiv för ribosomer. pofykromalisk erytrocyt: omogen erytrocyt, i ett intermediärt utvecklingsstadium, vilken fortfarande innehåller ribosomer och därför kan särskiljas från mogna, normokromatiska erytrocyter genom infärgning som är selektiv för ribosomer.
1.3 TESTMETODENS PRINCIP Försöksdjur bör exponeras för testsubstansen på ett lämpligt sätt. Om benmärg används, bör försöksdjuren avlivas vid lämpliga tider efter behandling, varvid benmärg extraheras, preparationer görs och färgas in (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). När perifert blod används, samlas blodet upp vid lämpliga tidpunkter efter behandling och utstrykspreparationer görs, vilka sedan färgas in (4) (8) (9) (10). Vid undersökningar med perifert blod, bör det gå så kort tid som möjligt mellan den sista exponeringen och skörden av cellerna. Preparationerna analyseras med avseende på närvaron av mikrokärnor.
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Förberedelser
1.4.1
1.4.1.1 Val av djurarter Råttor, möss och kinesiska hamstrar används vanligen, även om vilket lämpligt däggdjur som helst kan användas. Vid användning av perifert blod rekommenderas möss. Det är emellertid även möjligt att använda andra däggdjursarter, förutsatt att det är en art där mjälten inte avlägsnar erytrocyter med mikrokärnor eller en art som har uppvisat en adekvat känslighet när det gäller att detektera ämnen som kan orsaka strukturella eller numeriska kromosomavvikelser. Vanligt använda laboratoriestammar av unga, friska försöksdjur bör komma i fråga. Vid undersökningens början bör viktskillnaden mellan försöksdjuren vara minimal och inte överskrida + 20 % av medelvikten för varje kön.
1.4.1.2 Förhållanden vid förvaring och utfodring De generella förhållanden som anges i den allmänna inledningen till del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 50-60 %.
1.4.1.3 Förberedelse av djuren Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren ska ha en unik identifiering. De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar.
1.4.1.4 Beredning av doser Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.
1.4.2 Försöksbetingelser
1.4.2
1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Det rekommenderas att, därhelst det är möjligt, man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.
1.4.2.2 Kontroller Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) bör ingå för varje test. Förutom behandling med testsubstansen, bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på ett identiskt sätt i förhållande till djuren i de grupper där behandling skett. Positiva kontroller bör ge mikrokärnor in vivo vid de exponeringsnivåer som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till bakgrunden. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga, men att identiteten hos kodade utstryksglas inte omedelbart avslöjas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen och att provtagning endast sker vid ett enstaka tillfälle. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier kan dessutom övervägas när dessa finns tillgängliga. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser. Substans CAS-nummer EINECS-nummer Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 N-etyl-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Cyklofosfoamid Cyklofosfoamidmonohydrat 50-18-0 6055-19-2 200-015-4 Trietylenmelamin 51-18-3 200-083-5 Negativa kontroller, behandlade enbart med lösningsmedel eller vehiklar, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte acceptabel variabilitet och frekvens hos celler med kromosomavvikelser hos djuren kan erhållas ur historiska kontrolldata. Om enstaka provtagningar används för negativa kontroller, är den lämpligaste tiden det första provtagningstillfället. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas om det inte finns historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln. Om perifert blod används, kan även ett prov taget innan behandlingen påbörjas vara acceptabelt som en samtidig negativ kontroll, men endast för de korta perifera undersökningarna av blod (t.ex. 1–3 behandling(ar)) när resulterande data ligger inom det förväntade området för den historiska kontrollen.
1.5 FÖRFARANDE
1.5
1.5.1 Försöksdjurens antal och kön Varje behandlad grupp samt kontrollgruppen måste bestå av minst 5 analyserbara djur av varje kön. Det räcker med att testa enbart det ena könet, om det vid tiden för undersökningens genomförande finns data tillgängliga från undersökningar av samma art och där man har använt sig av samma exponeringssätt, så att det går att visa att det inte finns några substantiella skillnader i toxicitet mellan könen. I de fall där exponering för kemikalier hos människa kan vara könsspecifik, vilket t.ex. kan vara fallet för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön.
1.5.2 Behandlingsschema Inget standardiserat behandlingsschema (t.ex en, två eller flera behandlingar med 24 timmars intervall) kan rekommenderas. Proverna från utökade doseringsscheman är acceptabla så länge som en positiv effekt har demonstrerats för denna typ av undersökning eller, för en negativ undersökning, så länge som toxicitet har påvisats eller gränsvärdesdosen har använts, och doseringen fortsatte tills det var dags för provtagning. Testsubstanser kan även administreras i form av en delad dos, dvs. två behandlingar under en och samma dag med högst några timmars intervall, för att på så sätt underlätta administrering av stora volymer med material. Testet kan utföras på två sätt Prover kan dessutom tas vid andra tidpunkter när detta är lämpligt.
1.5.2 a)
Försöksdjur behandlas en gång med testsubstansen. Prover på benmärg tas ut minst två gånger, med början tidigast 24 timmar och senast 48 timmar efter behandling, och med lämpliga intervall mellan proven. Om prover tas tidigare än 24 timmar efter behandling bör detta motiveras. Prover på perifert blod tas ut minst två gånger, med början tidigast 36 timmar efter behandling, och i lämpliga intervall efter det första provet, men inte senare än efter 11 timmar. När ett positivt svar identifieras vid ett provtagningstillfälle, så är ytterligare provtagning inte nödvändig.
b)
Om två eller flera dagliga behandlingar utförs (t.ex. två eller flera behandlingar med 24 timmars intervall), bör prover tas ut en gång mellan 18 och 24 timmar efter den slutliga behandlingen av benmärgen och en gång mellan 36 och 48 timmar efter den slutliga behandlingen av det perifera blodet (12).
1.5.3 Dosnivåer Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen (13). Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första provtagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett område som sträcker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid senare provtagningstillfällen räcker det med att endast den högsta dosen används. Den högsta dosen definieras som den dos som producerar tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret dör. Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undantag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas från fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i benmärgen (t.ex. en reduktion av andelen omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter i benmärgen eller i perifert blod).
1.5.4 Limit-test En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara nödvändig om ett test på en dosnivå på minst 2000 mg/kg kroppsvikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. För undersökningar med en längre varaktighet ligger gränsdosen på 2000 mg/kg/kroppsvikt/dag vid behandlingar upp till 14 dagar, och på 1000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behandlingar som varar längre än 14 dagar. Förväntad exponering av människor kan utgöra en indikation på behovet av att använda en högre dosnivå i ett limit-test.
1.5.5 Administrering av doser Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intraperitoneal injektion. Andra tillförselvägar för exponering kan vara acceptabla där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan administreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är högre än dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva substanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en justering av koncentrationen för att säkerställa att volymen är konstant vid alla dosnivåer.
1.5.6 Beredning av benmärg/blod Benmärgsceller erhålls vanligen från lårbenet eller skenbenet omedelbart efter det att djuret avlivats. Normalt avlägsnas cellerna från lårbenet eller skenbenet, prepareras och färgas in med hjälp av etablerade metoder. Perifert blod erhålls från svansvenen eller någon annan lämplig blodåder. Blodceller färgas omedelbart in supravitalt (8) (9) (10) eller så görs utstrykspreparationer vilka sedan färgas in. Användningen av ett DNA-specifikt färgämne (t.ex. akridinorange (14) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) kan eliminera några av de artefakter som ar associerade med användning av ett färgämne som inte är DNA-specifikt. Denna fördel utesluter inte användningen av konventionella färgämnen (t.ex. Giemsa). Ytterligare system (t.ex. cellulosakolonner för att avlägsna celler med kärnor (16)) kan även användas, förutsatt att dessa system har visat sig fungera på ett adekvat sätt vid preparation av mikrokärnor i laboratoriet.
1.5.7 Analys Andelen omogna erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter (omogna + mogna) bestäms för varje djur genom att totalt räkna minst 200 erytrocyter för benmärg och 1000 erytrocyter för perifert blod (17). Alla utstryksglas, inklusive de från positiva och negativa kontroller, bör ges en oberoende kodning innan analys i mikroskop utförs. Minst 2000 omogna erytrocyter per djur undersöks med avseende på förekomst av omogna erytrocyter med mikrokärnor. Ytterligare information kan erhållas genom att söka efter mogna erytrocyter med mikrokärnor. Vid analys av utstryksglas bör antalet omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter inte vara mindre än 20 % av kontrollvärdet. När djur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller mer kan även minst 2000 mogna erytrocyter per djur undersökas med avseende på förekomst av mikrokärnor. System för automatiserad analys (bildanalys och flödescytometri av cellsuspensioner) är acceptabla alternativ till manuell utvärdering om lämplig verifiering och validering sker.
2. DATA
2.
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN Individuella data från försöksdjur bör presenteras i tabellform. Den experimentella enheten utgörs av försöksdjuret. Antalet omogna erytrocyter som påträffas, antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, och antalet omogna bland det totala antalet erytrocyter bör listas separat för varje djur som analyseras. När försöksdjur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller mer, bör data över mogna erytrocyter också presenteras, om dessa har samlats in. Andelen omogna erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter och, om det anses tilllämpligt, procentandelen av erytrocyter med mikrokärnor, bör anges för varje försöksdjur. Om det inte finns några bevis för en skillnad i resultaten mellan könen, kan data från båda könen kombineras för statistisk analys.
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning av antalet celler med mikrokärnor eller en tydlig ökning av antalet celler med mikrokärnor hos en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka provtagningstillfälle. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärdering av testresultatet (18) (19). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test. Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger experimentet upprepas. Positiva resultat i testet av mikrokärnor tyder på att substansen inducerar mikrokärnor som är ett resultat av en kromosomal skada eller skada på den mitotiska apparaten i erytroblasterna hos den art som testas. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under dessa försöksbetingelser, inte ger upphov till mikrokärnor i de omogna erytrocyterna hos den art som testas. Sannolikheten för att testsubstansen eller någon av dess metaboliter ska nå ut i det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk toxicitet) bör diskuteras.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Testrapporten måste innehålla följande information:
Lösningsmedel/vehikel:
motivering för valet av vehikel
testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt
Försöksdjur:
art/stam som används
försöksdjurens antal, ålder och kön
källa, förhållanden vid förvaring, diet, etc.
individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp
Försöksbetingelser:
positiva och negativa kontrolldata (vehikel/lösningsmedel)
data från en undersökning av spännvidden, om en sådan har utförts
grund för valet av dosnivå
uppgifter om beredningen av testsubstansen
uppgifter om administreringen av testsubstansen
grund för det sätt administreringen sker på
metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora kretsloppet eller målvävnaden, om detta är tillämpbart
omvandling av koncentrationen för testsubstansen i diet/dricksvatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg/kroppsvikt/dag), om detta är tillämpbart
fodrets och vattnets kvalitet
detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman
metoder för preparation av utstryksglas
metoder för mätningar av toxicitet
kriterier för bestämning av omogna erytrocyter med mikrokärnor
antalet analyserade celler per djur
kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, negativa eller tvetydiga
Resultat:
tecken på toxicitet
andelen omogna erytrocyter av det totala antalet erytrocyter
antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, angett separat för varje djur
medelvärde ± standardavvikelse för omogna erytrocyter med mikrokärnor per grupp
dos/responsförhållande, närhelst detta är möjligt
statistiska analyser och metoder som används
samtidiga och historiska negativa kontrolldata
samtidiga positiva kontrolldata
Diskussion av resultaten.
Slutsatser.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.
HÄNVISNINGAR Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, s. 187–190. Schmid, W. (1975), The micronucleus Test, Mutation Res., 31, s. 9–15. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123. s. 61–118. Mavourmin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, s. 29–80. MacGregor, J. T., Schlegel, R. Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, s. 555–558. MacGregor,). T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res., 189: s. 103–112. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Selby, M. E. (1990), the In vivo Erythrocyte Micronuc- leus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14, s. 513–522. Hayashi, M., Morita, T., Kodarna, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, s. 245–249. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus Test Wirth Morse Perip heral Blood Erythrocytes by Acridine Orange supravital Staining: The Summary Report of the 5th Col laborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res. 278, s. 83–98. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, s. 153–159. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), In vivo Rodent Eryth rocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, s. 293–304. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, s. 313–319. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doc, J., Esdaile, D.]., Gatehouse, D. G., Hodson- Walker, G., Morton, D. B.. Kirkland. D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, s. 313–319. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Stai ning to the micronucleus Test. Mutation Res. 120, s. 241–247. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, s. 269–275. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res. 213, s. 91–104. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, s. 97–99. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay. In: D. J. Kirkland (ed) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures.UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Sydney, s. 115–141. Loveli, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D. J. Kirkland (cd) Statistical Evaluation oj Mutagenicity Test Dala. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184–232.
B.13/14 MUTAGENICITET – TEST AV ÅTERMUTATION HOS BAKTERIER
B.13/14
1. METOD Denna metod är en kopia av OECD TG 471, Omvänt bakteriellt mutationstest (Bakterial Reserve Mutation Test (1997)).
1.
1.1 INLEDNING 1 detta test av återmutation hos bakterier används aminosyraberoende stammar av Salmonelle typhimurium och Escherichia coli för att detektera punktmutationer, vilka innefattar substitution, addition eller deletion av ett eller några DNA-baspar (1) (2) (3). Testet bygger på principen att man detekterar mutationer som gör att redan existerande mutationer i teststammarna går tillbaka varvid den funktionella förmågan hos bakterierna att syntetisera en essentiell aminosyra återställs. De återmuterade bakterierna detekteras på grundval av sin förmåga att växa i frånvaro av den aminosyra som krävs hos den ursprungliga teststammen. Punktmutationer är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människor och mycket tyder på att punktmutationer i onkogener och suppressorgener för tumörer i somatiska celler är inblandade i bildning av tumörer hos människor och försöksdjur. Testet av återmutation hos bakterier är snabbt, billigt och relativt enkelt att utföra. Många av testarterna har ett flertal egenskaper som gör dem mera känsliga för detektion av mutationer inklusive responsiva DNA-sekvenser vid reversionssäten, ökad cellerpermeabilitet för stora molekyler och eliminering av reparationssystem för DNA eller förstärkning av felbenägna reparationsprocesser för DNA. Specificiteten hos teststammarna kan erbjuda en del nyttig information om de typer av mutationer som induceras av genotoxiska ämnen. En mycket stor databas med resultat för ett stort antal olika strukturer finns tillgänglig för tester av återmutation hos bakterier och väletablerade metoder har utvecklats för testning av kemikaler med olika fysisk-kemiska egenskaper, inklusive flyktiga ämnen. Se även Allmän inledning, del B.
1.2 DEFINITIONER ett test av återmutation hos antingen Salmonella typhimurium eller Escherichia coli detekterar mutation i en aminosyraberoende stam (histidin respektive tryptofan), vilket ger en stam som är oberoende av en extern tillförsel av aminosyror. mutagener som ger basparsubstitutioner är ämnen som orsakar en basförändring i DNA. I ett test av återmutation kan denna förändring uppträda vid sätet för den ursprungliga mutationen eller på ett andra säte i det bakteriella genomet. mutagener som ger förskjutningar (frameshift) är ämnen som orsakar addition eller deletion av ett eller flera baspar i DNA, vilket då ger en ändrad avläsningsordning i RNA.
1.3 INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN Testet av återmutation hos bakterier utnyttjar prokaryota celler, vilka skiljer sig från däggdjursceller med avseende på sådana faktorer som upptag, metabolism, kromosomstruktur och processer för DNA-reparation. Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att det finns en yttre källa för metabolisk aktivering. Hos system för metabolisk aktivering in vitro kan inte förhållandena för däggdjur in vivo efterliknas helt och hållet. Testet ger därför ingen direkt information om den mutagena och den karcinogena potensen hos en substans i däggdjur. Testet av återmutation hos bakterier används vanligen som en inledande undersökning av genotoxisk aktivitet och, i synnerhet, av aktivitet som inducerar punktmutationer. En omfattande databas har demonstrerat att många kemikalier som ger positiva resultat i detta test även uppvisar mutagen aktivitet i andra tester. Det finns exempel på mutagena ämnen som inte kan detekteras med hjälp av detta test. Skälen till dessa tillkortakommanden kan tillskrivas den specifika naturen hos den detekterade slutpunkten, skillnader i metabolisk aktivering, eller skillnader i biotillgänglighet. Å andra sidan kan faktorer som höjer känsligheten hos testet leda till en överskattning av den mutagena aktiviteten. Testet av återmutation hos bakterier kan visa sig olämpligt för utvärdering av vissa klasser av kemikalier såsom starkt baktericida ämnen (t.ex. vissa antibiotika) och de som anses (eller är kända för att) interferera specifikt med systemet för cellreplikation hos däggdjur (t.ex. vissa inhibitorer av topoisomeras och vissa nukleosidanaloger). 1 sådana fall kan mutationstester på däggdjur vara mera lämpliga. Även om många ämnen som ger positiva resultat i detta test är karcinogena för däggdjur, är korrelationen inte absolut. Den är beroende på kemisk klass och det finns karcinogener som inte kan detekteras med hjälp av detta test, eftersom de verkar genom andra, icke-genotoxiska mekanismer eller mekanismer som saknas i bakterieceller.
1.4 TESTMETODENS PRINCIP Suspensioner med bakterieceller exponeras för testsubstansen i närvaro och i frånvaro av ett exogent system för metabolisk aktivering. 1 plattinkorporeringsmetoden blandas dessa suspensioner med en toppskiktsagar varpå plattor omedelbart görs på minimalmedium. I preinkubationsmetoden inkuberas behandlingsblandningen och sedan blandas denna med en toppskiktsagar innan plattor görs på minimalmedium. I båda metoderna räknas återmuterade kolonier efter två eller tre dagars inkubering och jämförs med antalet spontant återmuterade kolonier på kontrollplattor med lösningsmedel. Ett flertal procedurer för att utföra testet av återmutation hos bakterier har beskrivits. Bland de som vanligtvis används ingår plattinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4), preinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktue-ringsmetoden (9) (10) och suspensionsmetoden (11). Modifikationer för testning av gaser eller ångor har tidigare beskrivits (12). De procedurer som beskrivs i metoden hänför sig primärt till plattinkorporerings- och preinkubationsmetoder. Inga av dem är acceptabla för att genomföra experiment både med och utan metabolisk aktivering. Vissa substanser kan detekteras mer effektivt med hjälp av preinkubationsmetoden. Dessa substanser tillhör kemiska klasser som innefattar korta kedjor med alifatiska nitrosaminer, tvåvärda metaller, aldehyder, azofärger och diazoföreningar, pyrolizidinalkoloider, allylföreningar och nitroföreningar (3). Det är även känt att vissa klasser av mutanter inte alltid detekteras med hjälp av standardprocedurer såsom plattinkorporeringsmetoden eller preinkubationsmetoden. Dessa bör uppfattas som speciella fall och det rekommenderas varmt att alternativa procedurer används för detektionen av dem. De följande speciella fallen bör identifieras (tillsammans med exempel på procedurer som kan användas för detektionen av dem): azofärger och diazoföreningar (3) (5) (6) (13), gaser och flyktiga kemikaler (12) (14) (15) (16) samt glykosider (17) (18). En avvikelse från standardproceduren måste vara vetenskapligt motiverad.
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.5
1.5.1 Förberedelser
1.5.1
1.5.1.1 Bakterier Nya kulturer med bakterier bör få växa till sig fram till den sena exponentiella eller tidiga stationära tillväxtfasen (ungefär 109 celler per ml). Kulturer som befinner sig i sen stationär fas bör inte användas. Det är viktigt att de kulturer som används i experimentet har en hög tider med livsdugliga bakterier. Titern kan fås fram antingen ur tillväxtkurvor från historiska kontrolldata, eller ur varje försök genom att bestämma antalet livsdugliga celler med hjälp av ett utstrykningsexperiment. Den rekommenderade inkubationstemparaturen är 37 oC. Minst fem bakteriestammar bör användas. Dessa bör inkludera fyra av S. typhimurium (TA 1535; Ta 1537 eller TA97a eller TA97; TA9S; och TA100) som har visat sig vara tillförlitliga och ge en reproducerbar respons i olika laboratorier. Dessa fyra stammar av S, typhimurium har GC-baspar vid det primära återmutationsstället och det är känt att de inte kan detektera vissa oxiderande mutagener, tvärbindande ämnen och hydraziner. Sådana substanser kan detekteras med hjälp av E. coli WP2-stammar eller S. typhimurium TA 102 (19) som har ett AT-baspar vid det primära återmutationsstället. Den rekommenderade kombinationen av stammar är därför: Fär att kunna detektera tvärbindande mutagener kan det vara lämpligt att inkludera TA102 eller att också använda en DNA-reparationsduglig stam av E. coli (t.ex. E.coli WP2 eller E. coli WP2 (pKM101)). Etablerade procedurer för beredning av baskulturer, markörverifiering och lagring bör användas. Behovet av aminosyror för tillväxten bör påvisas för varje frusen preparation av baskulturer (histidin för stammar av S. typhimurium och tryptofan för stammar av E. coli). Andra fenotypiska karakteristika bör kontrolleras på liknande sätt, nämligen närvaron eller frånvaron av R-faktorplasmider där detta är lämpligt (dvs. ampicillin-resi-stens i stammarna TA98, TA100 och TA97a eller TA97, WP2 uvrA och WP2 uvrA (pKM101) och ampicillin + tetracyklinreststens i stammen TA102); närvaron av karakteristiska mutationer (dvs. rfa-mutation i S. typhimurium genom känslighet för kristallviolett och uvrA-mutation i E. coli eller uvrB-mutation i S. typhimurium genom känslighet för ultraviolett ljus) (2) (3). Stammarna bör även ge spontant återmuterande platträkningar av kolonier inom de frekvensområden som kan förväntas från laboratoriets historiska kontrolldata och helst inom det område som rapporteras i litteraturen.
S. lyphimurium TA 1535,
S. typhimurium TA1537 eller TA97 eller TA97a,
5. typhimuriurn TA98,
S. typhimurium TA100, och
E. coli WP2 uvrA, eller C. coli WP2 uvrA (pKM101), eller S. typhimurium TA102.
1.5.1.2 Medium Använd en lämplig minimalagar (t.ex. innehållande Vogel-Bonner minimalmedium E och glukos) och ett agartoppskikt som innehåller histindin och biotin eller tryptofan, så att några stycken celldelningar ska kunna ske (1) (2) (9).
1.5.1.3 Melabolisk aktivering Bakterier bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro av ett lämpligt system för metabolisk aktivering. Det vanligaste systemet som används är en post-mitokondriell fraktion där en kofaktor tillsatts (S9) vilken beretts ur lever från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (1) (2) eller en kombination av fenobarbiton och β-naftoflavon (18) (20) (21). Den post-mitokondriella fraktionen används vanligen vid koncentrationer i området från 5 till 30 % v/v i S9-blandningen. Valet av och betingelserna hos ett system för metabolisk aktivering kan bero på den klass av kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den postmitokondriella fraktionen. För azofärger och diazoämnen, kan användning av ett reduktivt system för metabolisk aktivering vara lämpligare (6) (13).
1.5.1.4 Beredning av testsubstansen Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om detta är lämpligt, före det att bakterierna behandlas. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till testsystemen och/eller spädas ut före behandling. Nygjorda beredningar bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras. Lösningsmedel/vehiklar bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen och bör vara förenliga med bakteriernas överlevnad samt S9-aktivitet (22). Om man använder andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Därhelst det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar.
1.5.2 Försöksbetingelser
1.5.2
1.5.2.1 Teststammar (se 1.5.1.1)
1.5.2.2 Exponeringskoncentration Cytotoxiciteteri och lösligheten i den slutliga behandlingsblandningen är några av de kriterier som man måste ta hänsyn till vid bestämningen av den högsta mängd av testsubstansen som ska användas. Det kan vara bra att bestämma toxicitet och löslighet i ett förberedande experiment. Cytotoxicitet kan detekteras genom en minskning av antalet återmuterande kolonier, en uttunning eller minskning av bakgrundstillväxten, eller graden av överlevnad hos de behandlade kulturerna. Cytotoxiciteten hos en substans kan ändras i närvaro av system för metabolisk aktivering. Olöslighet bör fastställas som en utfällning i den slutliga blandningen, under de verkliga försöksbetingelserna och ska vara synlig för blotta ögat. Den maximala rekommenderade testkoncentrationen för lösliga icke-cytotoxiska substanser är 5 mg/platta eller 5 μl/platta. För icke-cytotoxiska substanser som inte är lösliga vid 5 mg/platta eller 5 μl/platta, bör en eller flera av de koncentrationer som testas vara olösliga i den slutliga behandlingsblandningen. Testsubstanser som är cytotoxiska redan under 5 mg/platta eller 5 μl/platta bör testas upp till en cytotoxisk koncentration. Fällningen torde inte störa bestämningen. Minst fem olika analyserbara koncentrationer av testsubstansen bör användas, med ungefär halva log-intervall (dvs. √10) mellan testpunkterna för ett inledande experiment. Mindre intervall kan vara lämpliga när ett koncentrationssvar håller på att undersökas. Testning över en koncentration på 5 mg/platta eller 5 μl/platta kan övervägas vid utvärdering av substanser som innehåller avsevärda mängder av potentiellt mutagena föroreningar.
1.5.2.3 Negativa och positiva kontroller Samtidiga stamspecifika positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller vehikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje försök. Positiva kontrollkoncentrationer som visar på det effektiva utfallet för varje försök bör väljas. För försök där ett system för metabolisk aktivering används, bör den positiva kontrollreferenssubstansen väljas på basis av de typer av bakteriestammar som används. De följande substanserna utgör exempel på lämpliga positiva kontroller för försök med metabolisk aktivering: Substans CAS-nummer EINECS-nummer 9,10-dimetylantracen 781-43-1 212-308-4 7,12-dimetylbensantracen 57-97-6 200-359-5 bens[a]pyren 50-32-8 200-028-5 2-aminoantracen 613-13-8 210-330-9 Cyklofosfoamid 50-18-0 200-015-4 Cyklofosfoamidmonohydrat 6055-19-2 Höljande substans är en lämplig positiv kontroll for den reduktiva metaboliska aktiveringsmetoden: Substans CAS-nummer EINECS-nummer kongorött 573-58-0 209-358-4 2-aminoantracen bör inte användas som den enda indikatorn på effektiviteten hos S9-blandningen. Om 2-aminoanracen används, bör varje sats av S9 även karakteriseras med en mutagen som kräver metabolisk aktivering med hjälp av mikrosomala enzymer, t.ex. bens[a]pyren, dimetylbensantracen. Följande substanser utgör exempel på sortspecifika positiva kontroller för försök som utförs utan exogena system för metabolisk aktivering: Substans CAS-nummer EINECS-nummer Stam Natriumazid 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 och TA 100 2-nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoakridin 90-45-9 201-995-6 TA 15 37, TA 97 och TA 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 och TA 97a Kumenhydroperoxid 80-15-9 201-254-7 TA 102 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA och TA 102 N-etyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA och WP2uvrA (pKM101) 4-nitroquinolin-1 -oxid 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA och WP2uvrA (pKM101) Furylfuramid (AF2) 3688-53-7 plasmidinnehållande stammar Andra lämpliga positiva kontrollreferenssubstanser kan användas. Användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas när sådana finns att tillgå. Negativa kontroller, bestående av enbart lösningsmedel eller vehikel, utan testsubstans, och i övrigt hanterade på samma sätt som för de behandlade grupperna, bör inkluderas. Obehandlade kontroller bör dessutom även användas, om det inte finns historiska kontrolldata som visar att inga farliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.
1.5.3 Förfarande Vid plattinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4), utan metabolisk aktivering, blandas vanligen 0,05 ml eller 0,1 ml av testlösningarna, 0,1 ml av färsk bakteriekultur (innehållande ungefär 108 livsdugliga celler) och 0,5 ml av steril buffert med 2,0 ml av toppskiktsagar. För ett försök med metabolisk aktivering blandas vanligen 0,5 ml av en metabolisk aktiveringsblandning, vilken innehåller en adekvat mängd postmitokondriell fraktion (i området från 5 till 30 % v/v i den metaboliska aktiveringsblandningen) med toppskiktsagar (2,0 ml), tillsammans med bakterierna och testsubstansen/testlösningen. Innehållet i varje rör blandas och hälls över ytan på en minimalagarplatta. Toppskiktsagarn tillåts att stelna innan inkubering sker. För förinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6), förinkuberas testsubstansen/testlösningen med teststamman (innehållande ungefär 108 livsdugliga celler) och steril buffert eller med system för metabolisk aktivering (0,5 ml), vanligen under 20 minuter eller längre vid 30–37 oC, innan den blandas med toppskiktsagarn och hälls uppå ytan på en minimalagarplatta. Vanligen blandas 0,05 eller 0,1 ml av testsubstansen/testlösningen, 0,1 ml bakterier och 0,5 ml av S9-blandningen eller steril buffert blandat med 2,0 ml av toppskiktsagar. Rören bör luftas under förinkubationen med hjälp av en skakmaskin. För att möjliggöra en rimlig uppskattning av variationen bör tre plattor användas vid varje dosnivå. Användning av två plattor är acceptabelt när detta är vetenskapligt motiverat. Förlust av en enstaka platta innebär inte nödvändigtvis att ett försök blir ogiltigt. Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med lämpliga metoder, såsom i slutna kärl (12) (14) (15) (16).
1.5.4 Inkubering Alla plattor i en given assay bör inkuberas vid 37 oC under 48–72 timmar. Efter inkubationsperioden räknas antalet återmuterande kolonier per plattor.
2. DATA
2.
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN Data bör presenteras som antalet återmuterande kolonier per platta. Antalet återmuterande kolonier på såväl negativa (lösningsmedelskontroll och obehandlad kontroll, om en sådan används) och positiva kontrollplattor bör även anges. Individuella platträkningar, medelantalet för de återmuterande kolonierna per platta och standardavvikelsen bör uppges för såväl testsubstansen som för positiva och negativa (obehandlade och/eller (lösningsmedels) kontroller). Der finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt svar. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. Negativa resultat måste bekräftas från fall till fall. I de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta negativa resultat bör detta motiveras. Vid uppföljningsexperiment bör man överväga att ändra parametrarna i undersökningen för att utvidga de bedömda försöksbetingelserna. De försöksparametrar som skulle kunna modifieras innefattar koncentrationsindelningen, metoden för behandling (plattinkorporering eller förinkubation i vätska), och betingelser för metabolisk aktivering.
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning över hela det testade området och/eller en reproducerbar ökning, vid en eller flera koncentrationer, av antalet återmuterande kolonier per platta för minst en stam, med eller utan ett system för metabolisk aktivering (23). Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärdering av testresultatet (24). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om svaret är positivt En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test. Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, kan uppsättningen av data i sällsynta fall göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger experimentet upprepas. Positiva resultat från testet av återmutation hos bakterier indikerar att substansen inducerar punktmutationer genom bassubstitutioner eller förskjutningar i genomet hos antingen Salmonella typhimurium och/eller Escheri-chia coli. Negativa resultat indikerar att testsubstansen inte är mutagen hos den testade sorten under dessa försöksbetingelser.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Följande information måste ingå i testrapporten:
Lösningsmedel/vehikel:
motivering för valet av lösningsmedel/vehikel
testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt,
Stammar:
stammar som används
antalet celler per kultur
karakteristika för stammen
Försöksbetingelser:
mängd av testsubstansen per platta (mg/platta eller μl/platta) med grund för val av dos och antal plattor per koncentration
använda medier
typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier
behandlingsprocedurer
Resultat:
tecken på toxicitet
tecken på utfällning
individuella platträkningar
medelantalet återmuterande kolonier per platta och standardavvikelse
dos/respons-förhållande, där detta är möjligt
statistiska analyser, om några sådana finns
samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser
historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser
Diskussion av resultaten.
Slutsatser.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.
HÄNVISNINGAR Ames, B. N., McCann,). and Yamasaki E. (1975), Metods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenitic Test. Mutation Res., 31, s. 347–364. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. MutationRes. 113, s. 173–215. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke. E., Kier, L. Matsushima, T. Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res. 312, s. 217–23 3. Kier, L. D. , Brusick I., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M, Simmon, V. R, dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mam malian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 168, s. 69–240. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y. , Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, s. 91–96. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, s. 273–285. Gatehouse, D. G., Rowland, 1. R., Wilcox. P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicily Tests: UKEMS Part I Revised. ed. D.). Kirkland, Cambridge University Press, s. 13–61. Aeschacher, H. U., Wolleb. U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. l:ood Safety, 8, s. 167–177. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, s. 33–42. Hubbard, S. A., Green, M. H. L, Gatehouse, D. and Bridges,]. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, cd. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, s. 141–161. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella lyphimuriurn, Environmental Mutagenesis. 3, s. 453–465. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, s. 335–344. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, s. 33–47. Zeiger, E., Anderson. B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, s. 2–141. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Ams terdam, s. 249–258. Hughes, T.)., Simmons, D. M, Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, EnvironmenlalMutagenesis, 9, s. 421–441. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, s. 3780–3782. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Arnes, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci,. USA, 77, s. 4961–4965. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.). and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, s. 285–291. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: in vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. (. de Serres et al. Elsevier, North Holland, s. 85–88. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175–177. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Arnes, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, s. 343–350. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, s. 83–91. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L, Middleton, B., Mitchel. I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for MutagenicityTesting. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Dala, ed. Kirkland, D.]., Cambridge University Press, s. 28–65.
B. 15 MUTAGENICITETSTEST OCH SCREENING FÖR CANCEROGENICITET GENMUTATION – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
B. 15
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B
1.2 DEFINITION Se allmän inledning till del B.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP En rad olika haploida och diploida stammar av jästen Saccaromyces cerevisiae kan användas vid undersökning av genmutationer, som induceras av kemiska ämnen med och utan metabolisk aktivering. Man har använt framåtmutationssystem med haploida stammar vid t.ex. bestämning av mutation från röda, adeninberoende mutanter (ade-1, ade-2) till dubbelt adeinberoende vita mutanter och selektiva system t.ex. induktion av canavanin-resistens och cycloheximid-resistens. De bäst validerade tillbakamutationssystemen bygger på användning av den haploida stammen XV 185-14C, som är bärare av de ockra nonsensmutationerna ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 och trp 5-48, som tillbakamuterar med basparsubstitutionsmutagener, som inducerar punktmutationer eller ockra suppressormutationer. XV 185-14C är också bärare av bis 1-7 markören som är en missensemutation som huvudsakligen tillbakamuterar vid mutationer i andra loci, och markören bom 3-10 som tillbakamuterar med frameshift-mutagener. I diploida stammar av Saccaromyces cerevisiae är D7 som är homozygot för ilv 1-92, den enda med omfattande användning.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6 Förberedelser
Lösningar av testämne och kontrollämne framställs omedelbart före försöket med hjälp av en passande vehikel. Om organiska kemiska förbindelser som inte går att lösa i vatten används, bör organiska lösningsmedel som etanol, aceton eller dimetylsulfoxid (DMSO) användas i koncentrationer på upp till 2 % v/v. Koncentrationen av vehiklen bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft eller växtegenskaper.
Metabolisk aktivering
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem. Det mest använda systemet består av en post-mitokondrial fraktion som kompletterats med en co-faktor, framställd från lever av gnagare som förbehandlats med enzyminducerande medel. Användningen av andra arter, vävnader, post-mitokondriala faktorer, eller förfarande kan också vara lämplig för metabolisk aktivering.
Testbetingelser
Teststammar
Den haploida stammen XV 185-14C och den diploida stammen D, är de mest vanligen använda i genmutationstester. Även andra stammar kan vara lämpliga.
Media
Vid bestämning av överlevnadsgrad och antal mutanter används lämpliga kulturmedier.
Användning av negativa och positiva kontroller
Positiva kontroller, obehandlade kontroller och kontroller med lösningsmedel ska användas jämsides. Lämpliga positiva kontrollämnen ska användas för varje enskild genetisk endpoint.
Exponeringskoncentration
Minst fem olika koncentrationer av testämnet med passande intervaller mellan koncentrationerna ska användas. För toxiska ämnen ska den högsta koncentrationen som testas inte minska överlevnadsgraden till mindre än 5–10 %. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen för löslighet med användning av lämliga förfaranden. De högsta koncentrationerna av icke-toxiska testämnen som är fritt lösliga i vatten fastställs från test till test.
Inkubationsbetingelser
Plattorna inkuberas i 4–7 dagar vid 28–30 oC i mörker.
Spontana mutationsfrekvenser
Subkulturer bör användas med spontana mutationsfrekvenser inom allmänt accepterade gränser.
Antal parallella plattor
Minst tre parallella plattor används för varje koncentration vid bestämning av prototrofer som framkommit vid genmutation, och av cellernas livskraft. När man testar markörer med, som t.ex. horn 3–10, en låg mutationsfrekvens, kan antalet plattor ökas så att en statistiskt relevant mängd data erhålls.
Testförfarande
Stammar av Saccaromyces cerevisiae exponeras normalt genom ett test i vätska som inbegriper antingen celler i stationär fas eller celler i växtfas. Inledande undersökningar bör utföras med celler i växtfas. 1-5 x 107 celler per ml exponeras för testämnet i upp till 18 timmar vid 28–37 oC under skakning. Om det behövs tillsätts en passande mängd metabolisk aktiveringssystem under exponeringen. Efter behandlingen centrifugeras och tvättas cellerna varefter de utsås på ett lämpligt kulturmedium. Efter inkubationen registreras induktionen av genmutationer och antal överlevande per platta. Om det första testet utfaller negativt bör ett andra utföras med användning av celler i stationär fas. Om det första testet utfaller positivt ska det bekräftas genom ett oberoende test.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och ange antal räknade kolonier, antal mutanter, överlevnadsfrekvens och mutationsfrekvens. Alla resultat ska bekräftas genom ett oberoende test. Utvärderingen av resultaten bör ske på grundval av en lämplig statistisk metod.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORTEN Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Använda stammar.
Testbetingelser: stationär fas eller växtceller, sammansättning av media, inkubationstemperatur och inkubationsperiod, metaboliskt aktiveringssystem.
Exponeringsbetingelser, exponeringskoncentrationer, förfarande och varaktighet, exponeringstemperatur positiva och negativa kontroller.
Antal räknade kolonier, antal mutanter, Överlevnadsfrekvens och mutationsfrekvens, förhållandet mellan dos och effekt när detta är möjligt, statistisk utvärdering av data.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B.
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B.
B.16 MITOTISK. REKOMBINATION — SACCHAROMYCES CEREVISIAE
B.16
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B.
1.2 DEFINITION Se allmän inledning till del B.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Hos Saccaromyces cerevisiae kan mitotisk rekombination mellan gener (eller mer generellt mellan en gen och dess centromer) och inom samma gen konstateras. Den förstnämnda formen kallas mitotisk överkorsning och framkallar reciproka produkter medan den andra formen för det mesta inte är reciprok och kallas genkonversion. Överkorsning bestäms normalt genom framkallande av recessiva homozygotiska kolonier eller sektorer i en heterozygotisk stam, medan genkonversion bestäms genom framkallande av prototrofa revertanter i en auxotrof heteroallelisk stam, som är bärare till olika, defekta alleler av samma gen. De mest använda stammarna vid undersökning av mitotisk genkonversion är D4 (med heteroallel ade 2 och trp 5), D7 (med heteroallel trp 5), BZ34 (med heteroallel arg 4) och JD1 (med heteroallel bis 4 och trp 5). Mitotisk överkorsning som framkallar röda och ljusröda homozygotiska sektorer kan undersökas i D5 eller i D7 (som även mäter mitotisk genkonversion och omvänd mutation av ilv 1-92), eftersom bägge stammar är heteroalleliska för att komplettera alleler av ade 2.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6 Förberedelser
Lösningar av testämne och kontroll- eller referensämne framställs omedelbart före försöket med hjälp av passande vehikel. Om organiska kemiska förbindelser som inte går att lösa i vatten används, bör organiska lösningsmedel som etanol, aceton eller dimetylsulfoxid (DMSO) användas i koncentrationer på upp till 2 % v/v. Koncentrationen av vehiklen bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft eller växtegenskaper.
Metabolisk aktivering
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem. Det vanligen använda systemet består av en post-mitokondrial fraktion som kompletterats med en co-faktor, framställd från lever av gnagare som förbehandlats med enzyminducerande medel. Användningen av andra arter, vävnader, post-mitokondriala faktorer, eller förfaranden kan också vara lämplig för metabolisk aktivering.
Testbetingelser
Teststammar
De mest vanligen använda stammarna är de diploida D4, D5, D7 och JD1. Även andra stammar kan vara lämpliga.
Media
Vid bestämning av överlevnadsgrad och mitotisk rekombination används lämpliga kulturmedier.
Användning a v negativa och positiva kontroller
Positiva kontroller, obehandlade kontroller och kontroller med lösningsmedel ska användas jämsides. Lämpliga positiva kontrollämnen ska användas för varje enskild genetisk endpoint.
Exponeringskoncentration
Minst fem olika koncentrationer av testämnet med passande intervaller mellan koncentrationerna ska användas. Här måste man ta hänsyn till faktorer som cytotoxicitet och löslighet. De lägsta koncentrationerna bör inte ha någon verkan på cellernas överlevnadsfrekvens. För toxiska ämnen ska den högsta koncentrationen som testas inte minska överlevnadsgraden till mindre än 5–10 %. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen för löslighet. Den högsta koncentrationen av icke-toxiska testämnen, som är fritt lösliga i vatten, fastställs från test till test. Celler i stationär fas eller växtfas kan exponeras för testämnet i upp till 18 timmar. Om långa exponeringsperioder används bör dock kulturerna undersökas mikroskopiskt för sporbildning vars närvaro gör testet värdelöst.
Inkubationsbetingelser
Plattorna inkuberas i 4–7 dagar vid 28–30 oC i mörker. Plattor som används för bestämning av röda och ljusröda homozygota sektorer, som framkallats genom mitotisk överkorsning, förvaras i kylskåp (ca 4 oC) i ytterligare 1-2 dagar innan räkning för att möjliggöra utveckling av lämpliga pigmenterade kolonier.
Spontana mitotiska rekombinations frekvenser
Subkulturer bör användas med spontana mutationsfrekvenser inom allmänt accepterade gränser.
Antal parallella plattor
Minst tre parallella plattor används för varje koncentration vid bestämning av prototrofer som framkommit vid genmutation, och av cellernas livskraft. När man testar recessiva homozygoter, som framkallats genom mitotisk överkorsning, ökas antalet plattor så att ett lämpligt antal kolonier erhålls.
Testförfarande
Stammar av Saccaromyces cerevisiae exponeras normalt genom test i vätska som inbegriper antingen celler i stationär fas eller celler i växtfas. Inledande undersökningar bör utföras med celler i växtfas. 1-5 x 107 celler per ml exponeras för testämnet i upp till 18 timmar vid 28–37 oC under skakning. Om det behövs tillsätts en passande mängd metabolisk aktiveringssystem under exponeringen. Efter behandlingen centrifugeras och tvättas cellerna varefter de utsås på ett lämpligt kulturmedium. I slutet av inkubationen registreras induktionen av genmutationer och antal överlevande per platta. Om det första testet utfaller negativt bör ett andra utföras med användning av celler i stationär fas. Om det första testet utfaller positivt ska det bekräftas genom ett oberoende test.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och ange antal räknade kolonier, antal rekombinanter samt rekombinationsfrekvens. Alla resultat ska bekräftas genom ett oberoende test. Utvärderingen av resultaten bör ske på grundval av en lämplig statistisk metod.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Använda stammar.
Testbetingelser: stationär fas eller växtceller, sammansättning av medier, inkubationstemperatur och inkubationsperiod, metaboliskt aktiveringssystem.
Exponeringsbetingelser, exponeringskoncentrationer, förfarande och varaktighet, exponeringstemperatur positiva och negativa kontroller.
Antal räknade kolonier, antal mutanter, överlevnadsfrekvens och mutationsfrekvens, förhållandet mellan dos och effekt när detta är möjligt, statistisk utvärdering av data.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B.
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B.
B.17 MUTAGENICITET – TEST AV GENMUTATIONER HOS DÄGGDJURSCELLER IN VITRO
B.17
1. METOD Denna metod är en kopia av OECD TG 476, Test av genmutationer hos däggdjursceller in vitro (In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997)).
1.
1.1 INLEDNING Genmutationstestet in vitro för däggdjursceller kan användas för att detektera genmutationer som inducerats med hjälp av kemiska substanser. Lämpliga cellinjer innefattar L5178Y muslymfomceller, CHO-, CHO-AS52-och V79-linjerna från kinesiska hamsterceller och TK6 lymfoblastoidceller från människa (1). 1 dessa cellinjer mäter de vanligast använda genetiska slutpunkterna mutation av tymidinkinas (TK) och hypoxanthinguanin fosforibosyltransferas (HPRT), och en transgen av xanthin-guanin fosforibosyltransferas (XPRT). Mutationstesterna TK, HPRT och XPRT detekterar olika spektra av genetiska händelser. Den autosomala lokaliseringen av TK och XPRT kan göra det möjligt att detektera genetiska händelser (t.ex. stora deletioner) som inte detekteras vid HPRT-lokuset på X-kromosomer (2) (3) (4) (5) (6). I genmutationstestet in vitro för däggdjursceller kan kulturer med etablerade cellinjer eller celltyper användas. De celler som används väljs ut på basis av tillväxtförmåga vid odling och stabilitet med avseende på spontan mutationsfrekvens. Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att en exogen källa för metabolisk aktivering används. Detta system för metabolisk aktivering kan inte fullt ut efterlikna förhållandena in vivo hos däggdjur. Försiktighet bör iakttagas så att man undviker förhållanden som skulle kunna leda till resultat som inte avspeglar den verkliga mutageniciteten. Positiva resultat som inte avspeglar den verkliga mutageniciteten kan uppkomma från förändringar i pH, osmolalitet eller hög cytotoxicitet (7). Detta test används för att undersöka möjliga mutagener och karcinogener i däggdjur. Många ämnen som är positiva i detta test är karcinogena i däggdjur. Det föreligger dock ingen perfekt korrelation mellan detta test och karcinogenicitet. Korrelationen är beroende på den kemiska klassen och det finns allt fler bevis för att det finns karcinogener som inte detekteras med hjälp av detta test, eftersom de verkar uppträda genom andra, icke-genotoxiska mekanismer eller mekanismer som är frånvarande i bakterieceller (6). Se även Allmän inledning, del B.
1.2 DEFINITIONER framåtmutation: en genmutation från den parentala typen till den mutanta formen, vilket ger upphov till en förändring eller en förlust av den enzymatiska aktiviteten i funktionen hos det protein som bildas. mulagener som ger basparsubstitutioner: substanser som orsakar substitution av ett eller flera baspar i DNA. förskjutnings (frameshift)-mutagene: substanser som orsakar addition eller deletion av ett eller flera baspar i DNA-molekylen. fenotypisk expressionslid: en period under vilken celler som nyligen muterat töms på oförändrade genprodukter. mutantfrekvens: antalet mutanta celler som observerats, delat med antalet livskraftiga celler. relativ total tillväxt: ökningen av antalet celler över tiden jämfört med en kontrollpopulation av celler, beräknat som produkten av suspensionstillväxten i förhållande till den negativa kontrollen, gånger kloningseffektiviteten i förhållande till den negativa kontrollen. relativ suspensionstillväxt: ökning av cellantalet delat med expressionsperioden i relation till den negativa kontrollen. viabilitel: kloningens effektivitet hos de behandlade cellerna vid tiden för utstryk på platta, under selektiva betingelser efter expressionsperioden. överlevnad: kloningens effektivitet hos de behandlade cellerna när utstryk på platta sker vid behandlingsperiodens slut. Överlevnaden uttrycks vanligen i förhållande till överlevnaden hos kontrollens cellpopulation.
1.3 TESTMETODENS PRINCIP Celler som lider brist pä tymidinkinas (TK), beroende på mutationen TK± —> TK+/-, är resistenta mot de cytotoxiska effekterna av pyrimidinanalogen trifluortymidin (TFT). Celler med väl fungerande tymidinkinas är känsliga för TFT, eftersom TFT ger upphov till inhibering av cellmetabolismen och stoppar fortsatt celldelning. Mutanta celler kan således utvecklas i närvaro av TFT, medan däremot normala celler, som innehåller tymidinkinas, inte klarar detta. Celler som lider brist på HPRT eller XPRT kan på liknande sätt väljas ut genom resistens mot 6-tioguanin (TG) eller 8-azaguanin (AG). Egenskaperna hos testsubstansen bör noggrant gås igenom om en basanalog eller ett ämne som är relaterat till det selektiva ämnet testas i något av testerna för genmutationer i däggdjursceller. Exempelvis bör varje misstänkt selektiv toxicitet hos testsubstansen mot mutanta och icke-mutanta celler undersökas. Det sätt som det selekterande systemet/ämnet fungerar på, måste således bekräftas när man testar kemikalier som är strukturellt relaterade med det selektiva ämnet (8). Celler i suspension eller kulturer i form av ett enkelskikt exponeras för testsubstansen, både med och utan metabolisk aktivering, under en lämplig tidsperiod och subkultiveras för att bestämma cytotoxiciteten och för att tillåta fenotypisk expression innan mutantvalet sker (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoxiciteten bestäms i vanliga fall genom att mäta den relativa kloningseffektiviteten (överlevnad) eller den relativa totala tillväxten för kulturerna efter behandlingsperioden. De behandlade kulturerna bibehålls i ett tillväxtmedium under en tillräckligt lång tid, karakteristisk för varje selekterat lokus och celltyp, för att tillåta i det närmaste optimal fenotypisk expression av inducerade mutationer. Mutationsfrekvensen bestäms genom att inockulera ett känt antal celler i ett medium som innehåller det selektiva ämnet för detektion av mutanta celler, och i ett medium utan selektivt ämne för bestämning av kloningseffektiviteten (viabiliteten). Efter en lämplig inkubationstid räknas cellerna. Mutationsfrekvensen erhålls från antalet mutanta kolonier i selektivt medium och antalet kolonier i icke-selektivt medium.
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN
1.4
1.4.1 Förberedelser
1.4.1
1.4.1.1 Celler Det finns ett antal olika celltyper som kan användas i detta test, inklusive subkloner från L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 eller TK6-celler. De celltyper som används i detta test bör ha en demonstrerad känslighet mot kemiska mutagener, en hög kloningseffektivitet och en stabil spontan mutationsfrekvens. Cellerna bör kontrolleras med avseende på kontaminering från mykoplasma och bör inte användas om kontaminering skett. Testet bör utformas på ett sådant sätt att det har en förutbestämd känslighet och styrka. Antalet celler, kulturer och koncentrationer av testsubstansen som används bör reflektera dessa definierade parametrar (14). Det minsta antalet livskraftiga celler som överlever behandlingen och används vid varje stadium av testet bör baseras på den spontana mutationsfrekvensen. En generell regel är att använda ett cellantal som är minst tio gånger det inverterade värdet av den spontana mutationsfrekvensen. Det rekommenderas dock att minst 106 celler används. Adekvata historiska data för det cellsystem som används bör vara tillgängliga för att kontrollera att testet ger reproducerbara resultat.
1.4.1.2 Betingelser för media och kulturer Lämpliga kulturmedia och inkubationsbetingelser (odlingskärl, temperatur, CO2-koncentration och luftfuktighet) bör användas. Mediet bör väljas ut i enighet med de selektiva system och celltyper som används i testet. Det är särskilt viktigt att betingelserna för kulturerna väljs på ett sådant sätt att man säkrar en optimal celltillväxt under expressionsperioden och en förmåga till bildning av kolonier för både mutanta och icke-mutanta celler.
1.4.1.3 Förberedelse av kulturer Celler dras upp från stamkulturer, inokuleras i ett odlingsmedium och inkuberas vid 37 oC. Innan de används i detta test kan kulturerna behöva tvättas rena från redan existerande mutanta celler.
1.4.1.4 Metabolisk aktivering Celler bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro av ett lämpligt system för metabolisk aktivering. Det system som vanligen används är en postmitokondriell fraktion som tillsatts en kofaktor (S9), beredd ur levern från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) eller en kombination av fenobarbiton och β-naftoflavon (19) (20). Den postmitokondriella fraktionen används vanligen vid koncentrationer i området 1–10 % v/v i det slutliga testmediet. Valet av och betingelserna för ett system för metabolisk aktivering kan vara beroende av klassen av kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den postmitokondriella fraktionen. Ett antal vidareutvecklingar, inklusive konstruktion av genetiskt modifierade cellinjer som uttrycker specifika aktiverande enzymer, kan ge en potential för endogen aktivering. Valet av de cellinjer som används bör vara vetenskapligt motiverat (t.ex. genom relevansen av cytokrom P450 isoenzym för metabolismen av testsubstansen).
1.4.1.5 Beredning av testsubstansen Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut innan cellerna behandlas, om detta är lämpligt. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till testsystemen och/eller spädas ut innan behandlingen startas. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata tyder på att lagring kan accepteras.
1.4.2 Försöksbetingelser
1.4.2
1.4.2.1 Lösningsmedel/vehikel Lösningsmedlet/vehikeln bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen och bör vara förenlig med överlevnaden för cellerna samt S9-aktiviteten. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas data som visar att de är kompatibla. Det rekommenderas att vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar i första hand bör övervägas närhelst det är möjligt. När substanser som är instabila i vatten testas, bör de organiska lösningsmedel som används vara fria från vatten. Vatten kan avlägsnas genom tillsats av en molekylsikt.
1.4.2.2 Exponeringskoncentrationer Bland de kriterier som ska övervägas när den högsta koncentrationen ska fastställas är cytotoxicitet, löslighet i testsystemet och förändringar i pH eller osmolalitet. Cytotoxicitet bör fastställas såväl med som utan metabolisk aktivering i huvudexperimentet med hjälp av lämplig indikation på cellernas integritet och tillväxt, såsom relativ kloningseffektivitet (överlevnad) eller relativ total tillväxt. Det kan vara lämpligt att fastställa cytotoxicitet och löslighet i ett förberedande experiment. Minst fyra analyserbara koncentrationer bör användas. Där cytotoxicitet uppträder bör dessa koncentrationer täcka in ett område som sträcker sig från maximal toxicitet ner till liten eller ingen toxicitet. Detta innebär normalt att koncentrationsnivåerna bör separeras av minst en faktor mellan 2 och \10. Om den maximala koncentrationen är baserad på cytotoxicitet bör detta då resultera i ungefär 10–20 % (men inte mindre än 10 %) relativ överlevnad (relativ kloningseffektivitet) eller relativ total tillväxt. För relativt icke-cytotoxiska substanser, bör den maximala testkoncentrationen vara 5 mg/ml, 5 μl/ml eller 0,01 M, beroende på vilket som är det lägsta. Relativt olösliga substanser bör testas upp till eller över sin löslighetsgräns under odlingsbetingelserna för kulturen. Bevis för olöslighet bör bestämmas i det slutliga behandlingsmediet för vilket cellerna exponeras. Det kan vara lämpligt att fastställa lösligheten vid behandlingens början och slutpunkt, eftersom lösligheten kan förändras under exponeringsförloppet i testsystemet beroende på närvaron av celler, S9, serum, etc. Olöslighet kan detekteras med hjälp av blotta ögat. Fällningen torde inte störa bestämningen.
1.4.2.3 Kontroller Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller vehikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje experiment. När metabolisk aktivering används, bör den positiva kontrollkemikalien vara av sådant slag att den kräver aktivering för att ge ett mutagent svar. I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser. Betingelser för metabolisk akti-vering Lokus Substans CAS-nummer EINECS-nummer Frånvaro av exogen metabolisk aktivering HPRT Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 TK (små och stora kolonier) Metylmetansulfonat 66-27-3 200-62 5-0 XPRT Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Närvaro av exogen metabolisk aktivering HPRT 3-Metylkolantren 56-49-5 200-276-4 N-Nitrosodimetylamin 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimetylbensantraccn 57-97-6 200-359-5 TK (små och stora kolonier) Cyklofosfoamid 50-18-0 200-015-4 Cyklofosfoamidmonohydrat 6055-19-2 Bcns[a]pyrcn 50-32-8 200-028-5 3-Metylkolantren 56-49-5 200-276-5 XPRT N-Nitrosodimetylamin (för höga nivåer av S-9) 62-75-9 200-549-8 Bens[a]pyren 50-32-8 200-028-5 Andra lämpliga referenssubstanser för positiv kontroll kan användas, t.ex. om ett laboratorium har en historisk databas med 5-brom-2'-deoxiuridin [CAS-nummer 59-14-3, ElNECS-nummer 200-415-9] skulle även denna referenssubstans kunna användas. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas när sådana finns att tillgå. Negativa kontroller, bestående av enbart ett lösningsmedel eller en vehikel i behandlingsmediet och behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna bör inkluderas. Dessutom bör även obehandlade kontroller användas, om det inte finns historiska kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.
1.4.3 Förfarande
1.4.3
1.4.3.1 Behandling med testsubstansen Prolifererande celler bör exponeras för testsubstansen både med och utan metabolisk aktivering. Exponering bör ske under en lämplig tidsperiod (normalt är 3–6 timmar effektivt). Exponeringstiden kan utsträckas över en eller flera cellcykler. Antingen en eller två behandlade kulturer kan användas vid varje koncentration som testas. När enstaka kulturer används, bör antalet koncentrationer ökas så att ett adekvat antal kulturer säkerställs för analys (t.ex. minst åtta analyserbara koncentrationer). Två negativa (lösningsmedels-) kontrollkulturer bör användas. Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med hjälp av lämpliga metoder, såsom slutna odlingskärl (21) (22).
1.4.3.2 Mätning av överlevnad, viabilitet och mutantfrekvens Mot slutet av exponeringsperioden tvättas cellerna och odlas för att bestämma överlevnad och för att medge att den mutanta fenotypen uttrycks. Mätning av cytotoxicitet, genom en bestämning av den relativa kloningseffektiviteten (överlevnad) eller relativa totala tillväxten för kulturerna, initieras normalt efter behandlingsperioden. Varje lokus har definierade krav på minimitid, så att närmast optimal fenotypisk expression av nyligen inducerade mutanter medges (HPRT och XPRT kräver minst 6–8 dagar och TK minst två dagar). Celler odlas ofta i ett medium med och utan selektiva ämnen för att såväl antalet mutanter som kloningens effektivitet ska kunna bestämmas. Mätningen av viabiliteten (används för att beräkna mutantfrekvensen) initieras vid slutet av expressionstiden genom utstryk på platta i ett icke-selektivt medium. Om testsubstansen är positiv i testet L5178Y TK+/-, bör storleksmätning av kolonierna utföras på åtminstone en av testkulturerna (den högsta positiva koncentrationen) och på de negativa och positiva kontrollerna. Om testsubstansen är negativ i testet L5178Y TK+/-, bör storleksmätning av kolonierna utföras på de negativa och positiva kontrollerna. I undersökningar där TK6TK+/- används, kan storleksmätning av kolonierna utföras även där.
2. DATA
2.
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN Data bör inkludera en bestämning av cytotoxicitet och viabilitet, räkning av kolonier och mutantfrekvenser för de behandlade kulturerna och kontrollkulturerna. Om testet L5178Y TK+/- ger ett positivt svar, påvisas kolonier utifrån kriterier för små och stora kolonier för åtminstone en koncentration av testsubstansen (högsta positiva koncentrationen) och för de negativa och positiva kontrollerna. Den molekylära och cytogenetiska naturen hos både stora och små mutanta kolonier har undersökts mycket ingående (23) (24). I testet TK+/-påvisas kolonier utifrån kriterier för normal tillväxt (stora) och långsam tillväxt (små) av kolonier (25). Mutanta celler som har utsatts för den mest omfattande genetiska skadan uppvisar förlängda dubbleringstider och bildar därför små kolonier. Denna skada sträcker sig typiskt i en skala från förlust av hela genen till karyotypiskt synliga kromosomavvikelser. Induktion av mutanter som ger små kolonier har associerats med kemikalier som inducerar omfattande kromosomavvikelser (26). Mutanta celler som är mindre allvarligt påverkade växer med hastigheter liknande de som parentala celler uppvisar och bildar stora kolonier. Överlevnad (relativa kloningseffektiviteter) eller relativ total tillväxt bör anges. Mutantfrekvensen bör uttryckas som antalet mutanta celler per antalet celler som överlever. Individuella data för kulturerna bör anges. Alla data bör dessutom sammanfattas i tabellform. Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt svar. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. Negativa resultat måste bekräftas från fall till fall. 1 de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta ett negativt resultat bör detta motiveras. Vid tvetydiga eller negativa resultat bör man vid uppföljningsexperiment överväga att ändra parametrarna i undersökningen för att utvidga de bedömda försöksbetingelserna. Försöksparametrar som kan behöva modifieras inkluderar koncentrationsstegen och villkoren för metabolisk aktivering.
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATET Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning eller en reproducerbar ökning i mutationsfrekvensen. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan vara till hjälp vid utvärdering av testresultatet. Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier anses vara icke-mutagen i detta test. Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller negativa resultat, kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger som experimentet upprepas. Positiva resultat från testet av genmutationen in vitro hos däggdjursceller indikerar att testsubstansen inducerar genmutationer i de odlade däggdjursceller som används. Ett positivt koncentrationssvar som är reproducerbart är mycket meningsfullt. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under försöksbetingelserna, inte inducerar genmutationer i de odlade däggdjursceller som används.
3. RAPPORTERING
3. TESTRAPPORT
Följande information måste ingå i testrapporten:
Lösningsmedel/vehikel:
motivering för valet av vehikel/lösningsmedel
testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt
Celler:
cellernas typ och källa
antalet cellkulturer
antalet cellpassager, om detta är tillämpligt
metoder för bibehållande av cellkulturen, om detta är tillämpligt
frånvaro av mykoplasma
Försöksbetingelser:
grund för val av koncentrationer och antalet kulturer inklusive t.ex. data för cytotoxicitet och löslighetsbegränsningar, om dessa finns att tillgå
mediernas sammansättning, CO2-koncentration
testsubstansens koncentration
den tillsatta vehikelns och testsubstansens volym
inkubationstemperatur
inkubationstid
behandlingens varaktighet
celldensitet under behandlingen
typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier
positiva och negativa kontroller
expressionsperiodens varaktighet (inklusive antalet celler som inokulerats, samt subkulturer och scheman för näringstillförsel, om detta är tillämpligt)
selektiva ämnen
kriterier för när tester ska anses som positiva, negativa eller tvetydiga
metoder som används för att räkna antalet livskraftiga och muterade celler
definition av kolonier vars storlek och typ ska beaktas (inklusive kriterier för små och stora kolonier, där detta är tillämpligt)
Resultat:
tecken på toxicitet
tecken pä utfällning
data för pH och osmolalitet under det att exponering för testsubstansen sker, om sådana data har upp mätts
koloniernas storlek (i de fall de räknats) för åtminstone negativa och positiva kontroller
laboratoriets möjligheter att detektera mutanter som ger små kolonier med L5178Y TK+/–systemet, där detta är tillämpligt
dos/respons-förhållande, där detta är möjligt
statistiska analyser, om sådana finns
samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata
historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontrolldata med intervall, medelvärden och stan dardavvikelser
mutationsfrekvens
Diskussion av resultaten.
Slutsatser.
4.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.
HÄNVISNINGAR Moore, M. M., DeMarini, D. M. DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mam-malian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Chu, E. H. Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, s. 1306–1312. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, s. 467–485. Moore, M. M.. Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quanti tation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, s. 394–403. Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of the Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, s. 121–128. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, s. 235–239. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991) Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 25 7. s. 147–204. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, s. 225–251. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res,, 196, s. 17–36. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, s. 135–141. Liber, H. L, Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, s. 9–17. Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate and 1CR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res.. 160, s. 133–147. Turner, N. T., Balton, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L51 78Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B.J. et all (eds.) Handbook oj Mutagenicity Test Procedures, Else-vier Science Publishers, New York, s. 239–268. Arlett, C. F.. Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluationof Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, s. 66–101. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethyllnitrosamine, Mutation Res., 46, s. 365–373. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, s. 347–364. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, s. 61–108. Maron, D. M. and Arnes, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, MutuationRes.. 113, s. 173–215. Elliott, E. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, s. 175–177. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in:In Vitro Metabolic Activation in MutagenesisTesting, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, s. 85–88. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L, Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of AirborneAgents, New York, Plenum, s. 91–103. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Gollagen Gels tor Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, s. 795–801. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier. J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 87, s. 51–55. Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT) Mutants of L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res., 151, s. 161–174. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, s. 89–102. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, s. 609–614.
B.18 DNA-SKADA OCH DNA-REPARAT1ON – FELAKTIG DNA-SYNTES –DÄGGDJURSCELLER IN VITRO
B.18
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B.
1.2 DEFINITION Se allmän inledning till del B.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Vid test av sporadisk DNA-syntes (UDS) mäts DNA-reparationssyntesen efter bortskärning och avlägsnade av det avsnitt av DNA-strängen som innehåller det skadade område som inducerats av kemiska eller fysiska agenser. Testen bygger på inkorporering av tritiummarkerat thymidin (3H-TdR) i däggdjurscellers DNA när dessa celler inte är i S-fasen av cellcykeln. Upptaget av 3H-TdR kan besämmas genom autoradiografi eller genom vätskescintillationsräking (LSC) av DNA från de exponerade cellerna. Såvida inte primärkulturer av råtthepatocyter används, exponeras odlade däggdjursceller för testämnet med och utan ett exogent metaboliskt aktiveringssystem. UDS-test kan också företas i in vivo-system.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6 Förberedelser
Testämne samt kontroll- och referensämnen tillsätts i ett kulturmedium eller upplöses eller suspenderas i lämpliga vehiklar innan cellerna exponeras. Koncentrationen av vehikeln bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft. Primärkulturer av råtthepatocyter, humana lymfocyter eller etablerade cellinjer (t.ex. humana diploida fibroblaster) kan användas. Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett lämpligt metaboliskt aktiveringssystem.
Försöksbetingelser
Antal kulturer
Vid autoradiografisk bestämning av UDS används minst två och vid LSC sex kulturer (eller mindre om det är vetenskapligt berättigat) för varje experimentpunkt.
Användning av negativa och positiva kontroller
Positiva och negativa (obehandlade och/eller vehikel) kontroller ska användas jämsides med och utan metabolisk aktivering i varje försök. Som positiv kontroll vid användning av råtthepatocyter kan t.ex. 7,12-DMBA (7,12-dimetylbenzanthracen) eller 2-AAF (2-acetylaminofluoren) användas. Som positiv kontroll vid användning av etablerade cellinjer kan t.ex. 4-NQO (4-nitrouinloin-N-oxid) användas både i samband med autoradiografisk registering och LSC utan rnetabolisk aktivering. När metaboliska aktiveringssystem används kan t.ex. N-dimetylnitrosamin användas för positiv kontroll.
Exponeringskoncentration
En rad olika koncentrationer av testämnet med passande intervaller mellan koncentrationerna som täcker alla verkningar ska användas. Den högsta koncentrationen bör ha en viss cytotoxisk verkan. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen för löslighet. Den högsta koncentrationen av icke-toxiska testämnen, som är fritt lösliga i vatten, fastställs från test till test.
Celler
Lämpligt växtmedium, CO2-koncentration, temperatur och fuktighet för att bibehålla kulturerna ska användas. Etablerade cellinjer ska kontrolleras regelbundet för mykoplasma-förorening.
Metabolisk aktivering
I samband med primärkulturer av hepatocyter används inte metaboliska aktiveringssystem. Etablerade cellinjer och lymfocyter exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett lämpligt metaboliskt aktiveringssystem.
Förfarande
Förberedelse av kulturer
Etablerade cellinjer framställs på grundval av stamkulturer (t.ex. genom trypsinering eller skakning) och utsås med passande täthet i odlingskärl, varefter de inkuberas vid 37 oC. Primärkulturer av råtthepatocyter etableras när hepatocyter omedelbart efter isolering förs över i ett passande medium och tillåts att häfta sig vid den växande ytan. Humana lymfocytkulturer odlas genom därtill lämpade metoder.
Exponering av kulturerna för tes t ämnet Primärkulturer av råtthepatocyter
Färskt isolerade råtthepatocyter exponeras för testämnet under lämplig tid i ett medium som innehåller 3H-TdR. Efter exponering avlägsnas cellerna från mediet och tvättas, fixeras och torkas. Objektglasen bör doppas i autoradiografisk emulsion (alternativt kan stripping film användas) och belyses, framkallas, färgas och räknas.
Etablerade cellinjer och lymfocyter
Autoradiografisk teknik: Cellkulturerna exponeras först för testämnet under en passande tid och därefter för 3H-TdR. Exponeringsperioderna beror på ämnena, de metaboliska aktiveringssystemen och celltyperna. Exponering för 3H-TdR bör ske samtidigt eller inom några minuter efter exponering för testämnet så att UDS mäts vid den tid då aktiviteten är störst. Valet mellan dessa två förfaranden beror på risken för interaktion mellan testämnet och 3H-TdR. För att skilja mellan UDS och semi-konservativ DNA-replikation kan den senare inhiberas genom användning av t.ex. argininfattiga medier, ett lågt seruminnehåll eller tillsättning av hydroxyurinämne till kulturmediet. LSC-mätning av UDS: Före exponering för testämnet blockeras cellernas övergång till S-fasen som beskrivits ovan. Därefter exponeras cellerna på samma sätt som vid den autoradiografiska tekniken. Omedelbart efter inkubationen extraheras cellernas DNA och det totala DNA-innehållet samt mängden av inkorporerat 3H-TdR mäts. När de nämnda teknikerna används på humana lymfocyter är det inte nödvändigt att hämma den semi-konservativa DNA-replikationen, såvida det inte rör sig om stimulerade kulturer.
Analys
Autoradiografisk bestämning
Vid mätning av UDS i odlade celler medräknas inte kärnor i S-fasen. Minst 50 celler per koncentration ska räknas. Objektglasen bör kodmärkas innan räkning. På varje platta bör flera olika slumpmässigt valda områden med stort inbördes avstånd räknas. Mängden av inkorporerat 3H-TdR i cytoplasman bestäms genom räkning i tre områden i kärnstorlek i varje räknad cells cytoplasma.
LSC-mätning
Vid LSC-mätning av UDS används ett passande antal kulturer per koncentration och per kontrollförsök. Alla resultat ska bekräftas genom ett oberoende test.
2. DATA Data ställs upp i tabellform.
2.
2.1 AUTORADIOGRAFISK MÄTNING Mängden av inkorporerat 3H-TdR i cytoplasman och antalet korn som registreras i cellkärnområdet anges separat. Fördelning av mängden av inkorporerat 3H-TdR i cytoplasman och antalet korn per kärna kan beskrivas genom användning av medel, median eller modus.
2.2 LSC-MÄTNING Vid LSC-mätning anges inkorporeringen av 3H-TdR som dpm/μg DNA. Distributionen av inkorporeringen kan beskrivas genom användning av medel dpm/μg DNA med tillhörande standardavvikelse. Utvärderingen av resultaten ska grundas på en lämplig statistisk metod.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Använda celler, täthet och antal passager på exponeringstidpunkten, antal cellkulturer.
Metoder för bibehållande av cellkulturer, inbegripet medium, temperatur och CO2– koncentration.
Testämne, vehikel, koncentrationer och motivering för val av använda koncentrationer.
Detaljerad information om de metaboliska aktiveringssystemen.
Exponeringsschema.
Positiva och negativa kontroller.
Använd autoradiografisk teknik.
Förfarande vid blockering av cellernas övergång till S-fasen.
Förfarande vid extraktion av DNA och bestämning av det totala DNA-innehållet vid LSC- mätningen.
Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt.
Statistisk utvärdering.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B.
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B.
B.19 TEST AVSEENDE SYSTERK ROMATIDBYTEN IN VITRO
B.19
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B.
1.2 DEFINITION Se allmän inledning till del B.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Test av systerkromaidbyten (SCE) är ett korttidstest för bestämning av reciprok utväxling av DNA mellan två systerkromatider i en kromosom under replikation. Vid SCE sker en utväxling av DNA-replikationsprodukter vid skenbart homolog loci. Man tror att utväxlingsprocessen sannolikt omfattar brytning och återförening av DNA-koder, men det finns nästan ingen kännedom om dess molekylbas. För att kunna upptäcka SCE är det nödvändigt att differentialmärka systerkromatiderna, vilket kan göras genom att inkorporera bromdeoxyuridin (BrdU) i kromosomernas DNA under två cellcykler. Däggdjursceller exponeras in vitro för testämnet med och utan ett exogent metaboliskt aktiveringssystem från däggdjur, om detta anses relevant, och odlas under två cellcykler i ett medium som innehåller BrdU. Sedan cellerna behandlats med en spindelfiberinhibitor (t.ex. kolchicin) för att cellerna ska ackumuleras i ett metafasliknande stadium av mitosen (c-metafas), skördas de och prepareras för kromosomanalys.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
För detta test kan primärkulturer (t.ex. humana lymfocyter) eller etablerade cellinjer (t.ex. äggstocksceller från kinesisk hamster) användas. Cellinjer bör kontrolleras för mykoplasmaförorening.
Lämpligt kulturmedium och lämpliga inkubationsbetingelser (t.ex. temperatur, odlingskärl, CO2-koncentrationer och fuktighet) ska användas.
Testämnet tillsätts i ett kulturmedium eller upplöses eller suspenderas i lämpliga vehiklar innan cellerna exponeras. Koncentrationen av vehiklen bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft eller växtegenskaper. En eventuell påverkan av SCE-frekvensen kontrolleras genom odling av en kontrollkultur i lösningsmedlet.
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem från däggdjursceller. Om celltyper med endogen metabolisk aktiveringanvänds bör det vara bevisat att aktiveringsform och -hastighet är lämpliga för den kemiska klass som testas.
1.6 Testbetingelser
Antal kulturer
För varje experimentell punkt används minst två parallella kulturer.
Användning av negativa och positiva kontroller
Som positiv kontroll används vid varje enskilt försök både en direkt verkande kemisk förbindelse och en förbindelse som kräver metabolisk aktivering. Dessutom företas vehikelkontroll. Följande kemiska förbindelser kan t.ex. användas till positiv kontroll: Vid behov kan en supplerande positiv kontroll göras med användning av en kemisk förbindelse av samma typ som testämnet.
direktverkande förbindelser:
etylmetansulfonat,
indirekt verkande förbindelser:
cyclofosfamid,
Exponerings koncentration
Minst tre koncentrationer av testämnet med passande intervaller mellan koncentrationerna ska användas. Den högsta koncentrationen bör ha en tydlig cytotoxisk verkan men får inte förhindra den nödvändiga celldelningen. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen for löslighet. Den högsta koncentrationen av icke-toxiska testämnen, som är fritt lösliga i vatten, fastställs från test till test.
Testförfarande
Odling
Etablerade cellinjer framställs på grundval av stamkulturer (t.ex. genom trypsinering eller skakning) och utsås med passande täthet i odlingskärl, varefter de inkuberas vid 37 oC. För monolagskulturer justeras antalet celler per kulturkärl så att kulturerna vid tidpunkten för skörden högst täcker 50 % av växtarealen. Cellerna kan också odlas i suspension. Humana lymfocytkulturer odlas med användning av därtill lämpliga metoder på grundval av hepariniserat blod och inkuberas vid 37 oC.
Exponering
Celler i den exponentiella växtfasen exponeras för testämnet under en passande period. I de flesta fall räcker det med 1–2 timmar men i vissa fall kan exponeringsperioden förlängas till att omfatta två hela cellcykler. Celler vars endogena metaboliska aktivering är otillräcklig exponeras både med och utan tillsättning av ett lämpligt metaboliskt aktiveringssystem. Efter exponeringen tvättas cellerna fria från testämne. Därefter odlas de under två replikationscykler i ett medium som innehåller BrdU. Alternativt kan cellerna exponeras för testämnet och BrdU samtidigt under en period som motsvarar två cellcykler. Kulturer från humana lymfocyter exponeras medan de befinner sig i semisynkront tillstånd. Cellerna analyseras under deras andra delning efter exponering vilket säkerställer att exponeringsperioden täcker den största delen av de följsamma faserna i cellcykeln. Alla kulturer som tillsatts BrdU bevaras och manipuleras i mörker eller i svagt ljus från glödlampor till dess att cellerna skördas för att minimiera fotolysen av BrdU-haltigt DNA.
Skörd av celler
Cellkulturerna behandlas med en spindelfiberinhibitor (t.ex. kolchicin) i 1–4 timmar innan de skördas. Varje kultur skördas för sig och behandlas separat för kromosompreparering
Kromosompreparation och färgning
Vid kromosompreparation används cytogeniska standardtekniker. Färgning på objektglas för att visa SCE kan ske på flera olika sätt (t.ex. fluorescens plus Giemsametoden).
Analys
Antalet av de celler som ska analyseras grundas på den spontana SCE-frekvensen i kontrolltest. Normalt analyseras minst 25 väl utspridda metafaser per kultur för SCE. Objektglas kodas före analys. Vid analys av humana lymfocyter analyseras endast metafaser med 46 centromerer. Vid analys av etablerade cellinjer analyseras endast metafaser med det modala antal centromerer ± 2. Det bör anges huruvida omväxling i märkningen omkring centromeret betraktas som SCE. Resultaten bör bekräftas genom ett oberoende test.
2. DATA Data ställs upp i tabellform. Antal SCE för varje metafas samt antalet SCE per kromosom för varje metafas bör anges separat för alla exponerade kulturer och kontrollkulturer. Utvärderingen av data grundas på lämpliga statistiska metoder.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:
Använda celler, metoder för bibehållande av cellkulturer.
Testbetingelser: Sammansättning av mediet, CO2-koncentration, testämnekoncentration, använd vehikel, inkubationstemperatur, exponeringsperiod, använd spindelfiberinhibitor plus upplysningar och dess koncentration och behandlingens varaktighet, använt metaboliskt aktiveringssystem, positiva och negativa kontroller.
Antal cellkulturer per experimentell punkt.
Detaljerade upplysningar om objektprepareringstekniken.
Antal analyserade metafaser (data anges separat för varje kultur).
Genomsnittligt antal SCE per cell och per kromosom (data anges separat för varje kultur).
Kriterier för utvärdering av SCE.
Motivering för val av doser.
Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt.
Statistisk utvärdering.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B.
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B.
B.20 KÖNSBUNDEN RECESSIV LETAL TEST PÅ DROSOPHILA MELANOGASTER
B.20
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B.
1.2 DEFINITION Se allmän inledning till del B.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Vid könsbunden recessiv letal test (SLRL) på Drosophila melanogaster undersöks förekomsten av både punktmutationer och mindre deletioner hos insektens avkomma. Det är en framåtmutationstest genom vilken det är möjligt att undersöka ca 800 loci på X-kromosomen i syfte att registrera mutationer. Detta antal utgör ca 80 % av alla X-kromosomens loci. X-kromosomen utgör omkring en femtedel av den samlade haploida kromosommängden. Mutationer i Drosophila melanogasters X-kromosom kommer till fenotypiskt uttryck hos handjur som är bärare av den muterade genen. När mutationen under hemizygota betingelse är letal konstateras detta genom frånvaron av en av de två typer av handjur som normalt finns i ett meterozy-gotiskt hondjurs avkomma. I SLRL-testet utnyttjas detta förhållande med hjälp av speciellt märkta och arrangerade kromosomer.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6 Förberedelser
Stammar
Handjur av väldefinierade vildtypstammar och hondjur från Muller-5-stammen kan användas. Lämpligt märkta hondjur från andra stammar och multipelt inverterade X-kromosomer kan också användas.
Testämne
Testämnet upplöses i vatten. Ämnen som är oupplösliga i vatten kan upplösas eller suspenderas i lämpliga vehikler (t.ex. en blandning av etanol och Tween-60 eller - 80) och därefter spädas ut i vatten eller salin före tillförsel. Dimetylsulfoxid (DMSO) bör undvikas som vehikel.
Antal
Testet bör utformas så att följsamheten och betydelsen av testet är fastställt på förhand. Den spontana mutationsfrekvens som registreras i kontrollförsök är av stor betydelse för bestämning av det antal exponerade kromosomer som ska analyseras.
Tillförselväg
Exponeringen kan ske genom oral tillförsel, injektion eller genom exponering för gaser eller ångor. Testämnet kan eventuellt tillföras i en sockerlösning. Vid behov kan den upplösas i en 0,7 % NaCl-lösning och injiceras i bröstkorgen eller buken.
Användning av negativa och positiva kontroller
En negativ (vehikel) och en positiv kontroll ska utföras. Om det finns data från tidigare laboratorieförsök är det dock inte nödvändigt att utföra sidlöpande kontroll.
Exponeringskoncentration
Tre koncentrationsnivåer ska användas. För en preliminär undersökning kan en enkel koncentration användas som antingen kan vara den högsta koncentration som insekterna tål eller en koncentration som orsakar en viss grad av toxisk verkan. Vid icke-toxiska testämnen exponeras insekterna för de största möjliga koncentrationerna.
Testförfarande
Vildtyphandjur (3–5 dagar gamla) exponeras för testämnet och paras individuellt med flera jungfruliga hondjur från Muller-5-stammen eller från andra lämpligt märkta stammar (med multipelt inverterade X-kromosomer). Hondjuren byts ut mot nya jungfruliga hondjur varannan eller var tredje dag tills hela könscellcykeln är täckt. Hondjurens avkomma registreras för att konstatera letala verkningar som motsvarar exponeringens verkan på mogen sperma, spermatider i sena stadier eller medelstadier, spermatider i tidiga stadier, spermatocyter och spermatogonia. Heterozygota F1-hondjur från de ovan nämnda korsningarna paras individuellt (dvs. ett hondjur per flaska) med sina bröder. I F2-generationen registreras varje kultur för bestämning av frånvaron av vildtyphandjur. Om en kultur har uppstått från ett F1-hondjur som bär en letal gen i den parentala X-kromosomen (dvs. det finns inga handjur med den exponerade kromosomen) testas döttrar till detta hondjur med samma genotyp för att konstatera om den letala verkan upprepas i nästa generation.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och ange antal testade X-kromosomer, antal ofruktsamma handjur, antal letala kromosomer för varje exponeringskoncentration och för var och en av de exonerade handjurens parningsperioder. Dessutom anges antalet klungor av olika storlek per handjur. Resultaten bör bekräftas genom ett oberoende test. Utvärderingen av en könsbunden recessiv letal test ska grundas på lämpliga statistiska metoder. Kluster av generationer med recessiva letala gener som stammar från ett enda handjur ska registreras och utvärderas på grundval av en lämpligt statistisk metod.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Stammar: Använda drosophila-stammar, insekternas ålder, antal exponerade handjur, antal sterila handjur, antal etablerade F2-bestånd, antal F2-bestånd utan avkomma, antal kromosomer med letala gener i varje könscellstadium.
Kriterier för fastställande av storleken av de exponerade grupperna.
Testbetingelser: Detaljerade beskrivning av exponerings- och stickprovsschema, exponeringskoncentrationer, toxicitetsdata, negativ (lösningsmedel) och eventuella positiva kontroller.
Kriterier för registrering av letala mutationer.
Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt.
Statistisk utvärdering.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B.
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B.
B.21 CELLTRANSFORMATIONSTEST PÅ DÄGGDJURSCELLER IN VITRO
B.21
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B.
1.2 DEFINITION Se allmän inledning till del B.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Kulturer av däggdjursceller kan användas för upptäckt av fenotypiska förändringar in vitro som inducerats av kemiska förbindelser i samband med maligna transformationer in vivo. De mest använda celltyperna är C3H10TlVi, 3T3, SHE, Fischer-råtta, och testerna bygger på förändringar i cellmorfologin, fokusbildning eller egenskapen att kunna växa i mjuk agar. Det finns också mindre vanligt använda stammar som används för undersökning av andra fysiologiska eller morfologiska förändringar i celler till följd av exponering för cancerogena kemiska förbindelser. Inga direkta verkningsmekanismförbindelser mellan cancer och de genetiska endpoints som används i dessa tester in vitro finns beskrivna. Några av testsystemen kan användas för upptäckt av tumörpromotorer. Den cytotoxiska effekten kan bestämmas genom mätning av testämnets verkan på kolonibildande (kloniseringseffektiviteten) eller kulturernas växtfrekvens. Syftet med mätningen av den cytotoxiska effekten är att konstatera om exponering för testämnet är toxikologiskt relevant, men kan inte användas för beräkning av transformationsfrekvensen i alla tester, eftersom vissa kräver lång inkubationstid och/eller överföring till nya plattor.
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6 Förberedelser
Celler
En rad olika cellinjer eller primärlinjer kan användas beroende på vilken transformationstest som görs. Försöksledaren måste säkerställa att använda celler genomgår relevanta fenotypiska förändringar efter exponering för kända cancerogener, och försöksledarens eget laboratorium måste ha bevisat och dokumenterat det använda testets validitet och trovärdighet.
Medium
Medium och försöksbetingelser som är lämpliga för transformationstest ska användas.
Testämne
Testämnet tillsätts i ett kulturmedium eller upplöses eller suspenderas i lämpliga vehiklar innan cellerna exponeras. Koncentrationen av vehikeln bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft eller växtegenskaper.
Metabolisk aktivering
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem. Om celltyper med endogen metabolisk aktivering används bör det vara bevisat att aktiveringsform och -hastighet är lämpligt för den kemiska klass som testas.
Testbetingelser
Användning a v negativa och positiva kontroller
Som positiva kontroll används vid varje enskilt försök både en direkt verkande kemisk förbindelse och en förbindelse som kräver metabolisk aktivering. Dessutom företas negativ (vehikel) kontroll. Följande kemiska förbindelser kan t.ex. användas till positiv kontroll: Vid behov kan en supplerande positiv kontroll göras med användning av en kemisk förbindelse av samma typ som testämnet.
direktverkande förbindelser:
etylmetansulfonat,
H-propiolacton,
förbindelser som kräver metabolisk aktivering:
2 -acetylaminofluoren,
4-dimetylaminoazobenzen,
7,12-dimetylbenzanthracen.
Exponeringskoncentration
Flera koncentrationer av testämnet ska användas. Dessa koncentrationer bör framkalla en koncentrationsrelaterad toxisk verkan. Den högsta koncentrationen bör medföra en låg överlevnadsgrad och överlevnadsgraden vid den lägsta koncentrationen bör vara av samma storlek som vid det negativa kontrollförsöket. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen för löslighet. Den högsta koncentrationen av icke-toxiska testämnen, som är fritt lösliga i vatten, fastställs från test till test.
Testförfarande
Cellerna bör exponeras under för det använda testsystemet passande period. Detta kan inbegripa upprepad dosering åtföljt av en ändring av medium (och vid behov ny metabolisk aktivering) om det är fråga om långvarig exponering. Celler vars endogena metaboliska aktivering är otillräcklig testas både med och utan ett lämpligt metaboliskt aktiveringssystem. Efter exponeringen tvättas cellerna fria från testämne. Därefter odlas de i syfte att låta den transformerade fenotyp som testet bygger på komma till uttryck och i syfte att bestämma transformationsfrekvensen. Alla resultat ska bekräftas genom ett oberoende test.
2. DATA Data ska ställs upp i tabellform och kan ta sig olika uttryck beroende på använt testsystem. Det kan t.ex. röra sig om räkning av plattor, positiva plattor eller antal transformerade celler. Vid behov anges överlevnadsgraden som en procentdel av överlevnaden i kontrollförsöken, och transformationsfrekvensen uttrycks som antal transformerade celler per överlevande. Utvärderingen av data grundas på lämpliga statistiska metoder.
3. RAPPORTERING
3.
3.1 TESTRAPPORT Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter:
Använd celltyp, antal cellkulturer, metoder för bibehållande av cellkulturer.
Testbetingelser: Testämnekoncentration, använd vehikel, inkubationstid, testets varaktighet och frekvens, celltäthet under exponeringen, använt exogent metaboliskt aktiveringssystem, positiva och negativa kontroller, specifikation av den fenotyp som testet bygger på, använt selektivt system (om sådant har använts), motivering för val av doser.
Metoder för registrering av livskraftiga och transformerade celler.
Statistisk utvärdering.
Diskussion om resultaten.
Tolkning av resultaten.
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING Se allmän inledning till del B.
4. HÄNVISNINGAR Se allmän inledning till del B.
B.22
1. METOD
1.
1.1 INLEDNING Se allmän inledning till del B.
1.2 DEFINITIONER Se allmän inledning till del B.
1.3 REFERENSÄMNEN Inga.
1.4 TESTMETODSPRINCIP Dominanta letala verkningar leder till att embryot eller fostret dör. När dominanta letala mutationer framkallas genom exponering för en kemisk ämne är det ett tecken på att försöksdjurartens könscellvävnader har skadats. Det råder bred enighet om att dominanta letala gener uppstår till följd av kromosomskador (strukturella och numeriska anomalier). Om exponerade handjurs avkomma dör på det embryonala stadiet kan även detta skyllas på toxiska verkningar. Normalt exponeras handjur för testämnet och paras med jungfruliga hondjur. Könscellernas olika stadier kan undersökas separat genom att använda på varandra följande parningsperioder. Ökningen av antalet döda implantater per hondjur i den exponerade gruppen i förhållande till antalet döda implantater per hondjur i kontrollgruppen visar den letala verkan efter implantation. Det letala verkan före implantation kan bedömas på grundlag av räkning av corpora lutea eller genom sammanslagning av det totala antalet implantater per hondjur i de exponerade grupperna och kontrollgruppen. Den totala dominanta letala verkan är summan av de letala verkningar före och efter implantation. Beräkningen av den totala dominanta letala verkan grundas på sammanräkning av antalet levande implantater per hondjur i försöksgruppen och antalet levande implantater per hondjur i kontrollgruppen. En minskning av antalet implantater under bestämda tidsperioder kan skyllas på celldöd (av spermacyter och/eller spermatogoner).
1.5 KVALITETSKRITERIER Inga.
1.6 METODBESKRIVNING
1.6 Förberedelser
Testämnet upplöses eller suspenderas i fysiologisk saltlösning. Kemiska förbindelser som inte är lösliga i saltlösning ska lösas eller suspenderas i lämplig vehikel. Den vehikel som används får inte inverka på testämnet eller framkalla toxiska effekter. Nyligen framställda lösningar av testämnet ska användas.
Försöksbetingelser
Tillförselväg
Testämnet ska vanligen endast tillföras en gång. På grundval av toxikologisk information kan upprepad behandling användas. Vanligtvis tillförs testämnet genom oral intubering eller intraperitoneal injicering. Även andra tillförselvägar kan användas
Försöksdjur
Råttor och möss rekommenderas som försöksdjur. Friska könsmogna djur fördelas slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper.
Antal och kön
Ett lämpligt antal handjur bör användas, med hänsyn tagen till den spontana variationen i den biologiska egenskap som utvärderas. Beslutet om hur många djur som ska användas bör grundas på den på förhand fastställda känsligheten för upptäckt och betydelsegrad. Vid ett typiskt försök ska det finnas tillräckligt med handjur för att uppnå 30–50 dräktiga hondjur varje parningsperiod.
Användning a v negativa och positiva kontroller
Normalt görs sidlöpande positiva och negativa (vehikel) kontroller för varje försök. Om det finns godtagbara positiva kontrollresultat från nyligen genomförda försök i samma laboratorium kan dock dessa användas i stället för sidlöpande positiv kontroll. Positiva kontrollämnen används i tillräcklig låga doser (t.ex. MMS i. p., 10 mg/kg) för att visa testens känslighet.
Dosnivåer
Normalt används tre olika dosnivåer. Den högsta dosnivån bör orsaka tecken på toxiska verkningar eller minskad fertilitet hos de exponerade djuren. I vissa fall räcker det med en enda hög dosnivå.
Gränstest
Icke-toxiska ämnen testas vid 5 g/kg i en enda dos eller vid upprepad tillförsel av 1 g/kg/dag.
Förfarande
Flera olika doseringsscheman kan användas. Normalt ges hela dosen på en gång men andra behandlingsscheman kan också användas. Efter behandling paras handjuren med lämpliga intervaller individuellt med 1–2 jungfruliga hondjur. Hondjuren placeras hos handjuren under en period som motsvarar minst en äggcykel, eller tills parning har skett, vilket konstateras genom närvaron av sperma i vaginan eller närvaron av en vaginalpropp. Antal parningar efter behandlingen fastställs på grundval av doseringsschemat och bör säkerställa att alla könscellsstadier är representerade efter doseringen. Hondjuren avlivas under den andra hälften av dräktigheten och innehållet i livmodern undersöks för bestämning av antalet levande och döda implantat. Äggstockarna undersöks för bestämning av antalet corpora lutea.
2. DATA Data ska ställas upp i tabellform och ange antal handjur samt antal dräktiga och icke dräktiga hondjur. Resultaten av varje enskild parning, inbegripet identifiering av varje han- och hondjur, ska anges separat. För varje hondjur anges parningsvecka, handjurets dos och antalet levande och döda implantat. Beräkningen av den totala dominanta letala verkan grundas på jämförelse av antal levande implantat per hondjur hondjur i försöksgruppen och antalet levande implantat per hondjur i kontrollgruppen. Förhållandet mellan döda och levande implantat i försöksgruppen i jämförelse med förhållandet i kontrollgruppen analyseras för bestämning av den letala verkan efter implantation. Om data registreras som tidiga eller sena dödsfall ska detta framgå av tabellerna. Om en utvärdering av den letala verkan sker före implantation ska denna anges. Den letala verkan före implantation kan beräknas som skillnaden mellan antalet corpora lutea och antalet implantater eller som en minskning av det genomsnittliga antalet implantat per livmoder i jämförelse med kontrollparningarna. Utvärderingen av resultat ska grundas på en lämplig statistisk metod.
Djurart, stam, de använda djurens ålder och vikt, antal djur av varje kön i försöks- och kontrollgrupperna.
Testämne, vehikel, testade dosnivåer och motivering för val av doser, negativa och positiva kontroller.
Tillförselväg och dosens varaktighet.
Parningsschema.
Metod för bestämning av om parning skett.
Tidpunkt för avlivning.
Kriterier för registrering av dominanta letala gener.
Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt.
Statistisk utvärdering.
3223 more provisions are not shown here; each has its own address.